Visualisering af bakterielt toksin Inducerede Responses Brug af Live Cell Fluorescence Microscopy

Summary

Fremgangsmåder til oprensning af cholesterol binding toksin streptolysin O fra rekombinant

Abstract

Bakterielle toksiner binder til kolesterol i membraner, der danner porer, som tillader lækage af cellulære indhold og tilstrømning af materialer fra det ydre miljø. Cellen kan enten komme sig efter denne fornærmelse, som kræver aktive membran reparationsprocesser, ellers dør afhængigt af mængden af toksin eksponering og celletype ^1. Endvidere inducerer disse toksiner kraftige inflammatoriske reaktioner i inficerede værter ved aktivering af immunceller, herunder makrofager, som producerer en række pro-inflammatoriske cytokiner ^2. Mange Gram-positive bakterier producerer kolesterol bindende toksiner, der har vist sig at bidrage til deres virulens gennem stort set ukarakteriserede mekanismer.

Morfologiske ændringer i plasmamembranen i celler udsat for disse toksiner indbefatter deres binding til cholesterol-berigede overfladefremspring, som kan udskilles til det ekstracellulære rum, hvilket antyder en indre cellulært forsvarmekanisme ^3,4. Denne proces sker på alle celler i fravær af metabolisk aktivitet, og kan visualiseres ved anvendelse EM efter kemisk fiksering ^4. I immunceller, såsom makrofager, som medierer inflammation som reaktion på toksin eksponering, der induceres membranvesikler foreslået at indeholde cytokiner af IL-1-familien og kan være ansvarlige for både kaste toksin og videregiver disse pro-inflammatoriske cytokiner ^5,6,7. En forbindelse mellem IL-1β frigørelse og en særlig type af celledød, er betegnet pyroptosis blevet foreslået, som begge er caspase-1 afhængige processer ^8. At sortere de mange aspekter af dette makrofag reaktion, som omfatter toxinbinding, kaste af membranvesikler, cytokinfrigivelse og potentielt celledød, har vi udviklet mærkningsteknikker og fluorescensmikroskopi metoder, der giver mulighed for real time visualisering af toksin-celle-interaktioner, herunder målinger af dysfunktion og død (figur 1). Brugaf levende celler er nødvendig på grund af begrænsninger i andre teknikker. Biokemiske indfaldsvinkler kan ikke løse effekter forekommer i individuelle celler, mens flowcytometri ikke tilbyder høj opløsning, real-time visualisering af de enkelte celler. Fremgangsmåderne beskrevet her kan anvendes til kinetisk analyse af responser induceret af andre stimuli medfører komplekse fænotypiske forandringer i cellerne.

Protocol

1. Oprensning af streptolysin O (SLO)

1. Inokulere 20 ml overnatskultur af BL21 GOLD celler indeholdende pBADgIII-SLOhis plasmid ⁹ i 0,5 L LB-bouillon, og der tilsættes 500 pi 50 mg / ml ampicillin. Rystekultur ved 225 rpm ved 37 ° C indtil _OD600 = 0,6, sædvanligvis ~ 1,5 timer. Centrifuger 1 ml bakterier (anset T ₀₎ ved 10.000 xg 5 min, opløses pellet i 140 pi 1x SDS prøvepuffer / 1 OD og soniker at forskyde DNA til protein renhed analyse.
2. Inducere bakterier med tilsætning af 5 ml 20% arabinose til kultur, ryste ved 225 rpm ved stuetemperatur i 3 timer. Indsaml 1 ml bakterier, centrifugeres og opløses i 1 x SDS prøvepuffer som beskrevet ovenfor for _T3 tidspunkt for renhed analyse.
3. Opsaml de resterende bakterier i 500 ml centrifugeflaske, spin 12.000 x g i 12 minutter ved 4 ° C (8500 rpm Sorvall GS-3 rotor). Supernatanten dekanteres fra, lageret pellet ved -80 ° C natten over eller længere om nødvendigt.
4. Resuspender frOzen pellet på is i 10 ml Lyse / vaskebuffer (50 mM NaH _{2 PO4,} 300 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 8,0) suppleret med 400 pi 25% Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml lysozym, 50 pi 200 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Overfør den resuspenderede pellet til 50 ml Oak Ridge rør.
5. Sonikeres lysat 5 gange i 30 sekunder på is med 30 sek intervaller. Spin lydbehandlet lysat i Oak Ridge rør ved 39.000 x g i 20 minutter ved 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor).
6. Mens lysatet spinding, vaskes 1 ml Ni-NTA agarose med 10 ml Lyse / vaskebuffer og centrifugering ved 1200 rpm i 5 min ved 4 ° C. (Alle yderligere vaske / elueringer bruger centrifugering under disse betingelser). Aspirer vask.
7. Tilføj bakteriel supernatant fra trin 1,5 til Ni-NTA agarose, rystes forsigtigt i 2,5 timer ved 4 ° C. Spin for at samle bundfald. Kombiner 30 fil af supernatanten med 10 μ 4x SDS-prøvebuffer og gemme for renhed analyse. Vaskes perlerne 4 gange i Lyse / Vaskebuffer ogce i Tris / salt-puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCI, pH 8,0).
8. Eluere 3 gange ved tilsætning af 1 ml elueringsbuffer (250 mM imidazol i Tris / salt-puffer) og 5 pi 1 M dithiothreitol (DTT) til perler, inkubering på is i 10 minutter, centrifugering og opsamling af supernatanten. SLO er en meget redox-følsomt protein, og opbevares på is hele tiden. Når reduceres, vil proteinet hurtigt taber sin aktivitet, hvis opvarmet til 37 ° C, selv i en kort periode.
9. Vask 500 pi polymixin-konjugeret agarose i elueringsbuffer, centrifugering ved 10.000 x g i 1 min ved 4 ° C og resuspender i 500 pi. At depletere endotoksin, tilsættes 200 ul perler til hvert eluering og rystes 4 ° C i 30 minutter. Spin ved 10.000 x g i 1 min ved 4 ° C, og gem supernatanten. Kombiner 30 pi af hver eluering med 10 pi 4x SDS-prøvebuffer til SDS-PAGE analyse.
10. Test renheden af ​​elueringer ved SDS-PAGE. Kog prøver gemt til gelanalyse ved 95 ° C i 5 minutter og belastning 10 pi af en 10% gel. Stain gel med Coomassie at visualisere protein (figur 2A). SLO er 69 kDa. Udfør en Bradford Assay til bestemmelse proteinkoncentration (typisk udbytte er 4 mg / ml for første to elueringer, men kan variere afhængigt af bakteriestammen og plasmid anvendes).
11. Test hæmolytiske aktivitet af hver eluering (se nedenfor). Pool elueringer hvor renhed, koncentration og hæmolytisk aktivitet er tilfredsstillende. Alikvot SLO i engangsmaterialer portioner (typisk 5-10 ul), fryser på tøris og opbevares ved -80 ° C.

2. Hæmolytisk Assay

1. Vask røde blodlegemer fra får (RBC) i RBC assaypuffer (0,3% bovint serumalbumin (BSA), ₂ mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugering ved 1200 rpm i 5 min, og resuspenderes ved 2,5% RBC'er i 10 ml RBC Assaypuffer.
2. Der tilsættes 10 pi RBC assaybuffer / brønd i 96-brønds V-bundet plade på is. Serielt fortynde hver eluering i to eksemplarer. Typiske fortyndings intervaller er 1:1000 til 1:512,000. Medtag 3 brønde med ingen toksin og 3 brønde med 10gl 2% Triton X-100 ved mindste og største brønde hhv.
3. Dæk pladen og inkuber ved 37 ° C 30 min. Der centrifugeres ved 1.200 rpm i 5 min. Overfør 70 ul supernatant til en fladbundet plade med 96 brønde. Læs A _405. En enhed er den fortynding af toksin kræves til 50% lysis af de røde blodlegemer. Toxin aktivitet er 1 enhed * fortynding factor/0.01 ml.

3. Cell lytisk Assay

1. Harvest celler, tæller, spin. Resuspender på 2x10 ⁶ / ml i puffer F / B (RPMI med ₂ mM CaCl2, 0,5% BSA) og 20 ug / ml propidiumiodid. Tilsættes 100 pi celler til en 96-brønds V-bundplade.
2. Serielt fortyndet SLO til 2x slutkoncentration i puffer R / B, tilsættes 100 pi toxin eller 100 ul puffer F / B til celler. Inkuber 5 min 37 ° C. Typiske slutkoncentrationer området fra 2.000 U / ml til 31,25 U / ml.
3. Kør celler på flowcytometer og indsamle data med filtre til phycoerythrin (PE). Et log shift repræsenterer transient permeabiliseret cells mens en 3 log shift indikerer døde celler ^4. Beregne den specifikke lyse af cellerne ved at fratrække procentdelen af døde celler i kontrollen (% PI ^high _CTL) fra eksperimentelle (% PI ^høj _exp), som følger: specifik lyse = (% PI ^høj _exp -% PI ^high _CTL) / (100 -% PI ^høj _ctl) * 100

4. Mikropipetten Levering af toksin til celler i dyrkningsskåle

1. En dag før forsøget, plade 2x10 ⁵ makrofager på en collagen-coated glas-bottom 35 mm skål.
2. Tænd mikroskop og microinjector. Tillad opvarmet fase tid til at opvarme til 37 ° C. Valget af mikroskop normalt afhænger af, hvad der er til rådighed lokalt. Mikroskopet skal en omvendt fase, en fase stand til at opvarme retterne til 37 ° C, excitation / emission filter terninger passende for det valgte farvestof, og den plads til fysisk at forbinde microinjector. En Bertrand linseer nyttigt for mikroinjektion, men ikke påkrævet. Computeren kører mikroskopet skal nok hukommelse til at indsamle og lagre data.
3. Mærkning af celler i 30 minutter med farvestoffet ved 37 ° C. Afhængigt af assayet, kan mærkning udføres med 5 pi fura2 AM i 1 ml PBS eller 2 pi calcein AM i 1 ml fuldstændige medier. Til fura2 er excitation / emission opsamlet for 340/510 nm og 380/510 nm, og forholdet 340/380 signaler bestemmer calciumflux. For calcein, er excitation / emission 495/515 nm, mens ethidium homodimer er 525/620 nm og APC er 650/660 nm. Andre mærker kan vælges så godt.
4. Vask cellerne med PBS og anbringes i 1 ml RPMI suppleret med 2 _mM CaCl2. Monteres på mikroskop.
5. Fortynd toksin og dextran i vand og centrifugeres ved 20.000 xg 10 min til 4 ° C. Typisk anvendes 1 pi SLO og 4 gl 10 mg / ml dextran-555 fortyndet i 6 pi vand. Dextran eller et andet fluorescerende væske-fase-molekyle anvendes til at verificere, at femto-spidsen ikke er tilstoppet, og injects som ønsket.
6. Indlæs femto-tip bagfra med 0,07 ul fortyndet toksin ved hjælp af en microloader.
7. Indlæs femto-tippen på microinjector. Justere vinklen af ​​injektor, således at spidsen vil sidde over centrum af cellerne med plads til at bevæge sig i alle retninger. Ryd z-grænse. Injection indstillinger skal være injektion i 0,5 sekunder ved 120 psi med 20 psi modtryk. Nedre spids, indtil den kommer ind i mediet.
8. Brug af Bertrand linse, center spidsen og følger spidsen som det sænkes tættere på cellerne. Når du mister fokus, skifte tilbage til normale optik. Nålen skygge bør være indlysende på området. Fokus ovenfor cellerne og sænke nålen, indtil den er i fokus. Fokuserer igen på cellerne og omhyggeligt bringer nålen støder op til en celle. Sæt z-grænsen for injektion. Påbegynde billedbehandling, flytte tip til den ønskede position, injicere at frigive toksin på det ønskede tidspunkt. Hæv nålen, flytte til en ny region af celler og injicere. Flyt nålen til startposition for at forhindre enhver uønskettoksin lækage fra nålen.

Representative Results

Typisk 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO kan opnås med en proteinkoncentration på 4 mg / ml. Mængden af toksin kræves til cellelysis afhænger af celletypen, men er sædvanligvis fra 125 til 500 U / ml SLO (figur 2B). Celletyper som makrofager kan være mere resistente (4000 U / ml) selvom andre (især T-cellelinier) er mere følsomme. Disse følsomheder svarer til kommercielt tilgængelige SLO. Toksinaktivitet falder omtrent 2 gange med hver fryse-tø, så hemolytiske assays med hvert parti eller optøning af toksin er behov for at kontrollere toksinaktivitet. Toxin er også meget følsom over for varme og oxidation ¹⁰ i fravær af cholesterol-holdige membraner skal således udvises forsigtighed, når der arbejdes med proteinet.

Microdelivery af toksinet foretages sammenligning af ubehandlede celler med toxin-behandlede celler i samme skål. Det giver også en intern kontrol til toksin-aktivitet, da en diffusion gradient vil blive etableretetableret fra mikropipettespids. Områder nær mikropipetten viser celledød, kendetegnet ved calcein tab og ethidium-homodimer optagelse, hvorimod regioner længere væk fra spidsen vil vise ingen skade (Figur 3). I betragtning af styrken af den anvendte toksin, kan små mængder, der lækker fra mikropipetten selv i nærvær af modtryk ødelægge celler som spidsen bevæges langs banen (figur 3). Brug af sikkerheden option på microinjector vil undgå dette tab.

Microdelivery af toksinet tillader også undersøgelse af tidstro begivenheder, såsom calcium flux (figur 4). Denne flux kan ikke observeres i fikserede celler, og lokal afgivelse af toksinet tillader undersøgelse af, hvordan denne inducerede calciumflux udbredes gennem en cellekultur. Man skal være forsigtig med ikke at skade cellerne med mikropipette selv, da dette også kan inducere calciumflux ^11.

Desudentil standard bred felt mikroskopi, kan microdelivery kombineres med høj hastighed 3D konfokal mikroskopi. Fordelen ved et konfokalt mikroskop over et bredt område er evnen til at løse begivenheder i z-dimensionen og analysere de enkelte planer. Med de nuværende teknologier er brugen af ​​en roterende skive konfokal nødvendigt for at nå de høje nødvendige hastigheder. Disse fordele tillader visualisering af mikropartikler bliver kastet fra dendritiske celler efter toksin injektion (figur 5). Disse mikropartikler stald som en del af den cellulære reparationsprocessen ^4. Toksinmolekyler er koncentreret om bleb'er, der kaster at eliminere toksin ^4. Uden konfokal billedbehandling, ville afsløre mikropartiklerne være svært, og potentielt føre til den konklusion, at toksin ikke elimineres på denne måde.

Fig. 1. Samletworkflow til at generere og udnytte toksiner i levende celler. Toksin oprenses, underkastes streng kvalitetskontrol, og derefter leveret via mikropipette til celler, som tidligere er mærket med levedygtighed farvestoffer, calcium-indikatorer eller antistoffer mod overfladeproteiner. Data bliver registreret på mikroskopet og derefter analyseret ved hjælp af software, såsom Metamorph eller Elements.

Figur 2. Kvalitetskontrol af renset SLO. (A) Prøver af bakterier før (T ₀₎ og efter _(T3) toksin induktion, supernatant efter oprensning (S), og hver af tre elueringer (E _{1-E 3)} blev opløst ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie blue . (B) enten dendritiske cellelinje D2 eller leukæmicellelinie t27a blev udfordret med forskellige koncentrationer af SLO i 5 minutter ved 37 ° C i nærvær af propidiumiodid ogundersøgt ved flowcytometri. Den specifikke lyse blev bestemt ved den følgende formel: specifik lyse = (% PI ^høj _exp -% PI ^high _CTL) / (100 -% PI ^high _CTL) * 100

Figur 3. Celledød vist ved tab af calcein signal og optagelse af EtBr i fibroblaster fra menneskehud efter lokal eksponering til det bakterielle toksin anthrolysin O. Fibroblaster blev inkuberet med calcein AM og ethidium-homodimer med en levende død kit fra Life Technologies. 100 pg af det cholesterol binding toksin anthrolysin O ¹³ (en gave fra Dr. Richard Rest, Drexel University) blev leveret af mikropipette i midten af dyrkningsskålen, og Widefield fluorescensbilleder opsamlet under anvendelse af et 40x objektiv efter 30 min. Billeder fra flere felter blev kombineret til at generere større billede vises ved hjælp af Metamorf.

Figur 4. Calciumindstrømningen i cytosol af humane dendritiske celler udsat for det bakterielle toksin SLO. Celler blev fyldt med fura2 AM før levering af en opløsning af SLO ved en koncentration på 80 U / ul og en strømningshastighed på 1 nl / min. Spidsen af ​​mikropipette anvendes til afgivelse er vist ved tid 0 af en gul asterisk. Billeder blev opsamlet kontinuerligt i widefield tilstand ved 340 og 380 nm excitationsbølgelængder, og forholdet mellem emissionerne til bestemmelse cytosoliske calcium. Skift fra grøn til blå pseudo indikerer en stigning i cytosoliske calcium. Tiden mærke i hvert panel angiver sekunder efter begyndelsen tilsætning af toksin. Scale bar er 20 um. Klik her for at se større figur .

Figur 5. Frigivelse af mikrovesikler fra overfladen af dendritiske celler som er udsat for SLO. Celler blev præinkuberet med anti-CD11c konjugeret til APC til at mærke plasmamembranen, efterfulgt af levering af en bolus af 3x10 ^-3 U af SLO. 3-D rekonstruktion blev frembragt fra konfokale z-stakke opsamlet på hvert tidspunkt er anført i minutter. Spidsen af ​​microinjector blev identificeret under anvendelse af DIC billeddannelse og er angivet ved den gule pil. Scale bar er 20 pm.

Discussion

Teknikkerne beskrevet her tillader undersøgelse af responser af immunceller til bakterietoksiner. Det mest kritiske trin er at håndtering og dosering af toksinet. Toksinaktivitet kan være yderst variable, selv mellem forskellige portioner af det samme præparat, på grund af dets skrøbelighed. Dette nødvendiggør enten prøvning af hver enkelt portion af toksin mod en reference cellelinje eller røde blodlegemer eller bruger toksin gradienter. Toxin gradienter, som leveret af mikropipette, tillade det fulde spektrum af toksin-inducerede aktiviteter, der skal overholdes i real-time, men egner sig ikke til biokemisk analyse.

Mikropipette levering af toksinet kan være udfordrende. I modsætning standard mikroinjektion, imidlertid er indtrængningen af ​​cellen ikke kræves til dette assay. Faktisk skal man passe på ikke at beskadige cellerne med selve nålen, da dette vil fremkalde en tilsvarende membran reparation respons ^12. I immunceller, især calcium-strømme genereret afnålen kontakt vil udbrede sig via nanorør til andre celler i kulturen ^11. Ikke intravenøse celler vil også forlænge levetiden af ​​nålen. Tilsvarende anvendelse af en Bertrand linse til at følge nålen afstamning til cellerne fjerner en vis usikkerhed i placeringen af ​​mikropipetten. Selv om beskadigede nåle vil lække toksin hurtigere end intakte nåle, kan de stadig anvendes til at generere foreløbige resultater. The microinjector systemet tillader multiple injektioner, bør en højere toksin gradient ønske. Alternativt kan injektionen varighed også modificeres til at ændre den udleverede dosis. Den microinjector også tillader flere eksperimenter, der skal udføres inden for en skål. Endvidere kan virkningen af ​​genbehandling undersøges. Selv om vi beskriver forsøg undersøger immunceller, kan disse metoder tilpasses andre cellelinier også.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.