Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie

Published: October 1, 2012 doi: 10.3791/4227

Summary

Verfahren zur Reinigung des Cholesterins Bindung Toxin Streptolysin O aus rekombinanten

Abstract

Bakterielle Toxine binden an Cholesterin in Membranen, Bildung von Poren, die auf Undichtigkeiten des Zellinhalts und Einströmen von Material von der äußeren Umgebung ermöglichen. Die Zelle kann entweder ins Insult, die Wirkmembran Reparaturprozesse erfordert wiederherzustellen, oder sterben abhängig von der Menge des Toxins Belichtung und ein Zelltyp. Darüber hinaus führen diese Toxine starke entzündliche Reaktionen in infizierten Wirten durch Aktivierung von Immunzellen, einschließlich Makrophagen, die ein Array von pro-inflammatorischen Zytokinen 2 zu erzeugen. Viele Gram-positive Bakterien produzieren Cholesterin bindenden Toxine, die gezeigt haben, um ihre Virulenz durch weitgehend charakterisierten Mechanismen beitragen.

Morphologischen Veränderungen in der Plasmamembran von Zellen, die diese Toxine umfassen ihre Sequestrierung in Cholesterin angereicherten Oberflächenprotrusionen, die in den extrazellulären Raum vergossen werden kann, was auf eine intrinsische zelluläre AbwehrMechanismus 3,4. Dieser Vorgang geschieht für alle Zellen in Abwesenheit einer metabolischen Aktivität und visualisiert werden kann, nachdem mit EM chemischen Fixierung 4. In Immunzellen wie Makrophagen, die Entzündung als Reaktion auf Exposition Toxin vermitteln, induziert werden Membranvesikel vorgeschlagen, Zytokine der IL-1-Familie enthalten und kann sowohl für vergießen Toxin und Weiterleitung dieser proinflammatorischen Zytokine 5,6,7. Eine Verbindung zwischen IL-1β Freisetzung und einer bestimmten Art von Zelltod genannt hat pyroptosis vorgeschlagen worden, da beide Caspase-1-abhängiger Prozesse sind 8. So sortieren Sie die Komplexität dieser Makrophagen Antwort, die Toxinbindung, vergießen Membranvesikel Zytokinfreisetzung und potenziell Zelltod enthält, haben wir die Kennzeichnung Techniken und Fluoreszenzmikroskopie Methoden, die für Echtzeit-Visualisierung von Toxin-Zell-Interaktionen ermöglichen, einschließlich entwickelt Messungen der Dysfunktion und Tod (Abbildung 1). Verwendendes Live Cell Imaging ist notwendig wegen der Beschränkungen in anderen Techniken. Biochemische Ansätze nicht lösen können auftretenden Effekte in einzelnen Zellen, während Durchflusszytometrie nicht bieten hohe Auflösung, Echtzeit-Visualisierung von einzelnen Zellen. Die hier beschriebenen Methoden können zur kinetischen Analyse der Antworten durch andere Reize mit komplexen phänotypischen Veränderungen in Zellen induziert aufgebracht werden.

Protocol

Ein. Reinigung von Streptolysin O (SLO)

  1. Beimpft 20 ml Übernacht-Kultur von BL21 GOLD Zellen mit pBADgIII-SLOhis Plasmid 9 in 0,5 L LB-Brühe und 500 ul 50 mg / ml Ampicillin. Schüttelkultur bei 225 UpM bei 37 ° C bis OD600 = 0,6, in der Regel ~ 1,5 Stunden. Zentrifuge 1 ml Bakterien (als T 0) bei 10.000 xg 5 min auflöst Pellet in 140 ul 1x SDS Probenpuffer / 1 OD und beschallen zu scheren DNA auf Proteinreinheit Analyse.
  2. Bakterien induzieren unter Zusatz von 5 ml 20% Arabinose zu Kultur, bei 225 rpm bei Raumtemperatur für 3 Stunden geschüttelt. Sammeln Sie 1 ml der Bakterien, zentrifugieren und lösen in 1x SDS Probenpuffer wie oben für T 3 Zeitpunkt für Reinheit Analyse.
  3. Sammle verbleibenden Bakterien in 500 ml Zentrifugenflasche, drehen 12.000 xg für 12 min bei 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3-Rotor). Den Überstand umfüllen, speichern Pellet bei -80 ° C über Nacht oder länger, falls erforderlich.
  4. Resuspendieren frozen Pellet auf Eis in 10 ml Lyse / Waschpuffer (50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0) mit 400 ul 25% Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml Lysozym, 50 ergänzt ul 200 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF). Übertragen des resuspendierten Pellets in 50 ml Oak Ridge Röhre.
  5. Beschallen Lysat 5 mal für 30 sec auf Eis mit 30 Sekunden-Intervallen. Spin beschallt Lysat in Oak Ridge Röhrchen bei 39.000 xg für 20 min bei 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34-Rotor).
  6. Während das Lysat dreht, waschen 1 ml Ni-NTA-Agarose mit 10 ml Lyse / Waschpuffer und Spin bei 1.200 UpM für 5 min bei 4 ° C. (Alle weiteren Wäschen / Elutionen verwenden Zentrifugation unter diesen Bedingungen). Absaugen zu waschen.
  7. Fügen bakterielle Überstand aus Schritt 1,5 bis Ni-NTA Agarose, schütteln für 2,5 h bei 4 ° C. Spin zu sammeln Überstand. Kombinieren Sie 30 ul Überstand mit 10 μ 4x SDS-Probenpuffer und sparen für Reinheit Analyse. Waschen Sie die Kugeln 4 Mal in Lyse / Waschpuffer undce in Tris / Salz-Puffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
  8. Eluieren 3 mal durch Zugabe von 1 ml Elutionspuffer (250 mM Imidazol in Tris / Salzpuffer) und 5 ul 1 M Dithiothreit (DTT), um die Kügelchen, Inkubieren auf Eis für 10 min, dreht und Sammeln des Überstands. SLO ist ein sehr Redox-sensitive Protein, und muss auf Eis zu allen Zeiten gehalten werden. Einmal verringert wurde, wird das Protein rasch verlieren, wenn seine Aktivität auf 37 ° C erwärmt, auch nur für kurze Zeit.
  9. Waschen 500 ul Polymixin-konjugierte Agarose in Elutionspuffer, Spin bei 10.000 xg für 1 min bei 4 ° C und resuspendieren in 500 ul. Endotoxin führen, mit 200 ul Perlen jeder Elution und schütteln 4 ° C für 30 min. Spin bei 10.000 xg für 1 min bei 4 ° C, und speichern Sie den Überstand. Kombinieren Sie 30 ul jeder Elution mit 10 ul 4x SDS-Probenpuffer für die SDS-PAGE-Analyse.
  10. Testen der Reinheit Elutionen durch SDS-PAGE. Kochen Sie die Proben für die Gel-Analyse bei 95 ° C gesichert für 5 min und Last 10 ul auf einem 10% Gel. Stain gel mit Coomassie zu visualisieren Proteins (Abbildung 2A). SLO ist 69 kDa. Durchführen einer Bradford Assay zur Proteinkonzentration zu bestimmen (typische Ausbeute beträgt 4 mg / ml für die ersten zwei Elutionen, sondern kann durch Bakterienstamm und Plasmid verwendet variieren).
  11. Testen der hämolytischen Aktivität jedes Elution (siehe unten). Pool Elutionen wo Reinheit, Konzentration und hämolytische Aktivität zufriedenstellend sind. Aliquot SLO in Einweg-Aliquots (typischerweise 5-10 ul) auf Trockeneis und bei -80 ° C einfrieren

2. Hämolytische Assay

  1. Waschen Schaf rote Blutkörperchen (Erythrozyten) in RBC Assay-Puffer (0,3% Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM CaCl 2, 10 mM Hepes, pH 7,4), Spin bei 1.200 UpM für 5 min und resuspendiert in 2,5% in RBCs 10 ml RBC Assay-Puffer.
  2. Fügen Sie 10 ul RBC-Assay-Puffer / Well in 96-Well-V-Bodenplatte auf Eis. Serienmäßig verdünnen jeder Elution in zweifacher Ausfertigung. Typische Bereiche liegen Verdünnung 1:1.000 bis 1:512,000. Inklusive 3 Brunnen ohne Toxin und 3 Brunnen mit 10ul 2% Triton X-100 als minimal und maximal Vertiefungen sind.
  3. Abdeckplatte und bei 37 ° C 30 min. Zentrifuge bei 1.200 rpm für 5 min. Übertragen 70 ul Überstand in einem flachen Boden 96 Well-Platte. Lesen A 405. Eine Einheit ist die Verdünnung des Toxins für 50% Lyse der Erythrozyten benötigt. Toxinaktivität ist 1 Einheit * Verdünnung factor/0.01 ml.

3. Zelle Lytic Assay

  1. Ernten Sie die Zellen, count, Spin. Resuspendieren bei 2x10 6 / ml in Puffer R / B (RPMI mit 2 mM CaCl 2, 0,5% BSA) und 20 ug / ml Propidiumiodid. Je 100 ul Zellen auf eine 96-Well-V-Bodenplatte.
  2. Serienmäßig verdünnen SLO bis zur endgültigen Konzentration im Puffer R / B 2x, mit 100 ul Toxin oder 100 ul Puffer R / B-Zellen. Inkubieren 5 min 37 ° C. Typische Endkonzentrationen Bereich von 2000 U / ml bis 31,25 U / ml.
  3. Führen Zellen auf Durchflusszytometer und sammeln Daten mit Filtern für Phycoerythrin (PE). A one-log Verschiebung stellt transient permeabilisiert cells während eine 3 log Verschiebung zeigt toten Zellen 4. Berechnen Sie die spezifische Lyse der Zellen durch Subtrahieren der Prozentsatz an toten Zellen in der Kontrolle (% PI hohen ctl) von der experimentellen (% PI hohen exp), wie folgt: spezifische Lyse = (% PI hohen exp -% PI hohen ctl) / (100 -% PI hohen ctl) * 100

4. Mikropipette Lieferung von Toxin zu Zellen in Kulturschalen

  1. Einen Tag vor der Experiment Platte 2x10 5 Makrophagen auf einem mit Kollagen beschichteten Glas-Boden 35 mm-Schale.
  2. Schalten Mikroskop und Mikroinjektor. Erlauben Heiztisch Zeit auf 37 ° C erwärmen Die Wahl des Mikroskops in der Regel davon abhängt, was lokal verfügbar ist. Das Mikroskop braucht eine umgekehrte Stufe, eine Stufe der Lage Erhitzen der Speisen bis 37 ° C, Anregungs / Emissions Filterwürfel geeigneter für den Farbstoff gewählt, und der Raum den Anschluss der Mikroinjektorkopfs. A Bertrandlinseist hilfreich für die Mikroinjektion, aber nicht erforderlich. Der Computer Ansteuerung des Mikroskops muss ausreichend Speicher zu sammeln und zu speichern.
  3. Etikett Zellen für 30 min mit Farbstoff bei 37 ° C. Je nach dem Assay kann Markierung mit 5 ul Fura2 Uhr in 1 ml PBS oder 2 ul Calcein AM in 1 ml vollständige Medien erfolgen. Für Fura2 wird Anregung / Emission für 340/510 nm und 380/510 nm gesammelt und das Verhältnis von 340/380 bestimmt, Signale Calciumflusses. Für Calcein ist Anregung / Emission 495/515 nm, während Ethidiumhomodimer ist 525/620 nm und APC ist 650/660 nm. Andere Etiketten können auch gewählt werden.
  4. Waschen der Zellen mit PBS gewaschen und in 1 ml RPMI ergänzt mit 2 mM CaCl 2. Montieren Sie am Mikroskop.
  5. Verdünnte Toxin und Dextran in Wasser und Zentrifuge bei 20.000 × g für 10 min 4 ° C Typischerweise wird 1 ul SLO und 4 ul 10 mg / ml Dextran-555 in 6 ul Wasser verdünnt. Dextran oder andere fluoreszierende Flüssigkeit-Phasen-Molekül wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Femto-Spitze nicht verstopft ist, und injects wie gewünscht.
  6. Legen Femto-Tipp von hinten mit 0,07 ul der verdünnten Toxin mit einem Microloader.
  7. Legen Femto-Spitze auf Mikroinjektor. Stellen Sie den Winkel der Injektor so, dass die Spitze sitzen über der Mitte der Zellen mit Raum in alle Richtungen bewegen. Löschen z-Grenze. Injection-Einstellungen sollten für 0,5 sec werden Injizieren bei 120 psi mit 20 psi Gegendruck. Untere Spitze, bis sie das Medium eintritt.
  8. Verwenden des Bertrand-Linse, in der Mitte die Spitze und folgen der Spitze, wie es näher an den Zellen erniedrigt wird. Sobald Sie den Fokus verlieren, wechseln wieder zur normalen Optiken. Die Nadel Schatten sollte auf dem Gebiet offensichtlich. Konzentrieren Sie sich über den Zellen und Senken der Nadel bis es scharf ist. Der Fokus wieder auf die Zellen und sorgfältig bringen die Nadel benachbart zu einer Zelle. Stellen Sie die z-Limit für die Injektion. Commence Bildgebung, bewegen Spitze in die gewünschte Position, zu injizieren, um bei der gewünschten Toxin Zeitpunkt freizugeben. Heben Sie die Nadel, um eine neue Region von Zellen bewegen und zu injizieren. Nadel zur Ausgangsposition, um unerwünschte zu verhindernToxin Leckage von der Nadel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Typischerweise 10 7 -10 8 U / ml SLO kann mit einer Proteinkonzentration von 4 mg / ml erzielt werden. Die Menge des Toxins zur Zelllyse benötigt je nach Zelltyp, aber üblicherweise 125 bis 500 U / ml SLO (2B). Zelltypen wie Makrophagen widerstandsfähiger (4000 U / ml), obwohl andere (vor allem T-Zelllinien) empfindlicher sind. Diese Sensitivitäten mit handelsüblichen SLO entsprechen. Toxinaktivität abnimmt etwa 2-fach mit jedem Frost-Tau, so hämolytischen Assays mit jeder Charge oder Auftauen von Toxin nötig sind, um Toxinaktivität verifizieren. Toxin ebenfalls sehr empfindlich gegenüber Wärme und Oxidation 10 in Abwesenheit von Cholesterin enthaltenden Membranen müssen also darauf geachtet werden, wenn mit dem Protein ist.

Microdelivery des Toxins ermöglicht den Vergleich von unbehandelten Zellen mit Toxin behandelten Zellen in der gleichen Schale. Es bietet auch eine interne Kontrolle Toxinaktivität, da ein Diffusionsgradienten estab sein wirdetablierten aus der Mikropipette Spitze. Regionen in der Nähe der Mikropipette wird Zelltod zeigen, verkörpert durch Calcein Verlust und Ethidium-Homodimer-Aufnahme, wohingegen Regionen weiter weg von der Spitze keine Schädigung (Abbildung 3) zeigen. Angesichts der Wirksamkeit des Toxins verwendet wird, können geringe Mengen, die von der Mikropipette auch in Gegenwart von Gegendruck austreten zerstören Zellen als die Spitze entlang des Feldes (Abbildung 3) bewegt wird. Mit dem Sicherheits-Option auf der Mikroinjektor wird vermieden, diesen Verlust.

Microdelivery des Toxins ermöglicht auch die Prüfung von Echtzeit-Ereignissen, wie Calcium-Fluss (Abbildung 4). Dieses Flußmittel kann in fixierten Zellen beobachtet werden, und die lokale Verabreichung des Toxins erlaubt die Untersuchung, wie diese induzierte Calcium-Fluss durch eine Zellkultur vermehrt. Vorsicht ist geboten, um die Zellen mit der Mikropipette selbst zu verletzen, da dies auch veranlassen können Calciumflusses 11.

AußerdemStandard-Weitfeldmikroskopie können microdelivery mit Hochgeschwindigkeits-3D-konfokale Mikroskopie kombiniert werden. Der Vorteil eines konfokalen Mikroskops über weite Bereich ist die Fähigkeit, Ereignisse in der z-Dimension zu lösen und zu analysieren einzelnen Ebenen. Mit derzeitigen Technologien ist die Verwendung eines konfokalen Rotationsscheibe nötig, die hohe Geschwindigkeiten erforderlich erreichen. Diese Vorteile ermöglichen die Visualisierung von Mikropartikeln aus dendritischen Zellen nach Toxin-Injektion (Abb. 5) zu vergießen. Diese Mikropartikel werden als Teil der zellulären Reparatur 4 vergießen. Toxin-Moleküle auf Blasen, die vergossen, um Toxin 4 zu beseitigen konzentriert sind. Ohne konfokale Abbildung, würde Erfassen der Mikropartikel schwierig sein und möglicherweise zu dem Ergebnis, dass kein Toxin wird auf diese Weise eliminiert führen.

Abbildung 1
Abbildung 1. InsgesamtWorkflow zur Erzeugung und Nutzung von Toxinen im Live Cell Imaging. Toxin wird gereinigt, einer strengen Qualitätskontrolle, und dann über Mikropipette, um Zellen, die zuvor mit der Lebensfähigkeit Farbstoffe, Kalzium-Indikatoren oder Antikörper gegen Oberflächenproteine ​​beschriftet geliefert. Daten werden auf dem Mikroskop erfasst und anschließend analysiert unter Verwendung von Software, wie Metamorph oder Elemente.

Abbildung 2
Abbildung 2. Qualitätskontrolle von gereinigtem SLO. (A) Die Proben von Bakterien vor (T 0) und nach (T 3) Toxins Induktion, Überstand nach Aufreinigung (S) und jeder von drei Elutionen (E 1-E 3) wurden durch SDS-PAGE und Färbung mit Coomassie-Blau gelöst . (B) entweder dendritische Zelllinie D2 oder Leukämie-Zelllinie T27A wurden mit verschiedenen Konzentrationen von SLO für 5 min bei 37 ° C in Gegenwart von Propidiumiodid herausgefordert unduntersucht mittels Durchflusszytometrie. - / (100 -% PI hohen ctl) * 100 spezifische Lyse = (% PI hohen ctl% PI hohen exp): Die spezifische Lyse wurde durch die folgende Formel bestimmt

Abbildung 3
Abbildung 3. Zelltod durch Verlust von Calcein Signal und Aufnahme von EtBr in menschlichen Hautfibroblasten nach lokalisierte Exposition gegenüber den bakteriellen Toxins anthrolysin O. Fibroblasten dargestellt wurden mit Calcein AM und Ethidium-Homodimer inkubiert mit einem Lebendimpfstoff Dead-Kit von Life Technologies. 100 pg des Cholesterins verbindliche Toxin anthrolysin O 13 (ein Geschenk von Dr. Richard Rest, Drexel University) wurde von Mikropipette in das Zentrum der Kulturschale geliefert und Weitfeld-Fluoreszenz Bilder gesammelt mit einem 40x-Objektiv nach 30 min. Bilder aus den verschiedenen Bereichen wurden kombiniert, um das größere Bild zu sehen mit Met erzeugenamorph.

Abbildung 4
Abbildung 4. Calcium-Einstrom in Cytosol von humanen dendritischen Zellen, die das bakterielle Toxin SLO. Zellen wurden mit Fura2 AM beladen vor Abgabe einer Lösung von SLO in einer Konzentration von 80 U / ul und einer Fließgeschwindigkeit von 1 nl / min. Die Spitze der Mikropipette Lieferung benutzt wird zum Zeitpunkt 0 durch eine gelbe Sternchen gekennzeichnet. Bilder wurden kontinuierlich in Weitfeld-Modus bei 340 und 380 nm Anregungswellenlänge gesammelt, und das Verhältnis der Emissionen verwendet, um cytosolische Calcium-Spiegel zu bestimmen. Wechsel von grün zu blau Falschfarbe weist auf einen Anstieg der zytosolischen Kalzium. Die Zeitmarke in jedem Panel zeigt Sekunden nach Beginn Zugabe von Toxin. Maßstab ist 20 um. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .


Abbildung 5. Veröffentlichung Mikrovesikel von der Oberfläche der dendritischen Zellen, die SLO. Zellen wurden mit Anti-CD11c konjugiert APC an die Plasmamembran, durch Übergabe eines Bolus von 3x10 -3 U gefolgt von SLO beschriften vorinkubiert. 3-D-Rekonstruktion wurden aus konfokalen Z-Stapel zu jedem Zeitpunkt in Minuten angegeben gesammelt erzeugt. Die Spitze des Mikroinjektorkopfs wurde identifiziert unter Verwendung von DIC Bildgebung und wird durch die gelbe Pfeil angedeutet. Maßstab ist 20 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die Untersuchung der Reaktionen von Immunzellen, um bakterielle Toxine. Der wichtigste Schritt ist die Handhabung und Dosierung des Toxins. Toxinaktivität kann äußerst variabel, sogar zwischen verschiedenen Aliquots derselben Zubereitung, aufgrund ihrer Zerbrechlichkeit. Dies erfordert entweder eine Prüfung jedes einzelnen Aliquot des Toxins gegen eine Referenz Zelllinie oder RBCs oder mit Toxin Steigungen. Toxin Gradienten, wie Mikropipette geliefert, damit das gesamte Spektrum der Toxin-induzierte Aktivitäten in Echtzeit beobachtet werden, sondern eignet sich nicht zur biochemischen Analyse.

Mikropipette Lieferung des Toxins kann eine Herausforderung sein. Im Gegensatz zu herkömmlichen Mikroinjektion wird jedoch das Eindringen der Zelle nicht für diesen Assay benötigt. Tatsächlich muss darauf geachtet werden, um die Zellen mit der Nadel selbst beschädigen, da dies eine ähnliche Membran Reparaturreaktion 12 hervorrufen werden. In Immunzellen, insbesondere die Calcium-Flüsse, die durch erzeugtenNadel Kontakt wird über Nanoröhren auf andere Zellen in der Kultur 11 ausbreiten. Nicht Injektion von Zellen wird auch verlängern die Lebensdauer der Nadel. Ebenso löscht die Verwendung eines Bertrandlinse zum Abstieg der Nadel an die Zellen folgen gewisse Unsicherheit bei der Positionierung der Mikropipette. Obwohl beschädigten Nadeln Toxin schneller auslaufen als intakte Nadeln, können sie immer noch verwendet werden, um vorläufige Ergebnisse zu generieren. Die Mikroinjektorkopfs System ermöglicht mehrere Injektionen, sollte eine höhere Toxin Gradienten wünschen übrig. Alternativ kann Einspritzdauer ebenfalls modifiziert, um die zugeführte Dosis zu verändern. Die Mikroinjektor können auch mehrere Experimente in einem Gericht durchgeführt werden. Weiterhin kann die Wirkung des Reprovokation studiert werden. Obwohl wir Experimenten, die Immunzellen zu beschreiben, könnten diese Methoden an andere Zelllinien geeignet als gut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Richard Ruhe für die großzügige Schenkung von anthrolysin O, Michael Caparon für das großzügige Geschenk der SLO Plasmid und Jonathon Franks für die technische Unterstützung bedanken. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse T32CA82084 (PAK) und R01AI072083 (RDS) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
polymixin-agarose Sigma P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col Fisher PI-89891
sheep RBCs Fisher 50-415-688
pBADgIII-SLO N/A N/A see ref9
Cy5 monoreactive dye GE Healthcare PA25001
Fura2-AM Life Technologies F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer Life Technologies L3224
Anti-CD11c-APC BD Biosciences 550261
collagen-coated glass-bottom dish Mattek P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II Fisher E5242957000
Microloader Fisher E5242956003
dextran Alexa 555 Life Technologies D34679
Injectman NI 2 Eppendorf 920000029
FemtoJet Eppendorf 5247 000.013

Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.

Buffer Composition Step Used
Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
10 mM imidazole, pH 8.0
1.4
Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0
300 mM NaCl
1.7
Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0
300 mM NaCl
250 mM imidazole
1.8
RBC Assay buffer 0.3% BSA
2 mM CaCl2
10 mM HEPES, pH 7.4
2.1
buffer R/B RPMI cell culture medium
2 mM CaCl2
0.5% BSA
3.1

Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
  2. Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).
  3. Scolding, N. J. Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement. Nature. 339, 620-622 (1989).
  4. Keyel, P. A. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).
  5. MacKenzie, A. Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding. Immunity. 15, 825-835 (2001).
  6. Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).
  7. Andrei, C. Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).
  8. Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).
  9. Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).
  10. Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity. Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).
  11. Watkins, S. C., Salter, R. D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules. Immunity. 23, 309-318 (2005).
  12. McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).
  13. Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).

Tags

Immunologie Zellbiologie Physiologie Streptolysin O porenbildende Toxin Cholesterin-abhängige Cytolysin Live Cell Imaging Fluoreszenzmikroskopie
Visualisierung der bakteriellen Toxin induzierten Reaktionen mit Live Cell Fluoreszenzmikroskopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins,More

Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (68), e4227, doi:10.3791/4227 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter