Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Summary

Rekombinant gelen kolesterol bağlayıcı toksin Streptolizin O arındırıcı Yöntemleri

Abstract

Bakteriyel toksinler hücresel içeriği ve dış ortamdan malzemelerin akını sızıntı izin gözenekleri oluşturan, zarlarında kolesterol bağlamak. Hücre ya aktif zarı tamir işlemleri gerektiren bu hakaret, kurtarmak, ya da başka bir toksine maruz kalma ve hücre tip ¹ miktarına bağlı olarak ölebilir. Buna ek olarak, bu toksinlerin pro-inflamatuvar sitokinlerin ² bir dizi üretmek makrofajlar dahil immün hücrelerin aktivasyonu yoluyla enfekte barındıran güçlü inflamatuar yanıtı indükler. Pek çok Gram pozitif bakteriler, büyük ölçüde karakterize olmamış mekanizmalar yoluyla virülans katkı gösterilmiştir kolesterol bağlayıcı toksinler üretirler.

Bu toksinlere maruz hücrelerin plazma membranında Morfolojik değişiklikler intrinsik hücresel savunma düşündüren, ekstrasellüler boşluğa döken olabilir kolesterol bakımından zengin yüzey çıkıntıları, onların haciz dahilmekanizması ^3,4. Bu işlem, metabolik etkinlik yokluğunda tüm hücrelerde meydana gelir, ve kimyasal tespit sonra ⁴ EM kullanılarak görüntülenebilir. Böyle toksine maruz kalma yanıt olarak inflamasyon aracılık makrofaj gibi immün hücrelerde indüklenen membran veziküller IL-1 ailesi sitokinler içermesi önerilmektedir ve toksin atma ve bu pro-inflamatuar sitokinler ^5,6,7 yaymak için hem de sorumlu olabilir. Hem ⁸ kaspaz-1 bağımlı süreçlerin gibi IL-1β salınımı ve hücre ölümü belirli bir türü arasında bir bağlantı, adlandırdığı pyroptosis ileri sürülmüştür. Membran vezikül toksin bağlayıcı, dökülme, sitokin salınımı, ve potansiyel olarak hücre ölümü içeren bu makrofaj yanıtı, karmaşıklığı çözmek için, biz de dahil olmak üzere, toksin-hücre etkileşimleri gerçek zamanlı görselleştirme için izin etiketleme teknikleri ve floresans mikroskobu yöntemleri geliştirmişlerdir fonksiyon bozukluğu ve ölüm ölçümleri (Şekil 1). Kullanmakcanlı hücre görüntüleme diğer teknikleri sınırlamaları nedeniyle gereklidir. Flow sitometri bireysel hücrelerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görselleştirme sunmaz ise Biyokimyasal yaklaşımlar, bireysel hücrelerin meydana etkilerini çözemez. Burada açıklanan yöntemlerle hücrelerde kompleks fenotip değişiklikleri içeren başka bir uyarıya bağlı yanıt kinetik analizi için uygulanabilir.

Protocol

1. Streptolizin O Saflaştırılması (SLO)

1. 0.5 L LB et suyu içine plazmid pBADgIII-SLOhis ⁹ içeren BL21 GOLD hücre, 20 ml gecelik kültürü aşılamak ve 500 ul 50 mg / ml ampisilin ilave edin. 37 ° C'de 225 rpm'de kültür çalkalanır OD ₆₀₀ kadar = 0.6, genelde 1.5 saat ~. 10,000 5 dk xg az 1 ml bakteri (T ₀ kabul) santrifüjleyin, 140 ul 1x SDS numune tamponu / 1 OD pelet çözülür ve protein saflık analizi için kesme DNA sonikasyon.
2. Kültür için 5 ml% 20 arabinoz ilavesi ile bakterilerin neden, 3 saat boyunca oda sıcaklığında 225 rpm de çalkalanır. , Bakteri 1 ml santrifüj toplayın ve yukarıda belirtildiği gibi saflık analizi için T ₃ bir zaman noktası için 1 x SDS numune tamponu içinde çözülür.
3. 500 ml santrifüj Şişede kalan bakteriler toplayın, 4 ° C (8,500 rpm Sorvall GS-3 rotor) az 12 dakika boyunca 12.000 xg'de döndürün. -80 Süpernatant, mağaza pelet Durusu gerekirse uzun ° C gecede ya.
4. Fr süspanse10 ml buz üzerinde ozen topak parçalayıcı / yıkama tampon (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, pH 8.0) 400 ul% 25 oranında Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml lizozim, 50 ile desteklenmiş ul 200 mM phenylmethylsulfonyl florid (PMSF). 50 ml Oak Ridge tüp yeniden süspanse pelet aktarın.
5. 30 sn aralıklarla buz üzerinde 30 saniye boyunca 5 kez lizat sonikasyon. Spin 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor) az 20 dakika boyunca 39.000 xg'de oak ridge tüp lizat sonicated.
6. Lizat iplik iken, Lyse / 4 az 5 dakika boyunca 1.200 rpm'de tampon ve santrifüj yıkayın ° 10 ml 1 ml Ni-NTA agaroz yıkayın C. (Tüm diğer yıkar / elutions bu koşullarda santrifüj kullanın). Yıkayın aspire.
7. Adım 1.5 Ni-NTA agaroz bakteriyel süpernatant ekleyin, 4 az 2,5 saat süreyle hafifçe sallayın ° C. Süpernatant toplamak için Spin. 10 μ 4x SDS numune tamponu ile süpernatant 30 ul birleştirin ve saflık analizi için kaydedin. Tampon Lyse / yıkayın ve üzerine boncuk 4 kez yıkayınTris / tuz tamponu (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8.0) içinde CE.
8. , Boncuklar ile Elüsyon, 1 ml tampon maddesi (Tris / tuz tamponu içinde 250 mM imidazol) ve 5 ul 1 M ditiotreitol (DTT) ilave 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya, eğirme ve üstte kalan sıvı toplama ile 3 kez Zehir. SLO bir çok redoks-duyarlı bir protein olup, her zaman buz üzerinde tutulmalıdır. Bile kısa bir süre için, 37 ° C sıcaklığa getirilmiş ise bir kez azalır, protein hızla aktivitesi kaybedecektir.
9. 4 az 1 dakika boyunca 10.000 xg'de elüsyon tampon, spin 500 ul polimiksin-konjuge agaroz yıkayın 500 ul ° C ve tekrar süspansiyon. Endotoksin tüketmek için, her bir yıkama için 200 ul boncuk ekleyin ve 30 dakika süre ile 4 ° C'de çalkalanır. 1 4 dk ° C arasında ve süpernatan kaydetmek için 10,000 x g'de Spin. SDS-PAGE analizi için 10 ul 4x SDS numune tamponu ile elüsyon her biri 30 ul birleştirin.
10. SDS-PAGE ile elutions saflığını test edin. Kaynama örnekleri,% 10 jel üzerinde 5 dakika ve yük 10 ul 95 ° C 'de jel analizi için kaydedilir. Ge LekeProtein görselleştirmek Coomassie ile l (Şekil 2A). SLO 69 kDa olduğunu. (Tipik verim 4 mg / ilk iki elutions için ml, ancak bakterinin ve plazmid kullanılan göre değişebilir) protein konsantrasyonu belirlemek için Bradford Testi gerçekleştirin.
11. Her elüsyonunun hemolitik aktivite (bkz. aşağıda) sınayın. Saflığı, konsantrasyon ve hemolitik aktivite tatmin edici Havuzu elutions. Tek kullanımlık alikotları (tipik olarak 5-10 ul) tablet SLO, -80 kuru buz ve mağaza ° C üzerinde dondurmak

2. Hemolitik Assay

1. RBC deney tamponu (% 0.3 bovin serum albümini (BSA), ₂ mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7.4), 5 dakika boyunca 1,200 rpm'de döndürme içinde koyun kırmızı kan hücrelerinin (eritrositler) yıkayın ve% 2.5 eritrositlerde de içinde tekrar süspansiyon 10 ml RBC Testi tampon.
2. / Kuyu buz üzerinde 96 oyuklu V-alt plaka 10 ul tahlil tamponu RBC ekleyin. Seri çoğaltmak her elüsyon seyreltin. Tipik seyreltme aralığı 1:1,000 ile 1:512,000 vardır. 10 ile hiçbir toksin ile 3 kuyu ve 3 kuyu dahilul% 2 Triton sırasıyla minimum ve maksimum kuyu olarak X-100,.
3. 37 plaka ve inkübe Kapak ° C 30 dk. 5 dakika boyunca 1.200 rpm'de santrifüj. Düz dipli 96 plaka süpernatant 70 ul aktarın. A ₄₀₅ okuyun. Bir birim, eritrositlerde% 50 lizis için gereken toksin seyreltilmesidir. Toksin aktivitesi 1 birim * dilüsyon factor/0.01 ml'dir.

3. Hücre Parçalayıcı Assay

1. Hasat hücreleri, sayım, spin. 2x10 'de yeniden süspanse edin tampon içinde ⁶ / ml R / B (2 mM _CaCl2 içeren RPMI,% 0.5 BSA) ve 20 ug / ml propidium iodide. Bir 96-V-alt plaka 100 ul hücre ekleyin.
2. Seri hücrelerine 100 ul toksin veya 100 ul tampon R / B ekleyebilir, tampon R / B nihai konsantrasyonu 2x SLO sulandırmak. Inkübe 5 dakika 37 ° C U / ml olarak 2,000 ila 31.25 U / ml 'ye Tipik nihai konsantrasyonlar aralığı.
3. Akış sitometresinde çalıştırın ve fikoeritrin (PE) için filtreler ile veri toplamak. Bir tek günlük vardiya geçici permeabilize cel temsills 3 günlük vardiya ölü hücreleri ^4. gösterir iken. Aşağıdaki gibi, deneysel (% PI ^yüksek _exp) den kontrol ölü hücrelerin yüzdesi (% PI ^yüksek _ctl) çıkarılarak hücrelerin belirli lizis hesaplayın: Belirli lizis = (% PI ^yüksek _exp -% PI ^yüksek _ctl) / (100 -% PI ^yüksek _ctl) * 100

4. Kültür Yemekleri Hücreler Toksin Teslim mikropipet

1. Bir kollajen kaplı cam alt 35 mm çanak deneyde, plaka 2x10 ⁵ makrofajlar öncesinde bir gün.
2. Mikroskop ve mikroenjektör açın. Isıtılmış sahnede zaman 37 ° C'ye kadar ısınmasını bekleyin Mikroskop seçim genellikle mevcut yerel ne bağlıdır. Mikroskop için 37 yemekler arasında bir ısıtma aşaması yeteneğine sahip bir ters evre ihtiyacı ° C, seçilmiş boya, ve fiziksel olarak mikroenjektör bağlamak için alan için uygun bir uyarılma / emisyon filtre küp. Bir Bertrand objektifmikroenjeksiyon için yararlı, ancak gerekli değildir. Mikroskop sürüş bilgisayar veri toplamak ve depolamak için yeterli bellek gerekiyor.
3. 37 boya ile 30 dakika için etiket hücreleri ° C. Tahlil bağlı olarak, etiketleme 5 ul Fura2 1 ml tam ortam içinde PM 1 ml PBS veya 2 ul içinde kalsein AM ile yapılabilir. Fura2 için, uyarılma / emisyon 340/510 nm ve 380/510 nm'de için toplanmış, ve 340/380 sinyal oranının kalsiyum akısı belirler. Etidyum homodimer 525/620 nm ve APC 650/660 nm iken kalsein için, uyarma / emisyonu 495/515 nm. Diğer etiketler de seçilebilir.
4. 1 ml RPMI PBS ve yer ile hücreleri yıkayın ₂ mM CaCl2 ile desteklenmiş. Mikroskop üzerine monte edin.
5. 4 ° C için 20,000 xg 10 dak toksin ve dekstran su ve santrifüj sulandırınız Tipik olarak, 1 ul SLO ve 4 ul 10 mg / ml dekstran-555 6 ul su içinde seyreltilir. Dekstran veya başka bir floresan sıvı faz molekülü Femto-ucu tıkalı olmadığını doğrulamak için kullanılan ve inje edilircts istediğiniz gibi.
6. Bir Microloader kullanarak seyreltilmiş toksin 0.07 ul arkadan Femto-ucu yerleştirin.
7. Mikroenjektör üzerine Femto-ucu yerleştirin. Uç tüm yönlerde hareket için oda hücreleri üzerinde merkezi olarak oturacak şekilde enjektör açısı ayarlayın. Z limiti temizleyin. Enjeksiyon ayarları 20 psi arka basıncı 120 psi az 0,5 sn enjekte edilmelidir. Bu orta girene kadar bahşiş indirin.
8. Bertrand lens merkezi ucu kullanma ve yakın hücreleri indirilir gibi ucu izleyin. Sonra odak kaybetmek normal optik geri dönün. Iğne gölge alanına anlaşılması gerekir. Yukarıda hücreler Odak ve odak kadar iğne indirin. Hücrelerin tekrar odaklanın ve dikkatli bir hücre bitişik iğne getir. Enjeksiyon için z limiti ayarlayın. İstediğiniz pozisyona ucu hareket görüntüleme başlasın, istenilen zaman noktasında toksin serbest bırakmak enjekte. Iğne kaldırın, hücreler yeni bir bölgeye taşımak ve enjekte. Istenmeyen önlemek için ev konumuna iğne Taşıiğne toksin kaçağı.

Representative Results

Tipik olarak 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO 4 mg / ml 'lik bir protein konsantrasyonuna ile elde edilebilir. Hücre parçalama için gerekli toksin miktarı hücre türüne göre değişir, ancak genellikle 125-500 U / ml SLO (Şekil 2B) olduğunu. Diğerleri (özellikle T hücre hatları) daha duyarlı olsa makrofajlar gibi Hücre tipleri (4000 U / ml) daha dirençli olabilir. Bu duyarlılık, ticari olarak temin SLO karşılık gelir. Toksin aktivitesi toksin her parti veya çözülme ile çok hemolitik deneyleri Toksin aktivitesi doğrulamak için gerekli olan, yaklaşık 2 kat, her donma-çözülme ile azalır. Protein ile çalışırken Toksin da kolesterol içeren membranlar yokluğunda ısı ve oksidasyon ¹⁰ derece duyarlı olan, yani dikkat edilmelidir.

Toksin Mikroteslim aynı yemeğin toksin-işlenmiş hücreleri ile tedavi edilmemiş hücrelerin karşılaştırılması sağlar. Bir difüzyon gradyan estab olacağı Aynı zamanda, toksin aktivitesi için bir iç kontrol sağlarmikropipet ucundan yayımlanır. Daha uzakta ucundan bölgelerde herhangi bir hasar (Şekil 3) gösterecektir ise yakın mikropipet için bölgeler hücre ölümü gösterecektir, kalsein kaybı ve etidyum homodimer alımını tiplemesindeki. Uç alan (Şekil 3) boyunca hareket ettirildiğinde, kullanılan toksin potens göz önüne alındığında bile, geri basınç varlığında mikropipet sızabilir küçük miktarlarda hücreleri yok eder. Mikroenjektör üzerindeki güvenlik seçeneğini kullanarak bu kaybı önlemek olacaktır.

Toksin Mikroteslim ayrıca kalsiyum akı gibi gerçek zamanlı olaylar, (Şekil 4) sınav veriyor. Bu akı sabit hücreler gözlendi ve toksin lokalize teslimatı bu indüklenmiş kalsiyum akı bir hücre kültürü yoluyla yayılır nasıl çalışma izin olamaz. Bu aynı zamanda kalsiyum akısının ¹¹ neden olabilir gibi Bakımı, mikropipet kendisi ile hücreleri kesmemeye dikkat edilmelidir.

Buna ek olarakstandart geniş alan mikroskopisi, Mikroteslim yüksek hızlı 3D konfokal mikroskopi ile kombine edilebilir. Geniş alan üzerinde konfokal mikroskop avantajı z boyutu olayları çözmek ve bireysel düzlemde analiz yeteneğidir. Mevcut teknolojiler ile, dönen bir disk konfokal kullanılması gerekli yüksek hızları elde etmek için gereklidir. Bu avantajlar toksini enjeksiyonu (Şekil 5) Aşağıdaki dendritik hücreler dökülüyor mikropartiküllerin görselleştirme izin. Bu mikro-hücresel onarma işlemi ^4'ün bir parçası olarak dökülür. Toksin molekülleri toksin ⁴ ortadan kaldırmak için döken blebleri üzerinde yoğunlaşmıştır. Konfokal görüntüleme olmadan, mikropartiküller tespit zor ve potansiyel olarak toksin bu şekilde elimine olmadığını sonuca yol açacaktır.

Şekil 1. Genel olarakcanlı hücre görüntüleme toksinleri üreten ve kullanan için iş akışı. Toksin titiz kalite kontrolüne tabi, saflaştırılmış ve daha önce yüzey proteinlerine canlılığı boyalar, kalsiyum göstergeleri veya antikorlar ile etiketlenmiş hücreler mikropipet aracılığıyla teslim edilir. Veri mikroskop satın aldı ve daha sonra bu Metamorph veya Elements gibi, programı kullanılarak analiz edilmektedir.

Şekil 2. Saflaştırılmış SLO kalite kontrolü. (A) bakteri örnekleri önce (T ₀₎ ve sonra (T ₃₎ toksin indüksiyon, süpernatant aşağıdaki saflaştırma (G), ve üç elutions (E _{1-E 3)} her Coomassie mavisi ile SDS-PAGE ve lekeli tarafından çözüldü . (B) ya dendritik hücre hattı D2 veya lösemi hücre hattı T27A propidyum iyodür varlığında, 37 ° C de 5 dakika SLO çeşitli konsantrasyonları ile meydan edildi veflow sitometri ile incelendi. - / (100 -% PI ^yüksek _CTL) * 100 spesifik parçalanma = (% PI ^yüksek _CTL% PI ^yüksek _exp): spesifik lizizi, aşağıdaki formüle göre belirlendi

Şekil 3. Kalsein sinyali ve bakteriyel toksin anthrolysin O. Fibroblastlar lokalize maruz kaldıktan sonra insan dermal fibroblast içinde EtBr alındıktan kaybı ile gösterilen Hücre ölümü Life Teknolojileri canlı bir ölü kiti kullanarak kalsein AM ve etidyum homodimer ile inkübe edildi. Kolesterol bağlayıcı toksin anthrolysin O ¹³ (Dr Richard istirahat, Drexel Üniversitesi tarafından hediye) 100 pg kültür çanak merkezi haline mikropipet tarafından teslim ve Widefield floresans görüntüleri 30 dakika sonra bir 40x objektif kullanılarak toplanmıştır. Birden çok alandan alınan Görüntüleri Met kullanarak gösterilen büyük resim oluşturmak için birleştirilmiştiramorf.

Şekil 4. Bakteriyel toksinin SLO maruz kalan insan dendritik hücrelerin sitozolüne Kalsiyum akını. Hücreler AM fura2 ile yüklenmiş 80 U / ml 'den ve 1 nl / dak' lık bir akış hızı bir konsantrasyonda SLO bir solüsyonu teslim edilmeden önce. Teslimat için kullanılan mikropipet ucu sarı yıldızla 0 zamanında gösterilir. Görüntü 340 ve 380 nm eksitasyon dalga boyu Geniş açılı, modunda sürekli olarak toplandı ve sitozolik kalsiyum seviyelerini belirlemek için kullanılan emisyon oranını edildi. Yeşil mavi yalancı için Shift sitozolik kalsiyum düzeylerinde artış gösterir. Her panelde zaman işareti toksin yanı başında saniye sonra gösterir. Ölçek çubuğu 20 mikron. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 5,. SLO maruz dendritik hücrelerin yüzeyinden microvesicles serbest kalır. Hücreler SLO 3x10 ^-3 U bolus teslim takiben plazma membranı, etiketlemek için APC anti-CD11c konjuge ile önceden inkübe edildi. 3-D rekonstrüksiyonların dakika içinde belirtilen her bir zaman noktasında toplanan konfokal z-yığınlarının elde edildi. Mikroenjektör ucu DIC görüntüleme kullanılarak tespit edildi ve sarı okla gösterilir. Ölçek çubuğu 20 mikron.

Discussion

Teknikleri bakteriyel toksinler bağışıklık hücrelerinin yanıtların incelenmesine olanak burada açıklanan. En kritik adım toksin kullanım ve dozaj olduğunu. Toksin aktivitesi hatta kırılganlık dolayı aynı hazırlanması farklı alikotları arasında, son derece değişken olabilir. Bu ya bir referans hücre hattı veya RBCs karşı toksin her kısım test veya toksin gradyanlar kullanarak gerektirir. Toksin gradyanlar gibi mikropipet tarafından teslim, gerçek zamanlı olarak uyulması gereken toksin kaynaklı faaliyetlerin tam spektrum sağlar, ancak biyokimyasal analiz kendisine ödünç vermez.

Toksin Mikropipet teslimat zor olabilir. Standart mikroenjeksiyon aksine, hücre penetrasyonu bu tahlil için gerekli değildir. Aslında, bu bakım benzer bir membran onarım yanıt ortaya çıkarmak ¹² gibi, iğne kendisi ile hücrelere zarar vermemeye dikkat edilmelidir. Bağışıklık hücreleri, özellikle, kalsiyum akısı ile oluşturulaniğne iletişim kültürü ¹¹ içindeki diğer hücrelere nanotüpler yoluyla yaymak olacaktır. Enjekte etmeyen hücreler de iğne ömrünü uzatacaktır. Benzer şekilde, hücreleri en iğne iniş izlemek için bir Bertrand lens kullanımı mikropipet konumlandırma bir belirsizlik kaldırır. Hasarlı iğneleri sağlam iğneler daha hızlı toksin sızacaktır rağmen, hala ilk sonuçlar üretmek için kullanılabilir. Mikroenjektör sistemi birden fazla enjeksiyon için, daha yüksek bir toksin gradyanı istenen olmalıdır izin verir. Alternatif olarak, enjeksiyon süresi de verilen doz ayarlaması için modifiye edilebilir. Mikroenjektör aynı zamanda birden fazla deneyler bir tabak içinde yapılması için izin verir. Ayrıca, yeniden verilmesinin etkisi araştırılabilir. Bu bağışıklık hücreleri inceleyen deneyler tarif olmasına rağmen, bu yöntem aynı zamanda diğer hücre çizgileri için adapte edilebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.