Summary
La biosynthèse de la matrice extracellulaire du cartilage par les chondrocytes peuvent être affectés par l'application de stimuli mécaniques. Cette méthode décrit la technique d'application dynamiques contraintes de compression de chondrocytes encapsulés dans des constructions 3D et l'évaluation des changements induits dans le métabolisme des chondrocytes.
Abstract
Le cartilage articulaire souffre d'une capacité limitée de réparation lorsqu'il a été endommagé par l'insulte mécanique ou dégradés par la maladie, comme l'arthrose. Pour remédier à cette lacune, plusieurs interventions médicales ont été développées. Une de ces méthodes consiste à resurfacer la zone endommagée avec génie tissulaire du cartilage, mais l'ingénierie tissulaire n'a généralement les propriétés biochimiques et la durabilité du cartilage natif, remettant en question sa survie à long terme. Cela limite l'application de l'ingénierie tissulaire du cartilage à la réparation de petits défauts de coordination, en s'appuyant sur les tissus environnants pour protéger le matériau implanté. Pour améliorer les propriétés du tissu développé, la stimulation mécanique est une méthode courante utilisée pour augmenter la synthèse de la matrice extracellulaire du cartilage ainsi que les propriétés mécaniques résultantes de l'ingénierie tissulaire. La stimulation mécanique applique des forces sur le tissu construit analogue à ceux rencontrés in vivo. Cetteest basé sur la prémisse que l'environnement mécanique, en partie, de réglementer le développement et la maintenance de 1,2 tissu natif. La forme la plus couramment utilisée dans la stimulation mécanique de l'ingénierie des tissus cartilagineux est la compression dynamique des déformations physiologiques de l'ordre de 5-20% à une fréquence de 1 Hz 1,3. Plusieurs études ont examiné les effets de la compression dynamique et ont montré qu'elle ait un effet positif sur le métabolisme des chondrocytes et la biosynthèse, en influant finalement sur les propriétés fonctionnelles de l'4-8 tissu développé. Dans cet article, nous illustrons la méthode pour stimuler mécaniquement les constructions d'hydrogel chondrocytes agarose sous compression dynamique et analyser les changements dans la biosynthèse par des dosages biochimiques et radio-isotope. Cette méthode peut également être facilement modifié pour évaluer les changements potentiellement induits dans la réponse cellulaire à la suite de stimuli mécaniques.
Protocol
1. Isolement des chondrocytes articulaires primaires
Récolte 10-15 tranches complètes de cartilage épaisseur des surfaces articulaires des articulations des animaux (par exemple, l'articulation métacarpo-phalangienne du squelette vaches matures obtenus à partir d'un abattoir local).
- Tranches de cartilage dans un plat de Pétri de 100 mm et incuber dans 20 ml de protéase 0,5% de Ham F-12 (p / v) pendant 2 heures à 37 ° C. Rincer trois fois dans les médias Ham F-12 de la culture et incuber avec 20 ml de collagénase 0,15% A dans les médias Ham culture F-12 pendant la nuit à 37 ° C.
- Filtrer la suspension de cellules à travers un filtre de 200 mesh écran dans un plat propre. Laver le filtre avec 5 ml de Ham F-12 et ajouter au plat. Transférer la suspension de cellules dans un tube de 50 ml conique. Laver la boîte de Pétri avec 10 ml de Ham F-12 et ajouter dans le tube conique.
- Centrifuger le tube à 600-800 rcf pendant 6-8 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant, en veillant à ne pas déranger ee culot de cellules et remettre en suspension dans 40 ml de milieu de culture de Ham F-12.
- Centrifuger le tube à 600-800 rcf pendant 6-8 min.
- Répétez les étapes 1,4 et 1,5 fois plus pour un total de 3 fois. Avant de centrifugation pour la troisième fois, reprendre le culot par une agitation et d'obtenir une aliquote de 500 ul pour le comptage des cellules.
- Compter les cellules viables en utilisant la méthode d'exclusion du bleu trypan 9 avec un hématimètre et d'un microscope optique inversé.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans un volume de Ham F-12 médias de doubler la densité de semis souhaitée (par exemple 20 x 10 6 cellules / ml pour une concentration finale de 10 x 10 6 cellules / ml après encapsulation).
2. Encapsulation Hydrogel chondrocytes agarose
- Heat 0,8 g autoclave de type VII agarose dans 20 ml de PBS 1x stérile (pH 7,4) sur une plaque chauffante réglée à 120 ° C jusqu'à dissolution. Une fois dissous, baisser le feu à 60 ° C, des températures plus élevées will la viabilité des cellules.
- Dans un tube conique de 50 ml, à fond mélanger des volumes égaux de la suspension de cellules avec le double de la concentration souhaitée de l'agarose (par exemple une suspension de 4% d'agarose d'un hydrogel d'agarose 2% finale). Eviter la formation de grosses bulles, car ils peuvent affecter la viabilité des cellules et de construire la fatigue.
- Soigneusement aliquote de 10 ml du mélange chondrocytes agarose dans un plat de Pétri de diamètre 60 mm, tout en évitant la création de grosses bulles.
- Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante jusqu'à gélifié.
- Obtenir autant d'échantillons d'hydrogel chondrocytes agarose selon les besoins (en général 20-30) à l'aide de 4 mm biopsie.
- Mesurer et noter les dimensions physiques (diamètre et hauteur) d'échantillons représentatifs à l'aide d'un micromètre. Constructions doit être d'environ 5 mm de hauteur, rejeter tous les échantillons obtenus à partir d'une région où la hauteur de la variance d'échantillonnage est supérieure à 2%.
- Transférer les échantillons dans un plat de 60 mm de Pétri frais et supplémentavec 10 ml de milieu complet (par exemple, 20% de sérum de veau foetal dans les médias Ham culture F-12 avec 20 mM d'HEPES, 100 d'acide ascorbique pg / ml, et les antibiotiques 2x / antimycotiques).
3. La stimulation mécanique et radiomarquage de chondrocytes-agarose hydrogels
- Autoclaver les composants métalliques de la plate-forme de compression. Stériliser les composants en plastique avec de l'éthanol à 70% (la nuit) et de la lumière UV (pendant au moins 15 minutes).
- Pour garder les constructions de tomber, en utilisant une pince, place 12 anneaux en plastique stériles de retenue (avec un diamètre intérieur plus grand que le diamètre construction) (n = 6, échantillons et contrôles) dans les puits d'une plaque de culture de 24 puits.
- En utilisant des pinces, transférer soigneusement les hydrogels chondrocytes-agarose de la boîte de Pétri à la plaque de 24 puits, la sécurisation chacun dans un anneau de retenue.
- Transfert 400 pi de milieu complet (par exemple 20% de FBS dans les médias Ham culture F-12 avec 20 mM d'HEPES, 100 pg / ml d'acide ascorbique et2x antibiotiques antimycosiques /) pour chaque échantillon.
- Monter la plate-forme de compression stérilisés (Figure 1) et fixer les plaques avec vis de réglage. Fixez la plate-forme de compression de la plaque de culture de 24 puits.
- Relâchez et re-fixer les vis de réglage pour établir plateau-hydrogel de contact (zéro l'état de contrainte).
- Chargez la plate-forme de compression monté dans un interféromètre de Mach-1 Système de test micromécanique. Plate-forme sécurisée pour la phase verticale par goupille de positionnement et de verrouillage en place avec vis de réglage. Retirez le gabarit d'espacement.
- Appliquer une charge de compression dynamique à l'amplitude désirée (p.ex. l'amplitude de contrainte à 10% en fonction de la hauteur d'origine des échantillons), la fréquence (par exemple, 1 Hz) et la durée ou le nombre de cycles (par exemple des intervalles de temps allant jusqu'à 60 minutes).
- À la fin de la stimulation mécanique, remplacer le gabarit d'espacement, desserrer la vis goupille de positionnement et en retirer l'appareil de compression et plaque de culture de la Mach-1 Système de test micromécanique. Radiomarqueur cellules d'hydrogel constructions en complétant les médias avec 5 pCi de l'isotope désiré (par exemple [3 H]-proline étiquette protéines pour la synthèse du collagène chondrocyte spécifique et [35 S]-soufre pour la synthèse de protéoglycanes).
- Incuber les constructions radiomarqués pour 24 heures à 37 ° C, 5% CO 2 10.
- Récolter les constructions d'hydrogel radiomarqués et rincer 3 fois dans du PBS 1X (pH 7,4) pour éliminer toute isotope non constituée en société. Digérer les échantillons en utilisant la papaïne (40 pg / ml dans 20 mM d'acétate d'ammonium, 1 mM d'acide ethyldiaminetetraacetic et 2 mM de dithiothréitol à 65 ° C pendant 72 heures).
- Essai Digest pour la teneur en ADN en utilisant le test PicoGreen colorant 11 et l'activité des isotopes incorporé, normalisée par rapport à la teneur en ADN, en β-scintillation liquide compter 12,13 digestion par la papaïne qui suit immédiatement.
Remarque: L'achat et l'élimination des matières radioactives (isotopes de déchets et des articlesqui ont pu entrer en contact avec des matières radioactives) doit suivre les dispositions institutionnelles pertinentes (et / ou gouvernementale) des politiques et procédures pour la manipulation et l'élimination des substances radioactives.
4. Les résultats représentatifs
Chondrocytes articulaires bovins-agarose constructions hydrogels (2% d'agarose à 10 x 10 6 cellules / ml de cellules encapsulées) ont été stimulées mécaniquement à une amplitude de la contrainte de compression de 10% à une fréquence de 1 Hz pendant 20 à 60 min (1.200 à 3.600 ou cycles ) et analysés pour leur teneur d'ADN et de synthèse de la matrice extracellulaire par incorporation de radio-isotopes. ADN et la synthèse de la matrice extracellulaire a été touchée d'une manière dose-dépendante. La teneur en ADN a montré une diminution significative de 35% en raison de 20 ou 30 minutes de stimulation (p <0,01), alors que 60 min de stimulation montré aucun effet (Figure 2). Cartilage spécifique synthèse du collagène et des protéoglycanes (déterminée par la [3 H]-proline et[35 S]-soufre constitution, respectivement) a montré une augmentation significative d'environ 60% en réponse à 20 ou 30 minutes de stimulation (p <0,01), avec 60 minutes de stimulation présentant aucun effet observable (Figure 3).
. Figure 1 Schéma de l'appareil de mesure intégré compression dynamique pour stimuler chondrocytes agarose constructions gauche:. Banc assemblé droite:. Vue éclatée montrant les composants individuels.
Changements Figure 2. Teneur en ADN des chondrocytes stimulés mécaniquement hydrogels d'agarose sous une amplitude de déformation à la compression de 10% à 1 Hz pendant 20 à 60 min (moyenne ± SEM, n = 6/groupe).
Changements Figure 3. Dans la synthèse de la matrice extracellulaire (collagène et de protéoglycanes) de chondrocytes stimulés mécaniquement hydrogels d'agarose sous amplitude de déformation à la compression de 10% à 1 Hz pendant 20 à 60 min (moyenne ± SEM, n = 6/groupe).
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Discussion
La méthode décrite pour appliquer des stimuli mécaniques contrôlées à la cellule tête de série agarose hydrogels permet d'enquêter directement sur les effets des dynamiques des forces de compression sur le métabolisme des chondrocytes. L'utilisation de la plate-forme de mesure de test en même temps que les bagues de retenue prévu contrainte latérale pour les constructions d'éviter d'éventuels problèmes de basculement échantillon. L'utilisation de plateaux de chargement morts pondérés fixés par les équipes de jeux assure un contact direct avec des constructions en dépit des différences de potentiel de hauteur de l'échantillon. Radiomarquage post-stimulation pour mesurer la biosynthèse cellulaire réduit le risque de contamination, ce qui permet un banc d'essai unique qui sera utilisé pour de multiples applications de dynamique des stimuli mécaniques. Cette méthode peut être facilement adaptée pour étudier l'effet des différents modes de chargement mécanique (1,4 cisaillement, par exemple, la tension 1,2) ou pour élucider les voies de mécanotransduction spécifique responsable.
ove_content "> Les résultats représentatifs montré qu'une petite quantité de la mort cellulaire d'environ 35% peut se produire en raison de l'application d'une stimulation dynamique, avec de plus longues applications de la stimulation mécanique sans incidence sur la cellularité construction 15-17. Biosynthèse des macromolécules de la matrice extracellulaire, déterminée par l'incorporation de radio-isotopes, a illustré une réponse durée dépend de la compression dynamique. Applications de la charge de compression dynamique pour une période de 20 à 30 min conduit à une réponse maximale anabolisant avec des durées plus longues apparaissant à produire un effet de désensibilisation aux stimuli mécaniques imposées. désensibilisation cellulaire de mécanique chargement a été noté précédemment 1,2,5,13, mais il ya eu peu d'études sur la caractérisation de la nature en fonction du temps de ce phénomène. Cette information peut être utilisée pour déterminer les conditions optimales de stimulation afin de maximiser l'accumulation de matrice extracellulaire avec le construire under répétée ou à long terme, les applications de la stimulation mécanique.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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