Summary
La biosintesi di matrice extracellulare cartilaginea dai condrociti può essere influenzata da applicazione di stimoli meccanici. Questo metodo descrive la tecnica di applicazione di compressione dinamiche ceppi di condrociti incapsulati in costrutti 3D e la valutazione dei cambiamenti indotti nel metabolismo dei condrociti.
Abstract
La cartilagine articolare soffre di una limitata capacità di riparazione, se danneggiato da insulto meccanico o degradato da malattie, come osteoartrite. Per rimediare a questa mancanza, diversi interventi medici sono stati sviluppati. Uno di questi metodi è quello di riaffiorare l'area danneggiata con il tessuto-ingegnerizzato cartilagine, tuttavia, il tessuto ingegnerizzato manca in genere le proprietà biochimiche e la durata della cartilagine nativa, mettendo in discussione la sua sopravvivenza a lungo termine. Questo limita l'applicazione di ingegneria tissutale cartilagine alla riparazione di piccoli difetti focali, basandosi sul tessuto circostante per proteggere il materiale impiantato. Per migliorare le proprietà del tessuto sviluppato, stimolazione meccanica è un metodo utilizzato per aumentare la sintesi di matrice extracellulare cartilaginea e le risultanti proprietà meccaniche del tessuto ingegnerizzato. Stimolazione meccanica applica forze al tessuto costrutti analoghi a quelli sperimentati in vivo. Questoè basato sulla premessa che l'ambiente meccanico, in parte, regola lo sviluppo e la manutenzione di 1,2 tessuto nativo. La forma più comunemente applicato di stimolazione meccanica in ingegneria tissutale cartilagine è la compressione dinamica a ceppi fisiologiche di circa il 5-20% con una frequenza di 1 Hz 1,3. Diversi studi hanno studiato gli effetti della compressione dinamica e hanno mostrato di avere un effetto positivo sul metabolismo dei condrociti e biosintesi, infine influenzare le proprietà funzionali del tessuto sviluppato 4-8. In questo lavoro, ci illustrano il metodo per stimolare meccanicamente condrociti-agarosio costrutti idrogel in compressione dinamica e analizzare i cambiamenti nella biosintesi attraverso test biochimici e radioisotopi. Questo metodo può essere facilmente modificato per valutare eventuali cambiamenti potenzialmente indotti in risposta cellulare a seguito di stimoli meccanici.
Protocol
1. Isolamento dei condrociti articolari primarie
Harvest 10-15 completi fette cartilagine spessore dalle superfici articolari delle articolazioni degli animali (ad esempio il metacarpo-falangea di vacche scheletro ottenuta da un mattatoio locale).
- Cartilagine Mettere le fette in un piatto 100 millimetri Petri e incubare a 20 ml di 0,5% proteasi in Ham F-12 (w / v) per 2 ore a 37 ° C. Risciacquare tre volte di Ham F-12 terreni di coltura e incubare con 20 ml di 0,15% Collagenase A in Ham F-12 Mezzi di coltura durante la notte a 37 ° C.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro 200 mesh in un piatto pulito. Lavare il filtro con 5 ml di Ham F-12 e aggiungere al piatto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml. Lavare la piastra Petri con 10 ml di Ham F-12 e aggiungere al tubo conico.
- Centrifugare la provetta a 600-800 rcf per 6-8 minuti a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante, assicurando di non disturbare °e pellet e risospendere in 40 ml di Ham F-12 terreni di coltura.
- Centrifugare la provetta a 600-800 rcf per 6-8 min.
- Ripetere i passaggi 1,4 e 1,5 volte più per un totale di tre volte. Prima di centrifugazione per la terza volta, risospendere il pellet tramite agitazione e ottenere una aliquota 500 microlitri per la conta cellulare.
- Contare le cellule vitali con il metodo di esclusione Trypan blu 9 con un emocitometro e un microscopio ottico invertito.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un volume di Ham F-12 supporti di raddoppiare la densità di semina desiderata (ad esempio 20 x 10 6 cellule / ml per una concentrazione finale di 10 x 10 6 cellule / ml dopo incapsulamento).
2. Condrociti-agarosio Hydrogel incapsulamento
- Calore 0,8 g autoclavato Type VII agarosio in 20 ml di PBS sterile 1x (pH 7,4) su una piastra calda impostata a 120 ° C fino a completa dissoluzione. Una volta sciolto, abbassare il calore a 60 ° C come temperature superiori will influenzare la vitalità delle cellule.
- In una provetta da 50 ml, mescolare volumi uguali della sospensione cellulare con il doppio della concentrazione desiderata di agarosio (es. sospensione agarosio al 4% per un idrogel finale 2% agarosio). Evitare la formazione di bolle di grandi dimensioni in quanto possono influenzare la vitalità delle cellule e la costruzione di durata a fatica.
- Un'aliquota accuratamente 10 ml di agarosio-condrociti miscela in un piatto Petri diametro 60 mm, evitando la formazione di bolle grandi.
- Lasciate riposare per 30 minuti a temperatura ambiente fino gelificata.
- Ottenere il maggior numero di condrociti-agarosio campioni idrogel, se necessario (in genere 20-30) con una da 4 mm biopsia.
- Misurare e registrare le dimensioni fisiche (diametro e altezza) di campioni rappresentativi con un micrometro. Costrutti deve essere di circa 5 mm di altezza, eliminare eventuali campioni ottenuti da una regione in cui la varianza altezza del campione è superiore al 2%.
- Trasferire i campioni di un piatto dolce 60 millimetri Petri e integrarecon 10 ml di mezzi completi (ad esempio il 20% di siero fetale bovino in Ham F-12 mezzi di coltura con 20 mM HEPES, 100 pg / ml di acido ascorbico, e antibiotici / antimicotici 2x).
3. La stimolazione meccanica e radiomarcatura di condrociti-agarosio idrogel
- Autoclave i componenti metallici del rig compressione. Sterilizzare i componenti in plastica con il 70% di etanolo (durante la notte) e ai raggi UV (per almeno 15 minuti).
- Per mantenere costrutti ribaltamento, mediante pinza, posto 12 anelli di plastica sterili fissaggio (con un diametro interno maggiore del diametro costrutto) (n = 6, campioni e controlli) nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti cultura.
- Utilizzando pinze, trasferire accuratamente i condrociti-agarosio idrogel dalla capsula di Petri a 24 pozzetti, assicurando ognuno in un anello di ritegno.
- Trasferire 400 ml di mezzi completi (ad esempio il 20% FBS in Ham F-12 terreni di coltura con 20 mM di HEPES, 100 mcg / ml di acido ascorbico, e2x antibiotici / antimicotici) in ciascun pozzetto.
- Montare l'impianto di compressione sterilizzato (Figura 1) e fissare le piastre con viti di fissaggio. Collegare l'impianto di perforazione di compressione al 24 pozzetti piastra di coltura.
- Rilasciare e ri-fissare le viti a stabilire contatto piastra-idrogel (zero stato di deformazione).
- Caricare l'impianto di compressione assemblati in un sistema di Mach-1 Test di micromeccanica. Rig sicuro allo stadio verticale tramite perno di posizionamento e bloccaggio in posizione con vite di fermo. Rimuovere la dima spaziatura.
- Applicare al carico di compressione dinamica ampiezza desiderata (ampiezza di deformazione ad esempio 10% in base all'altezza originale dei campioni), la frequenza (ad esempio 1 Hz) e durata o il numero di cicli (ad esempio, intervalli di tempo fino a 60 min).
- Al termine della stimolazione meccanica, sostituire la maschera di distanza, allentare la vite di fermo posizionamento perno e rimuovere l'impianto di compressione e piastra di coltura dal sistema-1 Mach Testing micromeccanica. Radiotracciante cellula-idrogel costrutti completandola i media con 5 uCi dell'isotopo desiderato (ad esempio, [3 H]-prolina label proteine per condrociti specifica sintesi del collagene e [35 S] tenore di zolfo per la sintesi dei proteoglicani).
- Incubare i costrutti radiomarcati per 24 hr a 37 ° C, 5% CO 2 10.
- Raccogliere i costrutti idrogel radioattivi e lavare 3 volte in 1x PBS (pH 7.4) per rimuovere eventuale isotopo prive di personalità giuridica. Campioni digest usando papaina (40 mg / ml in 20 mM di acetato di ammonio, acido 1 mM ditiotreitolo ethyldiaminetetraacetic e 2 mM a 65 ° C per 72 ore).
- Saggio digest per il contenuto di DNA per mezzo del test PicoGreen colorante 11 e l'attività degli isotopi incorporato, normalizzato al contenuto di DNA, da β-liquido di scintillazione conteggio 12,13 digestione papaina subito dopo.
Nota: L'acquisto e lo smaltimento di materiali radioattivi (isotopi di rifiuti e oggettiche possano essere venuti in contatto con materiali radioattivi) deve seguire il istituzionale rilevante (e / o di governo) le politiche e le procedure per la manipolazione e lo smaltimento di sostanze radioattive.
4. Risultati rappresentativi
Condrociti articolari bovini-agarosio costrutti idrogel (2% agarosio con 10 x 10 6 cellule / ml cellule incapsulate) sono stati stimolati meccanicamente ad una ampiezza di 10% di deformazione a compressione ad una frequenza di 1 Hz per 20 a 60 min (o 1.200 a 3.600 cicli ) e analizzati per il contenuto di DNA e la sintesi della matrice extracellulare per incorporazione radioisotopo. DNA e sintesi di matrice extracellulare è stato influenzato in un modo dipendente dalla dose. Contenuto di DNA hanno mostrato una diminuzione del 35% come risultato di 20 o 30 min di stimolazione (p <0,01), mentre 60 min di stimolazione mostrato alcun effetto (Figura 2). Cartilagine-specifiche sintesi di collagene e proteoglicani (determinato da [3 H]-prolina e[35 S]-zolfo incorporazione, rispettivamente) mostra significativi aumenti di circa il 60% in risposta a 20 o 30 min di stimolazione (p <0,01), con 60 min di stimolazione esibendo alcun effetto osservabile (Figura 3).
. Figura 1 Schema della fuoriserie rig compressione dinamica per stimolare condrociti-agarosio costrutti sinistra:. Rig assemblato destra:. Esploso che mostra i singoli componenti.
Modifiche Figura 2. Nel contenuto di DNA-agarosio condrociti idrogel stimolato meccanicamente sotto una ampiezza 10% di deformazione a compressione a 1 Hz per 20 a 60 minuti (media ± SEM, n = 6/group).
Modifiche Figura 3. Nella sintesi della matrice extracellulare (collagene e proteoglicani) di condrociti-agarosio idrogel meccanicamente stimolato meno del 10% ampiezza di deformazione a compressione a 1 Hz per 20 a 60 minuti (media ± SEM, n = 6/group).
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Discussion
Il metodo descritto per l'applicazione di stimoli meccanici controllati alla cella testa di serie agarosio idrogel permette l'indagine diretta sugli effetti dinamici delle forze di compressione sul metabolismo dei condrociti. L'uso del custom-test rig in combinazione con gli anelli di ritenuta previsto vincolo laterale per i costrutti di evitare potenziali problemi di campione ribaltamento. L'uso di morti ponderati piani di carico garantiti da equipaggi set garantisce un contatto diretto con i costrutti, nonostante le differenze di potenziale di altezza campione. Radiomarcatura post-stimolazione per misurare biosintesi cellulare riduce la possibilità di contaminazione, consentendo un impianto singolo test da utilizzare per applicazioni multiple di dinamiche stimoli meccanici. Questo metodo può essere facilmente adattato per studiare l'effetto di differenti modalità di carico meccanico (ad esempio 1,4 taglio, tensione 1,2) o per chiarire meccanotrasduzione specifiche vie responsabile.
ove_content "> I risultati rappresentativi illustrato che una piccola quantità di morte cellulare di circa 35% può verificarsi a causa dell'applicazione della stimolazione dinamica, con più applicazioni di stimolazione meccanica non interessano cellularità costrutto 15-17. biosintesi delle macromolecole della matrice extracellulare, determinato incorporazione radioisotopo, illustrata una risposta dipendente durata di compressione dinamica. Applicazioni della dinamica carico di compressione per un periodo di 20 a 30 min determinato una risposta massima anabolizzante con durate appaiono per provocare un effetto di desensibilizzazione agli stimoli meccanici imposti. desensibilizzazione Cellular alla meccanica caricamento è stato notato precedentemente 1,2,5,13, ma c'è stata poca ricerca in caratterizzazione della natura dipendente dal tempo di questo fenomeno. Queste informazioni possono essere utilizzate per determinare le condizioni di stimolazione ottimale per massimizzare l'accumulo di matrice extracellulare con l' costruire under ripetute, oa lungo termine, applicazioni di stimolazione meccanica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham's F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
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