Summary
Denna artikel beskriver en biofabrication tillvägagångssätt: deposition av stimuli-responsiva polysackarider i närvaro av partiska elektroder för att skapa biokompatibla filmer som kan vara funktionaliserad med celler eller proteiner. Vi visar en bänkbaserade strategi för generering av filmerna liksom deras grundläggande användning för att skapa interaktiva biofunctionalized ytor för lab-on-a-chip applikationer.
Abstract
Framsteg i lab-on-a-chip-teknik lovar att revolutionera både forskning och medicin genom lägre kostnader, bättre känslighet, bärbarhet och högre genomströmning. Införlivandet av biologiska komponenter på biologiska mikroelektromekaniska system (bioMEMS) har visat stor potential för att uppnå dessa mål. Mikrofabricerade elektroniska chips möjliggöra mikrometer skala funktioner samt en elektrisk förbindelse för avkänning och aktivering. Funktionella biologiska komponenter ger systemet förmågan att specifikt påvisande av analyter, enzymatiska funktioner och helcell-förmåga. Standard mikrofabrikationslaboratorier processer och bio-analytiska tekniker har framgångsrikt använts för årtionden i datorn och biologiska industrier, respektive. Deras kombination och gränssnitt i en lab-on-a-chip miljö, dock frambringar nya utmaningar. Det är en uppmaning till tekniker som kan bygga ett gränssnitt mellan elektroden och biologiska komponenter tillent som är mild och är lätt att tillverka och mönster.
Biofabrication, beskrivs här, är en sådan metod som har visat mycket lovande för sin enkla att montera inkorporering av biologiska komponenter med mångsidighet i en On-chip funktioner som är aktiverade. Biofabrication använder biologiska material och biologiska mekanismer (självorganisering, enzymatisk montering) för bottom-up hierarkisk montering. Medan våra laboratorier har visat dessa begrepp i många format 1,2,3, här visar vi monteringen baserad på elektroutfällning följt av flera tillämpningar av signal-baserade interaktioner. Monteringsprocessen består av elektroavsättning av biokompatibla stimulerbara polymerfilmer på elektroder och deras efterföljande funktionalisering med biologiska komponenter, såsom DNA, enzymer, eller levande celler minst 4,5. Elektroavsättning drar fördel av det pH-gradient skapas vid ytan av en förspänd elektrod från elektrolysenvatten 6,7,. Kitosan och alginat är stimulerbara biologiska polymerer som kan utlösas för att själv montera in hydrogelfilmer som svar på ansatta elektriska signaler 8. Tjockleken av dessa hydrogeler bestäms av den utsträckning i vilken pH-gradient sträcker sig från elektroden. Detta kan ändras med hjälp av olika strömtäthet och tider nedfall 6,7. Detta protokoll kommer att beskriva hur chitosan filmer deponeras och funktionaliseras genom kovalent fästa biologiska komponenter till rikliga primära amin som är närvarande på filmen antingen genom enzymatiska eller elektrokemiska metoder 9,10. Alginat filmer och deras brottsprovokation av levande celler kommer också att behandlas 11. Slutligen är användningen av biofabrication visas genom exempel på signalen baserad interaktion, inklusive kemisk-till-elektrisk-, cell-till-cell, och även enzym-till-cell-signalöverföring.
Både elektroavsättningoch funktionalisering kan utföras under nästan fysiologiska betingelser utan behov av reagensen och sålunda spara labila biologiska komponenter från hårda betingelser. Dessutom har både kitosan och alginat länge använts för biologiskt relevanta ändamål 12,13. Totalt sett kan biofabrication, en snabb teknik som kan enkelt utföras på en bänk, användas för att skapa mönster mikroskala av funktionella biologiska komponenter på elektroderna och kan användas för en mängd olika lab-on-en-chip-applikationer.
Protocol
1. Alginat Elektrodeponering
- Anslut en strömkälla till specialtillverkade elektroderna via korskopplingskabel med krokodilklämmor. En indiumtennoxid (ITO) täckt glasskiva kommer att fungera som anod (arbetselektrod) och platina folie kommer att fungera som katod (motelektroden). Positionera elektroderna så ITO yta som skall funktionaliseras motsätter motelektroden och är placerad antingen vertikalt för att doppas i en lösning eller horisontellt, så att avsättningen är innesluten på ytan.
- Framställ en lösning alginat avsättning genom att blanda 1% alginat och 0,5% CaCOg 3 (i vikt) i destillerat vatten och därefter autoklavering lösningen. Det rekommenderas att kontinuerligt röra om lösningen när den inte används.
- Dränka båda elektroderna in i avsättningskammaren lösningen. Alginatet används kan fluorescensmärkt med fluorosfärer (Invitrogen), enligt Cheng et al. 14, för att medge fluorescence avbildning av den resulterande filmen.
- Påföra en konstant strömtäthet (3 A / m 2) under 2 minuter; spänning kommer att förskjuta inom intervallet 2-3 V.
- Koppla bort elektroden och avlägsna icke-avsatt lösning. Försiktigt skölja filmen med NaCl (0,145 M) för att avlägsna överflödig alginat.
- Inkubera filmen kort (~ 1 min) i CaCl 2 (0,1 M) för att stärka gel. Skölj med NaCl (0,145 M) och inkubera i en önskad lösning kompletterad med CaCl2 (1 mM).
- Bild med användning av ett fluorescensmikroskop (figur 1B).
2. Samavlagring av Kommunicera Cell populationer i alginat
- En signal-sändare cellkultur (W3110 wt E. coli), odlades i LB-medium, och en signal-mottagaren cellkultur (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp ^ + pET-dsRed - Kan ^), odlades i LB-medium + 50 pg / ml vardera av kanamycin och ampicillin, måste odlades över natten ettnd åter inokulerades för tillväxt till en optisk densitet (vid 600 nm) på 1. Justera optisk densitet av mottagaren cellkultur till 0,4-0,6 med LB före användning.
- Framställa en beläggning lösning av 2% alginat och 1% CaCO 3, och blanda med varje cellkultur i ett förhållande 1:1 till en slutlig koncentration av 1% alginat, 0,5% CaCOs 3, med cellerna späddes till en densitet av ungefär hälften odlingen densitet.
- Använd en glasskiva mönstrad med två ITO elektroder som finns med en polydimetylsiloxan (PDMS) väl (beredd enligt Sylgard instruktioner och kapas till önskad storlek) och en platina motelektrod. Anslut en ITO-elektrod till en strömförsörjning med platina som beskrivs i förfarande 1 (Alginat elektrolytisk).
- Doppa elektroderna i en beläggningslösning innehållande mottagaren celler. Ställa in strömmen till en konstant ström vid en densitet av 3 A / m 2, där ytan dimensionen definieras av den inre elektroden på vilken deposition kommer att inträffa.
- Använda den aktuella under 2 minuter för att tillåta samavlagring av cellerna i alginatmatris.
- Skölj filmen såsom beskrivits i Steg 1.5.
- Växla anodiska anslutningen till den andra, intilliggande, ITO-elektrod.
- Upprepa avsättning förfarande (steg 2.4 - 2.7), men denna gång införing av lösningen som innehåller avsändarens celler.
- Inkubera 2-elektroden chip innehållande samavlagrade celler och kalcium-alginat över natten vid 37 ° C i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 10% LB-media och 1 mM CaCl2.
- Efter inkubation bild med användning av ett fluorescensmikroskop (figur 2B).
3. Kitosan Elektrodeponering
- Anslut strömförsörjningen till elektroderna via krokodilklämmor. Ett guld belagt kiselchip kommer att fungera som katod (arbetselektrod) och en platinafolie kommer att fungera som anod (motelektroden). Placera guldelektroden yta så evid det motsätter motelektroden och båda är positionerade vertikalt som skall doppas i en lösning eller horisontellt, så att avsättningen är innesluten på ytan.
- Bered en kitosanlösning genom att blanda kitosan flingor i vatten och långsamt tillsätta 2 M HCl för att lösa de polysackarider (slutligt pH 5,6), och se till att följa det förfarande som beskrivs av Meyer et al. 15.
- Placera elektroderna i en kitosan-lösning (0,8%), fullständigt nedsänka det önskade området för avsättning. Kitosanet som används kan fluorescensmärkt med 5 - (och-6)-karboxirodamin 6G succinimidylester (Invitrogen), enligt Wu et al 8, för att avbilda den elektrodeponerade filmen genom fluorescensmikroskopi..
- Påföra en konstant strömtäthet (4 A / m 2) under 2 minuter. Spänning kommer att förskjuta inom intervallet 2-3 V. Beräkna strömtätheten som en funktion av guld ytarea på arbetselektroden exponeras för deposition-lösning.
- Skölj elektroden med avjoniserat vatten för att avlägsna överflödigt kitosan. Chipet kan lagras i vatten eller PBS (10 mM, pH 7,0).
- Bild med användning av ett fluorescensmikroskop (figur 3C).
4. Elektrokemisk Transduktion med en funktionaliserad kitosanfilm
- Codeposit kitosan och glukos (GOx) från en lösning (1% kitosan, 680 U / ml GOx, pH 5,6) vid en strömtäthet av 4 A / m 2 på en mönstrad elektrod enligt procedur 3 (Kitosan elektrodeponering). En kitosanfilm infångad i GOx skapas.
- Fästa den behandlade elektroden till en tre-elektrodsystem som arbetselektrod, en platinatråd såsom motelektrod och Ag / AgCl som referenselektrod, såsom beskrivs i figur 4A.
- Doppa elektroderna i en fosfatbuffertlösning (0,1 M, pH 7,0) innehållande NaCl (0,1 M).
- Elektrokemiskt konjugera proteinet till kitosanFilmen genom att applicera en konstant spänning (0,9 V) för 60 med kronoamperometri 10.
- Placera chipet i fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,0) och tvätta under 10 minuter på en orbitalskak att avlägsna eventuell oreagerad NaCl och okonjugerat GOx.
- Återmontera till tre elektroder som beskrivits i steg 4,2 och sänk ned i en lösning av 5 mM glukos. Användning cyklisk voltammetri, sveper den potentiella i en positiv riktning för att 0,7 V. Användning av ett kontrollsystem film innehållande ingen glukos-oxidas som en jämförelse för mängden oxidation ses i svep (fig. 4B).
- Avlägsna elektroderna från glukoslösning och skölj med fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,0) placeras därefter elektroderna i en 10 ml bägare innehållande 8 ml fosfatbuffert (0,1 M, pH 7,0). Förspänna GOx-funktionaliserade chip till 0,6 V för att tjäna som den arbetande elektroden (Figur 4C).
- Tillsätt alikvoter av glukos till bufferten (varje alikvot ökar glukoskoncentrationen genom4 mM).
- Generera en standardkurva mellan den konstanta strömmen och glukoskoncentrationen för GOx-funktionaliserad kitosanfilm.
5. Protein Funktionalisering Använda Enzymatisk Assembly
- Använda en glasskiva mönstrad med en intilliggande guld och ITO-elektrod som finns i en PDMS brunn. Bias guldelektroden med en katodisk potential att elektrolytiska kitosan som visats tidigare. Skölj filmen snabbt i DI vatten och sedan PBS med pipett.
- Tillsätt en lösning av 3 | iM blå fluorescerande "AI-2-syntas" 16 (med användning av en DyLight märkningskit) + 100 U / ml Tyrosinas i PBS.
- Inkubera under 1 h vid rumstemperatur och sköljs sedan filmen med PBS.
- Tillämpas en anodisk potential på ITO-elektrod för att codeposit en lösning alginat avsättning innehållande mottagare celler (som framställts i steg 2,1-2,2). Följ steg 2,3-2,6 arbetsordning 2 (samavlagring av cellpopulationer i alginat).
- För att skapaden överförda signalen (AI-2) enzymatiskt efter sköljning filmerna tillsätt en lösning av 500 pM S-adenosylhomocystein (SAH) i PBS, kompletterat med 10% LB medium och 1 mM CaCl2. Täcka elektroderna för att förhindra avdunstning av lösningen och inkubera över natten vid 37 ° C. Detta gör det möjligt för en mottagare cellsvar genom att generera en röd fluorescerande protein (dsRed).
- Intilliggande elektroder kan avbildas med fluorescensmikroskopi genom justering av filter för att fånga den blå fluorescens av AI-2-syntas och röd fluorescens uttrycks av de samavlagrade mottagaren celler (figur 5B).
6. Representativa resultat
Åläggs elektriska signaler kan skapa lokaliserade mikromiljöer (t.ex. fält och gradienter) i närheten av en elektrod yta och dessa stimuli kan utlösa självorganisering av polysackarider såsom alginat och kitosan att deponera en hydrogel film på elektrodytan. Eftersom såväl Tsin sol-gel-övergång sker vid elektrodytan, har den resulterande filmen electroaddressed, med dess geometri matchar elektrodmönster (figurerna 1B, 3C). Biokompatibla filmer såsom alginat och kitosan tillhandahålla ytor som kan funktionaliseras med biologiska komponenter. Med alginat har unika cellpopulationer har samavlagrade vid olika adresser. Bevis för att de electroaddressment observeras vid interaktion mellan sändaren och mottagaren cellpopulation. Den molekyl autoinduktor-2 (AI-2) diffunderar från sändaren celler och tas upp av de mottagar-celler, vilket resulterar i expression av dsRed röda fluorescerande protein (Figur 2A). I fig. 2B, är röd fluorescens observeras endast vid elektroden, där mottagarna är riktade.
Amingrupperna föreligger på kitosan förse den med den pH-känslighet som krävs för elektrodeponering samt en yta lämplig för funktionalisering. Viutnyttjas dessa unika egenskaper genom elektrokemiskt konjugera biosensing oxidas enzymet glukos (GOx) för att elektroavsatt kitosan filmer. Detta enzym ger sedan förmågan för detektering av glukos genom en enzymatisk reaktion (figur 4A) framställning av väteperoxid som därefter kan oxideras elektrokemiskt för att producera en utström. På detta sätt kan en kemisk signal skall transduceras till elektrisk. Figur 4B visar att filmer i vilka GOx var elektrokemiskt konjugerad producera en stark anodisk signal i närvaro av glukos i motsats till de filmer som inte innehåller någon GOx. Dessa resultat indikerar GOx kan monteras på en avsatt kitosanfilm och kommer att bibehålla katalytisk aktivitet. Vidare visar figur 4C en steg-ökning i anodströmmen produceras som svar på ökande glukoskoncentrationer. Standardkurvan också närvarande i Figur 4C visar att de steg ökar fortsatte i en nästan linjär fashion beroende på mängden glukos tillsattes. Dessa resultat visar att enzymet också bibehåller sin känslighet för ökande glukoskoncentrationer vid konjugering till kitosanfilm. Den lägre detektionsgränsen har inte studerats här, eftersom det tidigare har karaktäriserats för detta system i arbetet Meyer et. al.
Vi har också visat att kovalent immobilisering av ett enzym av intresse, för att innehålla en anpassad penta-tyrosin tagg, och kitosan i en enzymatiskt kontrollerat sätt. Närmare bestämt är denna process medieras av enzymet tyrosinas. Som visas av systemet i figur 5A (övre), ett enzym inkluderar AI-2-syntas en penta-tyrosin tag. Tyrosinas verkar på tyrosin taggen, oxidera restprodukter "fenol grupper O-kinoner, som sedan kovalent binder till chitosan s aminer. Bevis av kitosanfilm funktionalisering med AI-2-syntas genom tyrosinas montering observeras i figur 5B (Figur 5A (lägre)). Röd fluorescens av de mottagar-celler (Figur 5B) visar återigen interaktion mellan adresserna grund av diffusion av Al-2 från den ena till den andra, och vidare indikerar att enzymer immobiliserade på kitosan bibehålla aktivitet gång bundits kovalent.
Figur 1. Alginat elektrodopplackering. (A) Mechanism of alginat elektrodeponering: Som en elektrod är anodiskt förspänd, inträffar vattenelektrolys vid sin yta, vilket genererar en lokal lågt pH. Kalciumkarbonatpartiklar reagera med överskottav protoner och frisätter kalciumkatjoner eftersom partiklarna löses upp. I närvaro av kedjorna alginat polymer blir de joner kelaterad i en "eggbox" nätverk, som bildar en tvärbunden hydrogel vid elektroden. Som avståndet från elektroden ökar, har alginat en större tendens att förbli i lösning på grund av den reducerade närvaron av kalciumjoner. (B) En L-formad mönstrade ITO-elektrod användes för elektrolytiska alginat. En PDMS väl har fastställts till elektroden för att innehålla en grön fluorescent-märkt alginat (1%) och CaCOs 3 (0,5%) avsättning lösning. Efter elektroavsättning i 2 min. vid en strömtäthet av 3A / m 2, var electroaddressed alginat hydrogelen avbildas genom fluorescensmikroskopi.
Figur 2. Samavlagring av cellpopulationer. (A) System som visar interaktionen mellan två E. coli-stammar: En population producerar autoinduktor-2 (AI-2), En signalerande molekyl, och är benämnd "AI-2 avsändaren." Den andra befolkningen, kallad "AI-2 mottagare," är en reporter med AI-2, efter mottagandet av AI-2 genom diffusion från avsändaren uttrycker det röda fluorescerande proteinet dsRed. (B) Röd fluorescens bild av elektrodparet med AI-2 sändare befolkningen samavlagrade med alginat på vänster elektroden och AI-2-mottagare befolkningen samavlagrade med alginat på höger elektrod. Förstorad bild visar dsRed uttrycket av endast AI-2 mottagare.
Figur 3. Kitosan elektrodopplackering. (A) Schema visar den pH-beroende elektroavsättning av kitosan. Vattenelektrolys vid en katodiskt förspänd elektrod orsakar en lokal högt pH (som visas med en lokaliserad färgförändring av en pH-indikator-färgämne nära katoden i mikrofotografiet) som stimulerar den sol-gel-övergång av kitosan i denna region. (B) De aminer som finns på kitosan ger jagt pH-känsliga egenskaper. Över ett pH av 6,3 (pKa för kitosan) aminerna deprotoneras, vilket underlättar en övergång från sin protonerade löslig form till dess olösliga gelform. (C) En mönstrad guldelektrod användes för att elektrolytiska kitosan. Den elektrod, som är ansluten katodiskt till kraftkällan, nedsänktes i en grön fluorescent-märkt kitosan (0,8%) avsättning lösning. Efter elektroavsättning i 2 min. vid en strömtäthet av 4 A / m 2, var electroaddressed kitosanfilm med bild genom fluorescensmikroskopi.
Figur 4. Elektrokemisk transduktion med en funktionaliserad kitosanfilm. (A) Schematisk visar uppbyggnaden av en tre-elektrodsystem. Funktionaliserad kitosanfilm tjänar som arbetselektroden, en platinatråd användes såsom motelektrod och Ag / AgCl som referenselektrod. Elektrokemisk transduktion av glukos fortsätter genom the enzymatiska och elektrokemiska reaktioner visas där fram väteperoxid kan oxideras och påvisas vid arbetselektroden. (B) Cykliskt voltammagram (CV) vid elektrod med en kitosanfilm innehållande elektrokemiskt konjugerad glukosoxidas (GOx) visar en stark anodisk signal i en 5 mM glukos-lösning. En film som inte innehåller någon GOx tjänade som en kontroll och uppvisade ingen signal i samma lösning. (C) En standardkurva mellan anodisk ström och glukoskoncentrationen visar en nära linjärt förhållande (varje alikvot ökade glukoskoncentrationen genom 4 mM och ökade också den aktuella amplituden i den infällda diagrammet i ett stegvis sätt).
Figur 5. Protein funktionalisering med enzymatisk montering. (A, övre) Schema visar tyrosin-märkt "AI-2-syntas" är kovalent bundna till en kitosan film genom tyrosinas montering. De tyrosinrester blir Oxidized att O-kinoner med tyrosinas effekten och kan reagera med amingrupper på kitosanfilm, som bildar en kovalent bindning. (A, lägre) AI-2-syntas genererar AI-2 från ett substrat (SAH); mottagaren celler rapporterar den genererade AI-2 genom dsRed fluorescens uttryck. (B) fluorescens bilder som visar ett kitosan film på guld, funktionaliserad med blå-märkt AI-2-syntas. Bredvid varandra, är AI-2 mottagare celler samavlagrade med alginat på ITO. Efter tillsats av den enzymatiska substratet till brunnen och inkubationen uttrycker AI-2-mottagare celler dsRed.
Discussion
Våra rutiner visar galvanisk och funktionalisering av biopolymerfilmer, en process vi benämner biofabrication. Genom funktionalisering med celler och biomolekyler skapar vi biologiska ytor med förmåga att interagera med varandra och elektroden adress de är monterade på. Det första steget, elektrodeposition, äger rum genom den triggade självsammansättning av biopolymerer, alginat och kitosan i våra studier, som svar på en elektrisk signal. Såsom angivits tidigare en pH-gradient genereras som kan styras av strömtätheten och avsättningstid, vilket ger ytterligare kontroll över filmen dimensioner och egenskaper 6,17. Vi har funnit att en mängd olika strömtäthet och nedfall kombinationer tid kan användas för elektroderna som anges i tabell 1. Även användning av andra elektroder är genomförbart, skulle justeringar av förfarandet vara nödvändig. Jämfört med andra tekniker för filmbildning processen för electrodeposiEkvationen är enkel, snabb och reagentless. Det finns inget behov av en bred repertoar av dyrbar utrustning och mödosamma beredningar. Viktigt kan processen tål mindre experimentella avvikelser och kan lätt startas över om ett problem uppstår.
Chitosan är kapabel att svara på ett högt katodiskt pH-gradient på grund av viktiga funktionella egenskaper som tilldelas den genom en hög halt av primära aminer. Vid högt pH (högre än dess pKa ~ 6,3) aminerna deprotoneras och kitosan blir olösligt, vilket möjliggör för filmbildning. Efter avsättning kommer filmerna förblir fäst vid elektroden. Emellertid finns det möjlighet att delaminera dem om så önskas. Filmerna kommer att förbli stabil så länge som pH för lösningen ej faller under pKa. Sura lösningar protonera aminerna och de följande elektrostatiska repulsioner svälla gelén tills den upplöses 18. Det vill säga, är montering / demontering processen reversibel på efterfrågan och allows för att avlägsna de deponerade filmer och återanvändning av elektroder. Lämpligen är pH-område vid vilket den sol-gel-övergång sker nära den vid vilken de flesta biologiska komponenter fungera optimalt. Detta gör processen idealisk för lagring av funktionaliteten under monteringen 6.
Alginat filmbildning underlättas av den anodiska elektrolys av vatten såväl som närvaron av kalcium-karbonat 7. Den lokala lågt pH vid anoden solubiliserar kalciumkarbonat som leder till katjoner frigörande kalcium. Dessa joner är kelaterad genom alginat, bildar ett tvärbundet nätverk på elektrodytan. Alginat filmer är särskilt reversibla genom konkurrens om kalciumjoner från andra kelatbildande föreningar såsom citrat eller EDTA, som kan användas för att lösa filmer, som möjliggör återanvändning av de underliggande elektroderna. Således, alginat filmer är relativt sköra när de utsätts för fysiologiska förhållanden eftersom kalciumjoner är lätt scavenged från gelmatrisen, försvaga dess struktur och främja film delaminering eller återupplösning. För att övervinna denna begränsning, har vi en inkubationssteg för filmen i 1 M CaCl2 för att förstärka gelén. Dessutom rekommenderas att filmens inkubation lösning (cellmediet etc.) kompletteras med CaCl2 vid en koncentration av 500 pM-3 mM.
Den andra stora förfarandet är funktionalisering av den avsatta filmen med relevanta biologiska komponenter. Detta kan uppnås på två sätt, det första är elektrokemiska konjugation, en strategi som möjliggör snabb, reagentless montering av proteiner med exceptionell spatial kontroll 10. Emellertid är funktionalisering på detta sätt begränsas genom diffusion av Cl - joner genom filmen till elektroden samt diffusion av HOCl, den alstrade reaktiva mellanprodukten, tillbaka ut i lösningen. Förmågan hos elektrokemiskt aktiva molekyler att passeragenom filmen tillåter för transduktion av biologiska och kemiska signaler till lätta att läsa elektriska signaler 15. Vi har visat tyrosinas-medierad koppling som en andra strategi för enzymet funktionalisering till kitosan, framgår av kovalent fästa AI-2-syntas. Denna strategi gör det möjligt för funktionalisering processen som skall styras och selektiv - beroende på en specifik reagens, tyrosinas, vilket verkar discriminately på proteiner som innehåller en tyrosin etiketten 9.
Vi visa användbarheten och biokompatibiliteten för flera Högtalaranläggningar genom att replikera naturliga vägar på ett chip. Först ordnade vi två cellpopulationer (dvs "avsändare" och "mottagare") på olika adresser, och visade att de samverkade över angränsande elektroder för att leverera AI-2 och generera en fluorescens svar. Detta koncept har också visats av Cheng et al. i en mikrofluidisk chip 14. Vi härmade också interaktionen, utan användsett enzym för att syntetisera AI-2 för leverans. På detta sätt fick en syntetisk intracellulär väg, AI-2-syntes, replikerade genom biofabrication och fungerade mycket som det skulle i lösning.
I båda fallen uppvisar sammansättning av flera adresser utmaningen att undvika icke-specifik bindning mellan adresser, eftersom varje beläggningslösning måste införas på hela elektrodgruppen, även om elektrodeposition är endast avsedd vid en adress. Mild men ändå noggrann tvättning kan avlägsna huvuddelen av kvarvarande lösningen från icke-förspända elektroder; användning av flödet i mikrofluidiska kanaler kan vidare minimera icke-specificitet. Synnerhet för den intilliggande biofabrication av kitosan och adresser alginat, rekommenderar vi avsättning av det kitosan filmen först efter detta med biofunctionalization steg, och efter detta, elektrolytisk alginat. Även om vi inte har gjort så här, har vi funnit att blockera kitosanfilm med inerta proteiner (t.ex. milk, BSA, etc) minskar i hög grad icke-specifik bindning av oönskade molekyler till kitosan s aminerad yta.
Vi har funnit användbarhet vid upprättandet mönstrade elektroder, som ofta återfinnes i bioMEMS anordningar, såsom de "ritningar" för ett komplext arrangemang av celler och biomolekyler. Användningen av elektrodeponerade chitosan i bioMEMS enheter kan gå långt utöver de exempel som nämns här 19. Kitosan kan avsättas på olika geometrier mikroskala - såsom i mikrokanaler och på icke plana ytor 20,15. Filmerna kan även modifieras med andra polymerer och olika proteiner, DNA, nanopartiklar och redox-aktiva molekyler för nya egenskaper 21,22,23. I bioMEMS anordningar har kitosan filmer har använts för avgivning av läkemedel, redox-och små-molekyl detektering, biokatalys, och studier cell 20,23,24,25. På liknande sätt är alginat används allmänt som en cell-infångning matrisen och har undersökts för reversibel fluidisk inneslutning avcellpopulationer och i film immunoanalysis 26,27,28. Kompositfilmer för tillämpningar vävnadsutvecklingssteg har tillverkats med användning av alginat elektroavsättning, med komponenter såsom med hydroxiapatit för ortopediska implantat 29.
I våra demonstrationer av biofabrication, har vi visat både samspelet mellan biologiska komponenter och över bio-elektroniska gränssnittet är lika tillämpliga, vilket sätter i nå utsikten att integrera alla sorter av interaktioner för avancerad prestanda i on-chip signalöverföring. Följaktligen kan biofabrication underlätta tillverkning av enheter med reducerad "minsta karaktäristisk storlek" som en direkt fortsättning på snabba utvecklingen inom mikrofabrikation så ofta motiverats av hemelektronik. Det är kanske nästa nästa generations enheter i själva verket omfattar labila biologiska komponenter som ger naturens utsökta montering och kapacitet erkännande på ännu mindre långa scales än konstgjorda system. Vi ser framför oss kort sikt tillämpningar inom analytisk instrumentering, miljö sensorer, och även biokompatibla implantat.
Disclosures
Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av USA Defense Threat Reduction Agency.
Acknowledgments
Vi erkänner finansiering från DTRA för stöd till detta manuskript och från ONR, DTRA och NSF för partiell stöd underliggande forskningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
