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Bioengineering

Combler l'interface bio-électronique avec Biofabrication

Published: June 6, 2012 doi: 10.3791/4231
* These authors contributed equally

Summary

Cet article décrit une approche biofabrication: dépôt de stimuli-sensibles polysaccharides en présence d'électrodes biaisées pour créer des films biocompatibles qui peuvent être fonctionnalisés avec des cellules ou des protéines. Nous démontrons une stratégie de paillasse pour la génération des films ainsi que leurs utilisations de base pour créer des surfaces interactives pour biofonctionnalisés lab-on-a-chip applications.

Abstract

Les progrès de la technologie de la promesse de laboratoire-sur-une-puce de révolutionner la recherche et la médecine par une baisse des coûts, une meilleure sensibilité, la portabilité et un débit plus élevé. L'incorporation de composants biologiques biologiques sur les systèmes microélectromécaniques (BioMEMS) a montré un grand potentiel pour atteindre ces objectifs. Microfabriqués puces électroniques permettent échelle micrométrique caractéristiques ainsi que une connexion électrique pour la détection et d'actionnement. Fonctionnelles des composants biologiques donner au système la capacité pour la détection spécifique des analytes, des fonctions enzymatiques, et de cellules entières capacités. Procédés de microfabrication standard et bio-analytiques techniques ont été utilisées avec succès depuis des décennies dans les industries de l'informatique et biologique, respectivement. Leur combinaison et d'interface dans un environnement de laboratoire-sur-une-puce, cependant, fait naître de nouveaux défis. Il est un appel à des techniques qui peuvent construire une interface entre l'électrode et Compon biologiqueent qui est doux et facile à fabriquer et le motif.

Biofabrication, décrit ici, est une telle approche qui a montré de grandes promesses pour sa facilité-à-assembler l'incorporation de composants biologiques avec une polyvalence dans les fonctions sur la puce qui sont activées. Biofabrication utilise des matériaux biologiques et les mécanismes biologiques (auto-assemblage, l'assemblage enzymatique) pour bottom-up assemblage hiérarchique. Alors que nos laboratoires ont démontré ces concepts dans de nombreux formats 1,2,3, ici, nous démontrons le processus d'assemblage basée sur électrodéposition suivie par plusieurs applications de signal basés sur des interactions. Le processus d'assemblage se compose de l'électrodéposition de films polymères biocompatibles stimuli-sensibles sur des électrodes et leur fonctionnalisation ultérieure avec des composants biologiques comme l'ADN, les enzymes, ou des cellules vivantes 4,5. Électrodéposition tire parti du gradient de pH créée à la surface d'une électrode polarisée provenant de l'électrolysede l'eau 6,7,. Le chitosane et l'alginate sont stimuli-sensibles polymères biologiques qui peuvent être déclenchés à s'auto-assembler en films d'hydrogel imposées en réponse à des signaux électriques 8. L'épaisseur de ces hydrogels est déterminée par la mesure dans laquelle le gradient de pH s'étend de l'électrode. Ceci peut être modifié en utilisant différentes densités de courant et les temps de dépôt 6,7. Ce protocole décrire comment les films sont déposés chitosane et fonctionnalisé par liaison covalente des composants biologiques à des groupes amine primaires présents abondantes sur le film à travers soit méthodes enzymatiques ou électrochimique 9,10. Films d'alginate et de leur piégeage de cellules vivantes seront également abordés 11. Enfin, l'utilité de biofabrication est démontrée par des exemples de l'interaction fondée sur le signal, y compris les produits chimiques-électrique, la cellule à cellule, et aussi la transmission du signal enzyme-à-cellule.

Tant le électrodépositionet la fonctionnalisation peut être réalisée dans des conditions proches des conditions physiologiques, sans la nécessité pour les réactifs et épargner ainsi les composantes biologiques labiles à partir des conditions très dures. En outre, à la fois le chitosane et l'alginate ont été longtemps utilisées à des fins pertinentes biologiquement 12,13. Dans l'ensemble, biofabrication, une technique rapide qui peut être tout simplement exécutée sur un établi, peut être utilisé pour créer des motifs de l'échelle du micron fonctionnelles des composants biologiques sur des électrodes et peut être utilisé pour une variété de lab-on-a-chip applications.

Protocol

1. Électrodéposition d'alginate

  1. Connecter une alimentation aux électrodes personnalisés fabriqués par des cordons de raccordement à l'aide des pinces crocodiles. Un oxyde d'étain indium (ITO) lame de verre recouverte agira en tant que l'anode (électrode de travail) et une feuille de platine servira en tant que cathode (contre-électrode). Positionner les électrodes afin que la surface d'ITO pour être fonctionnalisé est opposée à la contre-électrode et est positionné verticalement à être plongée dans une solution ou horizontalement de telle sorte que la solution de dépôt est contenue sur la surface.
  2. Préparer une solution d'alginate de dépôt en mélangeant alginate 1% et 0,5% de CaCO 3 (en poids) dans de l'eau distillée, puis autoclavage la solution. Il est recommandé de mettre en agitation continue de la solution lorsqu'il n'est pas utilisé.
  3. Submerger les deux électrodes dans la solution de dépôt. L'alginate peut être utilisé marqué par fluorescence avec FluoroSphères (Invitrogen), selon Cheng et al. 14, pour permettre fluorescenCE imagerie du film résultant.
  4. Appliquer une densité de courant constante (3 A / m 2) pendant 2 minutes, la tension se déplacera dans la plage de 2-3 V.
  5. Déconnecter l'électrode et retirer la solution non-déposé. Rincer délicatement le film avec NaCl (0,145 M) de supprimer l'alginate de superflu.
  6. Incuber brièvement film (~ 1 min) dans le CaCl 2 (0,1 M) pour renforcer le gel. Rincer avec de NaCl (0,145 M) et incuber dans une solution souhaitée complété avec du CaCl 2 (1 mM).
  7. Image en utilisant un microscope à fluorescence (figure 1B).

2. Codépôt des populations de cellules communicantes dans de l'alginate

  1. Une culture de signal de cellule-expéditeur (W3110 poids E. coli), cultivés dans des milieux LB, et une culture de cellules de signal-récepteur (MDAI2 + pCT6-LSRR - amp r + pET-DsRed - kan r), cultivés dans des milieux LB + 50 pg / ml de kanamycine et chaque ampicilline, doit être grandi en une nuit unee re-inoculé pour la croissance d'une densité optique (moins de 600 nm) de 1. Ajuster la densité optique de la culture cellulaire récepteur pour 0,4 à 0,6 avec LB avant utilisation.
  2. Préparer une solution de dépôt de l'alginate de 2% et 1% de CaCO 3, et mélanger avec chaque culture cellulaire dans un rapport 1:1 à une concentration finale de l'alginate de 1%, 0,5% de CaCO 3, avec les cellules dilué à une densité d'environ la moitié la densité de culture.
  3. Utilisez une lame de verre à motifs avec des électrodes d'ITO deux contenus par un polydiméthylsiloxane (PDMS) bien (préparé selon les instructions Sylgard et couper à la taille désirée) et une contre-électrode de platine. Connectez une électrode ITO à une alimentation électrique avec le platine, comme décrit dans la procédure 1 (électrodéposition alginate).
  4. Immerger les électrodes dans une solution de dépôt contenant des cellules réceptrices. Définir l'alimentation d'un courant constant à une densité de 3 A / m 2, où la dimension surface est définie par l'électrode unique sur lequel deposition va se produire.
  5. Appliquer le courant pendant 2 minutes afin de permettre codéposition des cellules dans la matrice d'alginate.
  6. Rincer le film tel que décrit à l'étape 1.5.
  7. Commuter la connexion anodique à la seconde, adjacente, électrode en ITO.
  8. Répétez la procédure de dépôt (Étapes 2.4 - 2.7), mais cette fois l'introduction de la solution contenant les cellules expéditeur.
  9. Incuber la puce à 2 électrodes contenant des cellules codéposés et de calcium d'alginate-nuit à 37 ° C dans un tampon phosphate salin (PBS) additionné de milieu LB 10% et 1 mM CaCl 2.
  10. Après incubation, l'image en utilisant un microscope à fluorescence (figure 2B).

3. Électrodéposition Chitosan

  1. Branchez l'alimentation aux électrodes par l'intermédiaire des pinces crocodiles. Une puce de silicium revêtu d'or agira en tant que cathode (électrode de travail) et une feuille de platine servira l'anode (contre-électrode). Position de la surface de l'électrode d'or de sorte èmequ'il s'oppose à la contre-électrode et les deux sont positionnés verticalement à être plongée dans une solution ou horizontalement de telle sorte que la solution de dépôt est contenue sur la surface.
  2. Préparer une solution de chitosane en mélangeant paillettes chitosane dans de l'eau et en ajoutant lentement HCl 2 M pour dissoudre les polysaccharides (pH final 5,6), en veillant à suivre la procédure décrite par Meyer et al. 15.
  3. Placer les électrodes dans une solution de chitosane (0,8%), complètement submergés la zone souhaitée pour le dépôt. Le utilisé chitosane peut être marqué de manière fluorescente avec la 5 - (et-6)-carboxyrhodamine 6G ester succinimidylique (Invitrogen), selon Wu et autres 8, à l'image du film électrodéposé par microscopie de fluorescence..
  4. Appliquer une densité de courant constante (4 A / m 2) pendant 2 minutes. Tension se déplacera dans la plage de 2-3 V. Calculer la densité de courant en fonction de la surface d'or de l'électrode de travail exposée à la depositiosolution n.
  5. Rincer l'électrode avec de l'eau DI pour enlever superflue chitosane. La puce peut être stockée dans l'eau ou du PBS (10 mM, pH 7,0).
  6. Image en utilisant un microscope à fluorescence (figure 3C).

4. Transduction électrochimique avec un film fonctionnalisé Chitosan

  1. Codépôt chitosane et de glucose-oxydase (GOx) à partir d'une solution (1% de chitosane, 680 U / ml GOx, pH 5,6) à une densité de courant de 4 A / m 2 sur une électrode à motifs selon l'une procédure 3 (électrodéposition chitosane). Un film de chitosane piégé dans GOx sera généré.
  2. Montage de l'électrode traitée à un système à trois électrodes de l'électrode de travail, un fil de platine en tant que contre-électrode et Ag / AgCl que l'électrode de référence, tel que décrit à la Figure 4A.
  3. Plonger les électrodes dans une solution tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) contenant du NaCl (0,1 M).
  4. Électrochimiquement conjugué à la protéine du chitosaneFilm en appliquant une tension constante (0,9 V) pendant 60 à l'aide chronoampérométrie 10.
  5. Placez la puce dans un tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) et laver pendant 10 minutes sur un agitateur orbital pour éliminer toute GOx qui n'a pas réagi de NaCl et non conjuguée.
  6. Remettre en place le système à trois électrodes tel que décrit dans l'étape 4.2 et plongez dans une solution de 5 mM de glucose. Utilisation de voltammétrie cyclique, de balayer le potentiel dans un sens positif à 0,7 V. Utilisez un film de contrôle ne contenant pas de glucose-oxydase comme une comparaison de la quantité d'oxydation vu dans le balayage (figure 4B).
  7. Retirer les électrodes de la solution de glucose et rincer avec un tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0) puis placer les électrodes dans un bécher de 10 ml contenant 8 ml de tampon phosphate (0,1 M, pH 7,0). La puce de polarisation GOx-fonctionnalisé à 0,6 V pour servir comme électrode de travail (figure 4C).
  8. Ajouter aliquotes de glucose dans le tampon (chaque aliquote augmente la concentration en glucose par4 mM).
  9. Générer une courbe standard entre le courant l'état d'équilibre et la concentration de glucose pour le film GOx-fonctionnalisé chitosane.

5. Fonctionnalisation de protéines Utilisation de l'assemblage enzymatique

  1. Utilisez une lame de verre à motifs avec une médaille d'or à côté et l'électrode ITO contenue dans un puits PDMS. Biais de l'électrode en or avec un potentiel cathodique par électrolyse au chitosane comme indiqué précédemment. Rincer le film brièvement dans de l'eau DI, puis du PBS à la pipette.
  2. Ajouter une solution de 3 uM bleus marqués par fluorescence "AI-2 Synthase" 16 (en utilisant un kit de marquage DyLight) + 100 U / ml dans du PBS tyrosinase.
  3. Incuber pendant 1 h à température ambiante, puis rincer le film avec du PBS.
  4. Appliquer un potentiel anodique à l'électrode en ITO de codéposer une solution de dépôt d'alginate contenant des cellules de réception (tel que préparé dans les étapes 2.1-2.2). Suivez les étapes de procédure 2.3-2.6 2 (Codépôt des populations de cellules dans l'alginate).
  5. Pour générerle signal transmis (AI-2) par voie enzymatique, après rinçage des films ajouter une solution de 500 uM S-adénosyl homocystéine (SAH) dans du PBS, complétée par LB 10% des médias et 1 mM CaCl 2. Couvrir les électrodes pour éviter l'évaporation de la solution et incuber pendant une nuit à 37 ° C. Cela permettra d'une réponse cellulaire du récepteur en générant une protéine fluorescente rouge (DsRed).
  6. Des électrodes adjacentes peut être imagée par microscopie de fluorescence en ajustant les filtres pour capter la fluorescence bleue du synthase IA-2 et de la fluorescence rouge exprimé par la cellule réceptrice codéposés (figure 5B).

6. Les résultats représentatifs

Imposées signaux électriques peuvent créer des micro-environnements localisées (par exemple, des champs et des gradients) à proximité d'une surface d'électrode et ces stimuli peut déclencher l'auto-assemblage des polysaccharides tels que l'alginate et le chitosane à déposer un film d'hydrogel sur la surface d'électrode. Parce que tson transition sol-gel a lieu à la surface d'électrode, le film résultant est electroaddressed, avec sa géométrie correspondant au motif d'électrode (1B figures, 3C). Films biocompatibles tels que l'alginate et de chitosane fournir des surfaces qui peuvent être fonctionnalisés avec des composants biologiques. Utilisation de l'alginate, des populations de cellules uniques ont été codéposé à des adresses distinctes. Preuve de leur electroaddressment sont observés lors de l'interaction entre l'expéditeur et le récepteur population de cellules. La molécule autoinducteur-2 (IA-2) diffuse à partir des cellules d'expéditeur et est absorbé par les cellules réceptrices, entraînant l'expression de la protéine fluorescente rouge DsRed (figure 2A). Dans la figure 2B, la fluorescence rouge est observée uniquement à l'électrode où les récepteurs sont adressées.

Les groupes amine présents sur le chitosane lui fournir la réactivité du pH nécessaire pour électrodéposition ainsi que d'une surface appropriée pour une fonctionnalisation. Nousutilisé ces propriétés uniques par voie électrochimique conjuguer le oxydase de glucose biodétection (GOx) à électrodéposé chitosane films. Cette enzyme présente ensuite la capacité de détection de glucose par le biais d'une réaction enzymatique (figure 4A) production de peroxyde d'hydrogène qui peut ensuite être oxydé électrochimiquement pour produire un courant de sortie. De cette manière, un signal chimique peut être transduit à la figure électrique. 4B montre que les films dans lesquels GOx est électrochimiquement conjugué produire un signal de forte anodique en présence de glucose par rapport à ces films contenant pas GOx. Ces résultats indiquent GOx peut être monté sur un film déposé le chitosane et peut conserver son activité catalytique. En outre, figure 4C représente une étape augmentation de courant anodique produit en réponse à l'augmentation des concentrations de glucose. La courbe standard également présent dans la figure 4C montre que les augmentations des beaux-procédé dans un fas quasi linéaireHion dépend de la quantité de glucose ajouté. Ces résultats montrent que l'enzyme conserve également sa sensibilité à l'augmentation des concentrations de glucose sur la conjugaison du film chitosane. La limite inférieure de détection n'a pas été étudié ici comme il a déjà été caractérisé pour ce système dans l'œuvre de Meyer et al. Al.

On a également ont montré l'immobilisation covalente d'une enzyme d'intérêt, de manière à contenir une personnalisé penta-tyrosine étiquette, sur le chitosane de façon enzymatique contrôlée. Plus précisément, ce processus est médié par l'enzyme tyrosinase. Comme le montre par le régime sur la figure 5A (supérieure), une enzyme, AI-2 synthase comprend une balise penta-tyrosine. Tyrosinase agit sur ​​l'étiquette la tyrosine, l'oxydation des groupes les résidus des phénols à O-quinones, qui a ensuite covalente se lient à des amines de chitosane de. Preuve de fonctionnalisation du film chitosane avec la synthase AI-2 par la tyrosinase assemblage est observé dans la figure 5B (figure 5A (inférieure)). Fluorescence rouge des cellules réceptrices (Figure 5B) montre à nouveau une interaction entre les adresses en raison de la diffusion de l'IA-2 de l'un à l'autre, et indique en outre que les enzymes immobilisées au chitosane conservent l'activité d'une fois lié de manière covalente.

Figure 1
Figure électrodéposition alginate 1.. (A) électrodéposition d'alginate de Mécanisme: Comme une électrode est polarisée anodiquement, électrolyse de l'eau se produit à sa surface, générant un pH localisée de faible. Des particules de carbonate de calcium réagir avec l'excédentde protons, libérant cations calcium que les particules se dissolvent. En présence de chaînes polymères d'alginate, les ions deviennent chélaté dans une "eggbox" réseau, formant un hydrogel réticulé à l'électrode. Comme la distance entre les électrodes augmente, l'alginate a une plus grande tendance à rester en solution en raison de la présence réduite des ions calcium. (B) Une forme de L ITO à motifs d'électrode a été utilisé à l'alginate de dépôt électrolytique. Un puits a été PDMS fixé à l'électrode de contenir un alginate vert marquage fluorescent (1%) et CaCO 3 (0,5%) solution de dépôt. Après électrodéposition pendant 2 min. une densité de courant de 3 A / m 2, l'hydrogel a été alginate electroaddressed imagée par microscopie de fluorescence.

Figure 2
Figure 2. Codépôt des populations de cellules. L'interaction Scheme (A) montrant entre deux E. Les souches de E.: Une population produit autoinducteur-2 (AI-2), Une molécule de signalisation, et est appelé "AI-2 expéditeur." L'autre population, appelée «AI-2 du récepteur," est un journaliste de l'IA-2; lors de la réception de l'IA-2 par la diffusion de l'expéditeur, il exprime la protéine fluorescente rouge DsRed. (B) image de fluorescence rouge de la paire d'électrodes avec la population AI-2 expéditeur codéposé avec de l'alginate sur l'électrode gauche et AI-2 de la population récepteur codéposé avec de l'alginate sur l'électrode droite. La vue agrandie montre l'expression de la DsRed seuls les récepteurs AI-2.

Figure 3
Figure 3. Électrodéposition Chitosan. (A) Schéma montrant l'électrodéposition pH-dépendante de chitosane. Électrolyse de l'eau à une électrode cathodique polarisée provoque un pH élevé localisée (représenté par un changement de couleur localisée d'un colorant indicateur de pH près de la cathode sur la photographie) qui stimule la transition sol-gel de chitosane dans cette région. (B) Les amines présentes sur le chitosane donner it pH-sensibles propriétés. Un pH supérieur à 6,3 (pKa de chitosane) les amines sont déprotoné, facilitant le passage de sa forme protonée soluble dans sa forme de gel insoluble. (C) une électrode en or à motifs a été utilisé pour dépôt électrolytique chitosane. L'électrode, reliée à la cathode à l'alimentation électrique, a été immergé dans une verte à marquage fluorescent chitosane (0,8%) solution de dépôt. Après électrodéposition pendant 2 min. une densité de courant de 4 A / m 2, le film electroaddressed chitosane a été imagé par microscopie de fluorescence.

Figure 4
Figure 4. Transduction électrochimique d'un film fonctionnalisé chitosane. (A) Schéma montrant la mise en place d'un système à trois électrodes. Fonctionnalisé film de chitosane sert comme électrode de travail, un fil de platine en tant que contre-électrode et Ag / AgCl que l'électrode de référence. Transduction électrochimique du produit du glucose à travers ee réactions enzymatiques et électrochimique indiquées lorsque le peroxyde d'hydrogène produit peut être oxydé et détecté à l'électrode de travail. (B) cyclique voltammagram (CV) à l'électrode par un film de chitosan contenant la glucose-oxydase électrochimiquement conjugué (GOx) montre un signal fort anodique dans une solution de glucose à 5 mM. Un film ne contenant pas de GOx a servi de témoin et affiché aucun signal dans la même solution. (C) une courbe standard entre le courant anodique et la concentration de glucose présente une relation linéaire à proximité de (a augmenté chaque aliquote la concentration en glucose de 4 mM et également augmenté l'amplitude du courant dans le graphe encart d'une manière par étapes).

Figure 5
Figure 5. Fonctionnalisation des protéines à l'aide de montage enzymatique. (A, supérieure) Schéma montrant la tyrosine-étiqueté "AI-2 synthase» étant covalente attaché à un film de chitosan par l'assemblée tyrosinase. Les résidus de tyrosine devenir OxidIzed à O-quinones par l'action de la tyrosinase et peut réagir avec les groupes amine sur le film de chitosan, la formation d'une liaison covalente. (A, inférieure) Le Synthase AI-2 génère AI-2 à partir d'un substrat (SAH), les cellules réceptrices de la signaler généré AI-2 par l'expression de fluorescence DsRed. (B) images de fluorescence montrant un film chitosane sur l'or, fonctionnalisé avec bleu marqué AI-2 synthase. Côte à côte, AI-2 cellules réceptrices sont codéposés avec de l'alginate d'ITO. Après addition du substrat enzymatique pour le bien et l'incubation, les cellules réceptrices AI-2 Express DsRed.

Discussion

Nos procédures de démontrer l'électrodéposition et la fonctionnalisation des films en biopolymère, un processus que nous appelons biofabrication. Grâce à fonctionnalisation avec des cellules et des biomolécules on crée des surfaces biologiques capables d'interagir les uns avec les autres et l'électrode d'adressage sont assemblés sur. La première étape, l'électrodéposition, a lieu à travers l'auto-assemblage a déclenché des biopolymères, de l'alginate et de chitosane dans nos études, en réponse à un signal électrique. Comme indiqué précédemment un gradient de pH est généré qui peut être commandé par la densité de courant et le temps de dépôt, fournir un contrôle supplémentaire sur les dimensions des films et des propriétés 6,17. Nous avons trouvé qu'une variété de densité de courant et les combinaisons de temps de dépôt peut être utilisé pour les électrodes indiquées dans le tableau 1. Bien que l'utilisation d'autres électrodes est possible, des ajustements à la procédure serait nécessaire. En comparaison avec d'autres techniques de formation d'un film sur le processus de electrodeposition est simple, rapide et réactif,. Il n'y a pas besoin d'un vaste répertoire de matériel coûteux et des préparations laborieuses. Surtout, le processus peut résister à des écarts mineurs expérimentales et peut être facilement commencé plus si un problème survient.

Le chitosane est capable de répondre à un gradient de pH cathodique élevé en raison de propriétés fonctionnelles importantes qui lui sont conférées par une teneur élevée des amines primaires. À un pH élevé (supérieur à son pKa de 6,3 ~) les amines sont déprotoné et le chitosane devient insoluble, ce qui permet la formation du film. Après dépôt, les films resteront attachés à l'électrode. Toutefois, la capacité existe pour les décoller si vous le souhaitez. Les films reste stable aussi longtemps que le pH de la solution ne chute pas en dessous du pKa. Solutions acides protoner les amines et les répulsions électrostatiques ultérieures gonfler le gel jusqu'à ce qu'il se dissout 18. Autrement dit, le processus de montage / démontage est réversible à la demande et allows pour l'enlèvement des films déposés et la réutilisation des électrodes. Idéalement, la gamme de pH à laquelle la transition sol-gel a lieu est proche de celui dans lequel les composants les plus biologiques fonctionner de manière optimale. Cela rend le processus idéal pour la conservation de la fonctionnalité lors de l'assemblage 6.

Formation d'un film d'alginate est facilitée par l'électrolyse anodique de l'eau ainsi que la présence de carbonate de calcium 7. Le pH faible localisée à l'anode solubilise le carbonate de calcium conduisant à des cations calcium libération. Ces ions sont chélaté par l'alginate, formant un réseau réticulé sur la surface d'électrode. Des films d'alginate sont notamment réversible par compétition pour des ions calcium à partir de composés chélatants tels que l'EDTA ou du citrate, qui peuvent être utilisés pour dissoudre les films, permettant la réutilisation des électrodes sous-jacentes. Ainsi, les films d'alginate sont relativement fragiles lorsqu'ils sont soumis à des conditions physiologiques, car les ions calcium sont facilement scavenged de la matrice de gel, ce qui affaiblit sa structure et la promotion du film délamination ou redissolution. Pour surmonter cette limitation, nous avons inclus une étape d'incubation pour le film en 1 M CaCl 2 à renforcer le gel. En outre, nous recommandons que la solution d'incubation du film (milieux cellulaires, etc) être complétée par CaCl 2 à une concentration de 500 uM-3 mM.

La procédure deuxième grande est la fonctionnalisation du film déposé avec les composants biologiques. Ceci peut être réalisé de deux façons, la première étant de conjugaison électrochimique, une stratégie qui permet de montage rapide et réactif, avec des protéines de contrôle du territoire exceptionnelle de 10. Cependant, fonctionnalisation de cette manière est limitée par la diffusion de Cl - ions à travers le film à l'électrode ainsi que la diffusion de HOCl, l'réactive générée intermédiaire, retourner dans la solution. La capacité des molécules électrochimiquement actifs afin de transmettreà travers le film permet pour la transduction de signaux chimiques et biologiques dans le facile à lire des signaux électriques 15. Nous avons montré la tyrosinase médiée couplage comme une deuxième stratégie pour la fonctionnalisation enzyme au chitosane, démontré par liaison covalente AI-2 synthase. Cette stratégie permet au processus de fonctionnalisation d'être contrôlée et sélective - dépend d'un réactif spécifique, la tyrosinase, qui agit de façon discriminatoire sur les protéines contenant un tag tyrosine 9.

Nous montrons l'utilité et la biocompatibilité des systèmes multi-adresses en reproduisant les voies naturelles sur une puce. D'abord, nous avons organisé deux populations cellulaires (ie "expéditeurs" et "récepteurs") à des adresses distinctes, et a montré que leur interaction entre les électrodes adjacentes pour fournir AI-2 et de générer une réponse de fluorescence. Ce concept a également été démontrée par Cheng et al. dans une puce 14 microfluidique. Nous avons également imité l'interaction, mais plutôt utiliséune enzyme pour synthétiser IA-2 pour la livraison. De cette manière, une voie de synthèse intracellulaire, AI-2 de synthèse, a été reproduit par le biais biofabrication et fonctionnait beaucoup comme il le ferait dans une solution.

Dans les deux cas, l'assemblage de plusieurs adresses présente le défi d'éviter la non-spécifiques de liaison entre les adresses parce que chaque solution de dépôt doit être présenté à la matrice d'électrodes ensemble, même si électrodéposition est uniquement destiné à une seule adresse. Le lavage doux et en profondeur peut révoquer la majorité de la solution résiduelle de non-biaisées électrodes; l'utilisation de l'écoulement dans les canaux microfluidiques peut réduire encore davantage la non-spécificité. En particulier pour l'biofabrication adjacente de chitosane et des adresses d'alginate, il est recommandé le dépôt du film de chitosan première suite de cela avec les étapes biofonctionnalisation, et après cela, l'alginate de dépôt électrolytique. Bien que nous n'avons pas fait ici, nous avons découvert que le blocage du film chitosane avec des protéines inertes (comme milk, BSA, etc) diminue fortement non-spécifiques de liaison de molécules indésirables à la surface aminée de chitosane.

Nous avons trouvé une utilité dans l'établissement électrodes à motifs, on retrouve souvent dans les dispositifs BioMEMS, comme les «Blueprints» pour un arrangement complexe de cellules et des biomolécules. Les utilisations de chitosane électrodéposé dans les dispositifs bioMEMS peut aller bien au-delà des exemples cités ici 19. Chitosan peut être déposée sur différentes géométries microscopique, tels que dans des microcanaux et sur ​​des surfaces non planes 20,15. Les films peuvent également être modifiées avec d'autres polymères et une variété de protéines, l'ADN, les nanoparticules, et d'oxydo-réduction des molécules actives pour 21,22,23 de nouvelles propriétés. Dans les dispositifs BioMEMS, films de chitosane ont été utilisés pour la livraison de drogue, la détection de molécules redox et petite, la biocatalyse, et les études de cellules 20,23,24,25. De même, l'alginate est largement utilisé comme une matrice de cellules-piège et a été explorée pour le confinement fluidique réversible depopulations de cellules et dans le film-immunoanalyse 26,27,28. Des films composites pour les applications d'ingénierie tissulaire ont été fabriqués en utilisant électrodéposition alginate, avec des composants tels que l'hydroxyapatite pour implants orthopédiques 29.

Dans nos manifestations de biofabrication, nous avons montré à la fois les interactions entre les composantes biologiques et à travers l'interface bio-électronique pour être également applicable, ce qui met en arriver à la perspective de l'intégration de toutes les variétés d'interactions pour une performance sophistiquée dans la transmission du signal sur la puce. En conséquence, biofabrication peut faciliter la fabrication de dispositifs à une réduction des "tailles minimales métrages" en tant que suite directe à l'évolution rapide de la microfabrication, comme souvent motivés par l'électronique grand public. C'est, next-génération d'appareils pourrait en fait inclure des composants biologiques labiles qui offrent ensemble exquis de la nature et les capacités de reconnaissance sur une longueur encore plus petit scales plus artificielles systèmes. Nous envisageons à court terme des applications dans l'instrumentation analytique, les capteurs environnementaux, et même biocompatibles implantables.

Disclosures

La production et l'accès gratuit à cet article est sponsorisé par l'Agence américaine de défense des États réduction de la menace.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le financement de DTRA pour le soutien de ce manuscrit et de l'ONR, DTRA, et la NSF pour le soutien partielle de la recherche sous-jacente.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Power Supply Keithley SourceMeter 2400
Three electrode potentiostat CH Instruments Potentiostat/Galvanostat 600D
RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector BASi MF-2052
Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation custom fabricated
Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist Sigma-Aldrich 578274
Platinum sheet/foil (0.002 in) Surepure Chemetals 1897
Slim Line 2" Alligator Clips RadioShack 270-346
Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord TSElectronic B-36-02 B-24-02
SYLGARD 184 silicone elastomer kit Dow Corning NC9020938 From Fischer
Fluorescecence stereomicroscope Olympus Corporation MVX10 MacroView
cellSens Standard Olympus Corporation version 1.3
Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.
Chitosan, medium molecular weight Sigma-Aldrich 448877
Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade VWR international BDH3030
Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N VWR international VW3247
Alginic acid, sodium salt Sigma-Aldrich 180947
Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles Speciality Minerals Inc. 100-3630-3
Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.
Calcium chloride, dihydrate J.T. Baker 0504
Sodium Chloride, Certified ACS crystalline Fischer Scientific S271
Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous Sigma-Aldrich P9791
Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous Sigma- Aldrich P3786
Phosphate Buffered Saline Sigma- Aldrich P4417
Table 3. Other solution components and buffer reagents.
Glucose oxidase from aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Tyrosinase from mushroom Sigma-Aldrich T3824
LB broth, Miller (granulated) Fischer Scientific BP9723-2
"AI2-Synthase" (HGLPT) Lab stock 16
W3110 wildtype cells Lab stock 30
MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells Lab stock 30
FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 Invitrogen F8765
5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 Invitrogen C-6157
DyLight antibody labeling kit, 405 Thermo Fisher Scientific, Inc. PI-53020
Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.

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References

  1. Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
  2. Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
  3. Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
  4. Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
  5. Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
  6. Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
  7. Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
  8. Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
  9. Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
  10. Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
  11. Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
  12. de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
  13. Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
  14. Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
  15. Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
  16. Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
  17. Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
  18. Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
  19. Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
  20. Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
  21. Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
  22. Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
  23. Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
  24. Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
  25. Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
  26. Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
  27. Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
  28. Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
  29. Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
  30. Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).

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Gordonov, T., Liba, B., Terrell, J.More

Gordonov, T., Liba, B., Terrell, J. L., Cheng, Y., Luo, X., Payne, G. F., Bentley, W. E. Bridging the Bio-Electronic Interface with Biofabrication. J. Vis. Exp. (64), e4231, doi:10.3791/4231 (2012).

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