Summary
מאמר זה מתאר גישה biofabrication: בתצהיר של גירויים, תגובה סוכרים בנוכחות אלקטרודות משוחדים ליצור סרטים ביולוגית אשר יכולה להיות פונקציונליות עם תאים או חלבונים. אנחנו מדגימים אסטרטגיה הספסל העליון לדור של סרטים כמו גם השימושים הבסיסיים ליצירת משטחים biofunctionalized אינטראקטיביים עבור מעבדה על שבב יישומים.
Abstract
התקדמות ההבטחה על שבב מעבדת הטכנולוגיה לחולל מהפכה גם מחקר ורפואה באמצעות עלויות נמוכות יותר, רגישות יותר, ניידות, ותפוקה גבוהה יותר. שילוב של רכיבים ביולוגיים על גבי מערכות מיקרו ביולוגיים (BioMEMS) הראה פוטנציאל רב להשגת מטרות אלה. שבבים אלקטרוניים Microfabricated לאפשר מיקרומטר בקנה מידה תכונות, כמו גם חיבור חשמל עבור חישה actuation. רכיבים ביולוגיים פונקציונלית לתת למערכת יכולת זיהוי ספציפי של analytes, פונקציות אנזימטיות, וכן כל תא ויכולות. Microfabrication תהליכים סטנדרטיים ביו טכניקות אנליטיות כבר נוצלו בהצלחה במשך עשרות שנים בענפי מחשב ביולוגי, בהתאמה. שילוב שלהם ממשק בסביבת מעבדה על שבב, לעומת זאת, מביאה אתגרים חדשים. יש קריאה טכניקות שיכולות לבנות ממשק בין האלקטרודה ו compon הביולוגיאף אוזן גרון, כי היא קלה קל לפברק דפוס.
Biofabrication, המתוארת כאן, היא אחת הגישות כך הראו הבטחה גדולה התאגדותה קל להרכיב רכיבים ביולוגיים עם צדדיות של פונקציות על שבב המופעלים. Biofabrication משתמש בחומרים ביולוגיים ומנגנונים ביולוגיים (הרכבה עצמית, הרכבה האנזימטית) להרכבה מלמטה למעלה היררכי. בעוד המעבדות שלנו הוכיחו את המושגים האלה בפורמטים רבים 1,2,3, כאן אנחנו מדגימים את תהליך ההרכבה מבוסס על electrodeposition ואחריו מספר יישומים של האות מבוססי אינטראקציות. תהליך ההרכבה כולל electrodeposition של גירויים, תגובה סרטים ביולוגית פולימר על אלקטרודות functionalization הבאים שלהם עם מרכיבים ביולוגיים כמו DNA, אנזימים, או תאים חיים 4.5. Electrodeposition מנצל את מפל pH נוצר על פני השטח של האלקטרודה מוטה מן אלקטרוליזהמים 6,7,. Chitosan ו אלגינט הם גירויים תגובה פולימרים ביולוגיים שניתן מופעלות עצמית יותך סרטים הידרוג'ל בתגובה לאותות חשמליים הטילה 8. עובי של הידרוג אלה נקבעת על ידי המידה בה שיפוע pH משתרע בין האלקטרודה. זה יכול להיות שונה באמצעות צפיפויות שונות הנוכחית ושעות בתצהיר 6,7. פרוטוקול זה יתאר כמה סרטים chitosan מופקדים ו פונקציונליות ידי קוולנטית מצרף מרכיבים ביולוגיים לקבוצות שפע אמין העיקריים הקיימים על הסרט בין אם באמצעות שיטות אנזימטיות או אלקטרוכימי 9,10. סרטים אלגינט ו מלכודת שלהם תאים חיים גם להתייחס 11. לבסוף, תוכנית השירות של biofabrication מודגם באמצעות דוגמאות של אינטראקציה המבוססת על אותות כימיים, כולל אל חשמלי, תא תא אל, וגם אנזים אל התא אות השידור.
שניהם electrodepositionו functionalization יכול להתבצע תחת תנאים פיזיולוגיים כמעט ללא צורך ריאגנטים ובכך לחסוך רכיבים ביולוגיים יציב ממצבים קשים. בנוסף, הן chitosan ו אלגינט כבר זמן רב למטרות ביולוגית הרלוונטיים 12,13. בסך הכל, biofabrication, טכניקה מהירה שיכולה להתבצע רק על benchtop, יכול לשמש ליצירת בקנה מידה מיקרון דפוסים של רכיבים ביולוגיים תפקודית על אלקטרודות והוא יכול לשמש עבור מגוון רחב של מעבדה על שבב יישומים.
Protocol
1. אלגינט electrodeposition
- חיבור ספק הכוח האלקטרודות מפוברק מותאמים אישית באמצעות מיתרי תיקון באמצעות קליפים תנין. תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) מכוסה שקופיות הזכוכית ישמש האנודה (האלקטרודה עבודה) ואת רדיד פלטינה ישמש הקתודה (אלקטרודה נגדית). מקם את האלקטרודות כך את פני השטח איטו כדי להיות פונקציונליות מתנגד האלקטרודה הדלפק ממוקם אנכית או להיות טבל פתרון כזה או אופקית כי הפתרון בתצהיר מוכל על פני השטח.
- הכן פתרון בתצהיר אלגינט על ידי ערבוב אלגינט 1% ו -0.5% CaCO 3 (לפי משקל) במים מזוקקים ואחר כך מעוקר פתרון. מומלץ ברציפות מערבבים את הפתרון כאשר אינו בשימוש.
- להטביע את שתי אלקטרודות לתוך פתרון בתצהיר. אלגינט בשימוש עשוי להיות מתויג fluorescently עם FluoroSpheres (Invitrogen), על פי צ'נג et al. 14, כדי לאפשר fluorescenCE הדמיה של הסרט שנוצר.
- החל צפיפות זרם קבוע (3 / m 2) במשך 2 דקות, מתח ישתנה בטווח של 2-3 V.
- נתק את האלקטרודה ולהסיר את הפתרון לא הופקד. בעדינות ולשטוף את הסרט עם NaCl (0.145 מ ') להסיר אלגינט מיותרת.
- דגירה קצרה על הסרט (~ 1 דק ') ב CaCl 2 (0.1 מ') כדי לחזק את הג'ל. יש לשטוף עם NaCl (0.145 מ ') ו דגירה בפתרון הרצוי השלימו עם CaCl 2 (1 מ"מ).
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (1B איור).
2. שיקוע אלקטרוכימי של אוכלוסיות תאים מתקשרים ב אלגינט
- אות השולח תרבית תאים (W3110 WT E. coli), גדל בתקשורת LB, ותרבות אות מקלט תאים (MDAI2 + pCT6-lsrR - מגבר R + PET-dsRed - קן R), גדל בתקשורת ליברות + 50 מיקרוגרם / מ"ל כל אחד kanamycin ו ampicillin, יש גדל בן לילהND מחדש מחוסן לצמיחה צפיפות אופטית (ב 600 ננומטר) של 1. התאמת צפיפות אופטית של התרבות התא המקבל את 0.4-0.6 עם LB לפני השימוש.
- הכן פתרון בתצהיר של אלגינט 2% ו -1% CaCO 3, ומערבבים עם תרבות כל תא ביחס 1:01 לריכוז הסופי של אלגינט 1%, 0.5% CaCO 3, עם תאים בדילול לצפיפות של כ 1/2 צפיפות culturing.
- השתמש שקופיות זכוכית עם הדפס של שתי אלקטרודות איטו מכילה polydimethylsiloxane (PDMS) גם (מוכן על פי הוראות Sylgard וחותכים לגודל הרצוי) ו אלקטרודה נגדית פלטינה. חבר 1 האלקטרודה איטו לספק כוח עם פלטינה כמתואר נוהל 1 (electrodeposition אלגינט).
- לטבול את האלקטרודות בתמיסה בתצהיר המכיל תאים מקלט. הגדר את ספק הכוח הנוכחי מתמדת בצפיפות של 3 / m 2, שם מימד שטח מוגדר על ידי אלקטרודה אחת שעליה deposition תתרחש.
- החל הנוכחי במשך 2 דקות, כדי לאפשר שיקוע אלקטרוכימי של התאים מטריקס אלגינט.
- יש לשטוף את הסרט כפי שמתואר בשלב 1.5.
- לעבור את הקשר anodic כדי האלקטרודה 2, סמוך איטו.
- לחזור על התהליך בתצהיר (שלבים 2.4 - 2.7), אבל הפעם מציגה תמיסה המכילה את התאים השולח.
- דגירה שבב 2-אלקטרודה המכילה תאים codeposited וסידן אלגינט, לילה ב 37 מעלות צלזיוס פוספט בופר סליין (PBS) השלימו עם התקשורת ליברות 10% ו 1 מ"מ CaCl 2.
- לאחר מכן, הדגירה התמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 ב).
3. Chitosan electrodeposition
- חבר את ספק הכוח האלקטרודות באמצעות קליפים תנין. שבב סיליקון מצופה זהב ישמש הקתודה (האלקטרודה עבודה) ואת רדיד פלטינה ישמש אנודה (אלקטרודה נגדית). מיקום אלקטרודות על פני השטח של זהב ולכן העל זה מתנגד האלקטרודה הדלפק הן ממוקמות גם אנכית להיות טבל פתרון כזה או אופקית כי הפתרון בתצהיר נכלל על פני השטח.
- הכן פתרון chitosan על ידי ערבוב chitosan פתיתי למים ולאט לאט מוסיפים 2 M HCl לפזר את סוכרים (pH 5.6 הסופי), כדי לוודא לבצע את ההליך המתואר על ידי מאיר ואח'. 15.
- הנח את האלקטרודות לתוך פתרון chitosan (0.8%), לחלוטין הצללה באזור הרצוי להפקדה. בשימוש chitosan יכול להיות מתויג fluorescently עם 5 - (ו -6), carboxyrhodamine 6G succinimidyl אסתר (Invitrogen), לפי וו ואח' 8, לתמונה הסרט electrodeposited על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי..
- החל צפיפות זרם קבוע (4 / m 2) במשך 2 דקות. המתח ישתנה בטווח של 2-3 V. חשב את צפיפות הזרם כפונקציה של שטח הפנים של האלקטרודה זהב עובד חשוף deposition פתרון.
- יש לשטוף את האלקטרודה במים DI להסיר מיותר chitosan. השבב ניתן לאחסן מים או PBS (10 מ"מ, ה-pH 7.0).
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 3 ג).
4. אלקטרוכימי פרידמן וקיבל הד עולמי עם הסרט Chitosan פונקציונליות
- Codeposit chitosan וגלוקוז אוקסידאז (GOx) מפתרון (1% chitosan, 680 U / mL GOx, pH 5.6) בשעה הצפיפות הנוכחית של 4/2 מ 'על האלקטרודה בדוגמת פי נוהל 3 (electrodeposition Chitosan). הסרט chitosan במלכוד של GOx יופק.
- חבר את האלקטרודה התייחסו למערכת אלקטרודה תלת כמו אלקטרודה העבודה, חוט פלטינה האלקטרודה הנגדית ו Ag / AgCl כמו אלקטרודה התייחסות, כפי שמתואר באיור 4 א.
- לטבול את האלקטרודות לתוך פתרון פוספט חיץ (0.1 מ ', pH 7.0) המכילה NaCl (0.1 מ').
- Electrochemically להטות את החלבון כדי chitosanהסרט ידי הפעלת מתח חשמלי קבוע (0.9 V) עבור ה -60 באמצעות chronoamperometry 10.
- מניחים את השבב במאגר פוספט (0.1 מ ', pH 7.0) ולשטוף במשך 10 דקות על שייקר מסלולית כדי להסיר כל GOx NaCl ו unconjugated unreacted.
- שוב לצרף למערכת אלקטרודה תלת כמתואר בשלב 4.2 לטבול לתוך תמיסה של גלוקוז 5 מ"מ. שימוש voltammetry מחזורית, לטאטא את הפוטנציאל בכיוון חיובי 0.7 V. השתמש הסרט השליטה המכילה גלוקוז אוקסידאז אין כמו השוואה של כמות חמצון לראות תנופה (איור 4B).
- להסיר את האלקטרודות פתרון גלוקוז ולשטוף עם חיץ פוספט (0.1 מ ', pH 7.0) ואז למקם את האלקטרודות לתוך הכוס 10 מ"ל המכיל 8 מ"ל של חיץ פוספט (0.1 מ', pH 7.0). הטיה שבב GOx פונקציונליות כדי V 0.6 לשמש אלקטרודה העבודה (איור 4C).
- הוסף aliquots של גלוקוז למאגר (aliquot זה מעלה את ריכוז הגלוקוז על ידי4 מ"מ).
- יצירת תקן בין עקומת זרם המצב היציב ואת ריכוז הסוכר לסרט chitosan GOx פונקציונליות.
5. חלבון functionalization שימוש העצרת אנזימתי
- השתמש שקופיות זכוכית עם הדפס זהב סמוך האלקטרודה איטו בתוך היטב PDMS. הטיית האלקטרודה זהב עם פוטנציאל קתודית כדי electrodeposit chitosan כמוצג בעבר. יש לשטוף את הסרט לזמן קצר במים DI ואז PBS על ידי פיפטה.
- הוספת הפתרון של 3 מיקרומטר כחולים שכותרתו fluorescently "AI-2 synthase" 16 (באמצעות ערכת תיוג DyLight) + 100 U / mL טירוסינאז ב PBS.
- דגירה של H 1 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את הסרט עם PBS.
- החל פוטנציאל anodic אל האלקטרודה איטו כדי codeposit בתצהיר אלגינט תמיסה המכילה תאים מקלט (מוכן כמו בשלבים 2.1-2.2). בצע את שלבים של 2.3-2.6 נוהל 2 (שיקוע אלקטרוכימי של אוכלוסיות תאים אלגינט).
- כדי ליצורהאות המשודר (AI-2) enzymatically, לאחר שטיפה הסרטים להוסיף פתרון של הומוציסטאין 500 מיקרומטר S-adenosyl (אדון) ב PBS, השלימו עם LB מדיה 10% ו - 1 מ"מ CaCl 2. מכסים את האלקטרודות על מנת למנוע אידוי של הפתרון ו דגירה לילה ב 37 ° C. זה יאפשר לתשובה התא המקבל על ידי יצירת חלבון פלואורסצנטי אדום (dsRed).
- אלקטרודות סמוכות ניתן צילמו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ידי התאמת המסננים כדי ללכוד את הקרינה הכחול של synthase AI-2 ו פלואורסצנטי אדום הביע את התאים מקלט codeposited (5 ב איור).
6. נציג תוצאות
אותות חשמליים המוטלות יכול ליצור microenvironments מקומיים (למשל, שדות מילויים) ליד משטח האלקטרודה גירויים אלה יכולים לעורר את הרכבה עצמית של סוכרים כגון אלגינט ו chitosan להפקיד כסרט הידרוג על פני האלקטרודה. כי לאהמעבר סול ג'ל שלו מתרחשת על פני האלקטרודה, הסרט שנוצר electroaddressed, עם הגיאומטריה שלו תואמות את הדפוס האלקטרודה (1B דמויות, 3 ג). סרטים ביולוגית כגון אלגינט ו chitosan לספק משטחים שניתן פונקציונליות עם מרכיבים ביולוגיים. שימוש אלגינט, אוכלוסיות תאים ייחודיים כבר codeposited על כתובות שונות. עדות electroaddressment שלהם הוא ציין על האינטראקציה בין השולח לבין האוכלוסייה התא המקבל. מולקולה autoinducer-2 (AI-2) מפזרת מן התאים השולח לבין הוא נלקח על ידי התאים מקלט, והתוצאה היא ביטוי של חלבון dsRed ניאון אדום (איור 2 א). באיור 2 ב, אדום הקרינה הוא ציין רק עם אלקטרודה שבה מקלטי מטופלות.
קבוצות האמין הנוכחי על chitosan לספק לה היענות pH נדרש electrodeposition כמו גם משטח מתאים functionalization. אנושימוש אלה מאפיינים ייחודיים של electrochemically ומטים גלוקוז biosensing האנזים מונואמין (GOx) כדי electrodeposited chitosan סרטים. אנזים זה ואז מספק את היכולת לגילוי של גלוקוז דרך התגובה האנזימטית (איור 4 א) לייצר מי חמצן אז מה שיכול להיות מחומצן electrochemically להפיק פלט הנוכחי. באופן זה, האות הכימי ניתן transduced לדמות ברקים. 4B מראה כי סרטים שבהם היה GOx מצומדות electrochemically לייצר אות anodic חזק בנוכחות גלוקוז, לעומת הסרטים האלה מכילים לא GOx. תוצאות אלו מצביעות על GOx ניתן להרכיב על גבי הסרט chitosan שהופקדו וישמור על פעילות קטליטית. יתר על כן, איור 4C מראה שלב הגידול הנוכחי anodic המיוצר בתגובה ריכוזי גלוקוז הגדלת. עקומת תקן נוכח גם 4C איור מראה כי החורגים עולה המשיך ב FAS ליניארי לידhion תלוי בכמות של גלוקוז הוסיף. תוצאות אלו מראות כי האנזים גם שומרת על רגישותו הגדלת ריכוזי גלוקוז עם נטיה לצלם chitosan. הגבול התחתון של זיהוי לא למד כאן כפי התאפיינה בעבר בעבודה של מאייר et עבור מערכת זו. אל.
כמו כן, אנו הוכיחו immobilization קוולנטי של האנזים של עניין, מתוכנן להכיל תג מותאם אישית סם אמת טירוזין, כדי chitosan באופן enzymatically מבוקר. באופן ספציפי, תהליך זה מתווך על ידי האנזים טירוסינאז. כפי שמתואר על ידי תוכנית ב ציור 5a (העליון), אנזים, AI-2 synthase כולל תג סם אמת טירוזין. טירוסינאז פועל על תג טירוזין, חמצון קבוצות פנול של שאריות ל O-קינונים, אשר לאחר מכן קוולנטית נקלטות על ידי אמינים של chitosan. עדות functionalization הסרט chitosan עם synthase AI-2 על ידי טירוסינאז הרכבה הוא ציין איור 5 ב (ציור 5a (נמוך)). הקרינה האדום של תאים מקלט (איור 5 ב) מוכיח שוב האינטראקציה בין כתובות עקב דיפוזיה של AI-2 מן האחד אל השני, עוד עולה כי אנזימים משותקת chitosan כדי לשמור על פעילות אחת קשורה קוולנטית.
באיור 1. Electrodeposition אלגינט. (א) מנגנון electrodeposition אלגינט: כמו אלקטרודה מוטה anodically, אלקטרוליזה המים מתרחשת על פני השטח שלו, ליצור pH נמוך מקומי. חלקיקי סידן קרבונט להגיב עם העודףשל פרוטונים, משחררת קטיוני סידן כמו חלקיקים נמסים. בנוכחות של שרשראות הפולימר אלגינט, היונים הופכים לטיפולי קלאציה ב רשת "eggbox", ויצרו הידרוג crosslinked על האלקטרודה. כמו המרחק בין העליות אלקטרודה, אלגינט יש נטייה גדולה יותר להישאר פתרון בשל נוכחותם מופחת של יוני סידן. (ב) אלקטרודה בצורת בדוגמת איטו שימש אלגינט electrodeposit. PDMS גם היה מקובע האלקטרודה להכיל אלגינט fluorescently שכותרתו ירוק (1%) ו - CaCO 3 (0.5%) הפתרון בתצהיר. לאחר electrodepositing דקות 2. בצפיפות זרם של 3A / m 2, הידרוג אלגינט electroaddressed היה צילמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
איור 2. שיקוע אלקטרוכימי של אוכלוסיות תאים. () תוכנית המציגה אינטראקציה בין 2 א ' קולי זנים: האחד האוכלוסייה מייצרת autoinducer-2 (AI-2), מולקולת האיתות, והוא כינה "AI-2 השולח." אוכלוסייה אחרת, המכונה "AI-2 מקלט", הוא כתב של AI-2, עם קבלת AI-2 על ידי דיפוזיה מהשולח, הוא מבטא חלבון פלואורסצנטי אדום dsRed. (ב) תמונת האדום הקרינה של זוג אלקטרודות עם האוכלוסייה AI-2 השולח codeposited עם אלגינט על האלקטרודה שמאל AI-2 האוכלוסייה מקלט codeposited עם אלגינט על האלקטרודה הנכון. תצוגה מוגדלת מדגים את הביטוי של dsRed רק את AI-2 מקלטים.
איור 3. Electrodeposition Chitosan. () תוכנית המציגה את electrodeposition pH תלויה של chitosan. אלקטרוליזה מים אלקטרודה מוטה cathodically גורם pH גבוה מקומי (שמוצג על ידי שינוי צבע מקומי של צבע אינדיקטור pH ליד הקתודה של מיקרוסקופ) אשר מגרה את המעבר סול ג'ל של chitosan באזור זה. (ב) אמינים המצויים על גבי chitosan לתת ליטי-pH תגובה נכסים. מעל ה-pH של 6.3 (pKa של chitosan) אמינים הם deprotonated, להקל על המעבר בצורה מסיסה protonated שלה בצורת ג'ל מסיס שלה. (ג) אלקטרודות זהב בדוגמת שימש electrodeposit chitosan. אלקטרודה, מחוברים cathodically לאספקת חשמל, היה שקוע בתוך ירוק fluorescently שכותרתו chitosan (0.8%) הפתרון בתצהיר. לאחר electrodepositing דקות 2. בצפיפות זרם של 4/2 מ ', הסרט electroaddressed chitosan היה צילמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
איור 4. אלקטרוכימי התמרה עם הסרט chitosan פונקציונליות. (א) סכמטי המציג את הגדרת מערכת 3 אלקטרודות. פונקציונליות הסרט chitosan משמש האלקטרודה עובד, חוט פלטינה האלקטרודה הדלפק Ag / AgCl כמו אלקטרודה התייחסות. אלקטרוכימי התמרה של התמורה הגלוקוז באמצעות הדואר תגובות אנזימטיות ו אלקטרוכימי המוצגים שם מי חמצן המיוצר ניתן חמצון ו זוהה על אלקטרודה העבודה. (ב) מחזורי voltammagram (CV) על האלקטרודה עם הסרט chitosan המכילה גלוקוז אוקסידאז מצומדות electrochemically (GOx) מראה אות anodic חזקה פתרון גלוקוז 5 מ"מ. הסרט מכיל לא GOx שימש פקד ומוצג אין אות בפתרון אחד. (ג) עקומת תקן בין הנוכחי anodic ואת ריכוז הסוכר מציג קשר לינארי הקרוב (aliquot כל עלה ריכוז גלוקוז של 4 מ"מ, וכן הגדילה את האמפליטודה הנוכחי בגרף השיבוץ באופן צעד חכם).
איור 5. Functionalization חלבון באמצעות הרכבה האנזימטית. (עליון) תוכנית המציגה טירוזין-tagged "AI-2 synthase" להיות קשור קוולנטית לסרט chitosan ידי האסיפה טירוסינאז. את שאריות טירוזין להיות oxidציון תקן ל O-קינונים ידי פעולה טירוסינאז ועשוי להגיב עם קבוצות אמין על הסרט chitosan, יוצרים קשר קוולנטי. (, נמוכה יותר) synthase AI-2 מייצר AI-2 של מצע (אדון); התאים מקלט לדווח שנוצר AI-2 על ידי הביטוי הקרינה dsRed. (ב) תמונות הקרינה מראה הסרט chitosan על זהב, פונקציונליות עם synthase AI-2 כחול הנקרא. Adjacently, AI-2 תאים והמקלט יהיו מחוברים codeposited עם אלגינט על איטו. לאחר תוספת של מצע האנזימטית היטב ו הדגירה, AI-2 תאים מקלט דחוף dsRed.
Discussion
הנהלים שלנו להפגין electrodeposition ו functionalization של סרטים biopolymer, תהליך שאנו טווח biofabrication. דרך functionalization עם תאים ביומולקולות אנחנו יוצרים משטחים ביולוגיים בעלי יכולת אינטראקציה זה עם זה ואת כתובת האלקטרודה הם התאספו על. צעד electrodeposition 1, מתרחש באמצעות הרכבה עצמית מופעלות של אלגינט, biopolymers ו chitosan במחקרים שלנו, בתגובה לאות חשמלי. כפי שצוין קודם לכן שיפוע pH מופק אשר יכול להיות נשלט על ידי צפיפות זרם וזמן בתצהיר, מתן שליטה נוספת על הממדים הסרט ומאפיינים 6,17. מצאנו כי מגוון של צפיפות הנוכחית זמן שילובים בתצהיר יכול לשמש את האלקטרודות המצוין בלוח 1. תוך שימוש באלקטרודות אחרים אינו ריאלי, התאמות ההליך יהיה צורך. לעומת טכניקות אחרות, של יצירת הסרט תהליך של electrodeposiהנחה זו היא פשוטה, מהירה reagentless. אין צורך רפרטואר רחב של ציוד יקר ההכנות מייגע. חשוב לציין כי התהליך יכול לעמוד סטיות ניסויים קטנים וניתן לעבוד בקלות מעל במקרה של בעיה.
Chitosan הוא מסוגל להגיב שיפוע pH גבוה קתודית בשל תכונות פעילות חשובים המוקנות לו לפי תוכן גבוהה של אמינים ראשוניים. ב-pH גבוה (יותר מ pKa של ~ 6.3) אמינים הם deprotonated ו chitosan הופך מסיס, המאפשר יצירת הסרט. בעקבות בתצהיר, הסרטים יישאר מחובר האלקטרודה. עם זאת, היכולת קיימת delaminate אותם אם תרצה בכך. הסרטים תישאר יציבה כל עוד ה-pH של התמיסה לא לרדת מתחת pKa. פתרונות חומציים protonate את אמינים ואת repulsions אלקטרוסטטי הבאים להתנפח ג'ל עד שהוא נמס 18. כלומר, תהליך ההרכבה / פירוק הפיך לפי דרישה AlloWS להסרת הסרטים שהופקדו ושימוש חוזר של אלקטרודות. נוח, טווח ה-pH שבו המעבר סול ג'ל מתרחש קרוב לזה שבו מרכיבים ביולוגיים ביותר לתפקד בצורה אופטימלית. זה הופך את תהליך אידיאלי עבור השמירה של פונקציונליות במהלך הרכבת 6.
הסרט היווצרות אלגינט הוא הקל על ידי אלקטרוליזה של מים anodic כמו גם נוכחות של סידן פחמתי 7. PH נמוך מקומי על האנודה solubilizes סידן פחמתי המוביל את קטיוני סידן שחרור. יונים אלה לטיפולי קלאציה של אלגינט, להקים רשת crosslinked על פני האלקטרודה. סרטים אלגינט הוא הפיך בעיקר על ידי תחרות על יוני סידן מן אחרים תרכובות chelating כגון ציטרט או EDTA, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפזר את הסרטים, המאפשר שימוש חוזר של אלקטרודות היסוד. לכן, סרטים אלגינט שבירות יחסית, כאשר נתון בתנאים פיסיולוגיים כי יוני סידן הם בקלות שלcavenged של מטריקס ג'ל, להחליש את המבנה שלה וקידום הסרט delamination או redissolution. כדי להתגבר על מגבלה זו, יש לנו כלל צעד הדגירה של הסרט ב 1 M CaCl 2 לחזק את הג'ל. בנוסף, אנו ממליצים פתרון הדגירה של הסרט (מדיה נייד וכו ') להשלים עם CaCl 2 בריכוז מ"מ מיקרומטר-3 500.
ההליך העיקרי השני הוא functionalization של הסרט שהופקדו עם רכיבים ביולוגיים רלוונטיים. זו יכולה להיות מושגת בשתי דרכים, לצמידה הראשון הוא אלקטרו, אסטרטגיה המאפשרת הרכבה מהירה reagentless של חלבונים עם שליטה מרחבית יוצא דופן 10. עם זאת, functionalization באופן זה הוא מוגבל על ידי דיפוזיה של Cl - יונים באמצעות הסרט אל האלקטרודה, כמו גם את הפצת HOCl, תגובתי שנוצר ביניים, חזרה אל הפתרון. היכולת של מולקולות פעילות electrochemically לעבורדרך הסרט מאפשר התמרה של אותות כימיים ביולוגיים לתוך קל לקרוא אותות חשמליים 15. הראינו טירוסינאז בתיווך צימוד כאסטרטגיה 2 עבור functionalization האנזים chitosan, שמפגינים קוולנטית חיבור AI-2 synthase. אסטרטגיה זו מאפשרת תהליך functionalization להיות מבוקרת סלקטיבית - תלוי מגיב מסוים, טירוסינאז, הפועל discriminately על חלבונים המכילים תג טירוזין 9.
אנחנו מראים את התועלת ואת biocompatibility של הכתובת מרובה מערכות ידי שכפול מסלולים טבעיים על שבב. ראשית ארגנו שתי אוכלוסיות תאים (כלומר, "שולחים" ו "מקלטי") על כתובות שונות, והראה כי הם אינטראקציה בין האלקטרודות הסמוכות לספק AI-2 וליצור תגובה פלואורסצנטי. תפיסה זו יש גם הוכחה על ידי נג et al. ב 14 שבבים microfluidic. אנחנו גם חיקה את האינטראקציה, אבל במקום להשתמשאנזים לסנתז AI-2 עבור משלוח. בדרך זו, מסלול תאיים סינתטי, AI-2 סינתזה, חזר על עצמו דרך biofabrication ופעל ככל שזה יהיה פתרון.
בשני המקרים הרכבה של מספר כתובות מציג את האתגר של מניעת שאינו מחייב בין כתובות ספציפיות, כי כל פתרון חייב להיות מוצג בתצהיר למערך אלקטרודות כולו, למרות electrodeposition נועד רק לכתובת אחת. כביסה עדינה אך יסודית ניתן להסיר את רוב פתרון שיורית של מוטות שאינם אלקטרודות; השימוש זרימה בערוצים microfluidic עשוי לצמצם עוד יותר את הספציפיות לא. במיוחד biofabrication הסמוך chitosan וכתובות אלגינט, מומלץ להפקיד את הסרט chitosan 1, בעקבות זאת בצעדים biofunctionalization, ואחרי זה, electrodepositing אלגינט. למרות שלא עשינו אז הנה, מצאנו כי חסימת הסרט chitosan עם חלבונים אינרטי (כגון MILK, BSA, וכו ') מפחיתה באופן משמעותי שאינם ספציפיים מחייב של מולקולות לא רצויות לפני השטח aminated של chitosan.
מצאנו כלי עזר בהקמת אלקטרודות בדוגמת, לעתים קרובות למצוא מכשירים BioMEMS, בשם "תוכניות" של הסדר מורכב של תאים ביומולקולות. השימושים של electrodeposited chitosan ב BioMEMS התקנים יכול ללכת הרבה מעבר הדוגמאות שהוזכרו כאן 19. Chitosan יכול להיות מופקד על הגיאומטריות microscale שונים - כגון microchannels ועל משטחים לא מישוריים 20,15. הסרטים יכולים להיות גם שונה עם פולימרים אחרים וכן מגוון של חלבונים, דנ"א, חלקיקים, ו חמזור פעילים מולקולות של מאפייני הרומן 21,22,23. במכשירים BioMEMS, סרטים chitosan שימשו למשלוח סמים, גילוי מולקולה חמזור וקטנים, Biocatalysis, ומחקרים סלולריים 20,23,24,25. באופן דומה, אלגינט הוא בשימוש נרחב כמו מטריקס תאים מלכודת ו נחקר על בלימה fluidic הפיך שלאוכלוסיות תאים בתוך הסרט immunoanalysis 26,27,28. סרטים מורכבים עבור יישומים הנדסת רקמות כבר מפוברק באמצעות electrodeposition אלגינט, עם מרכיבים כמו עם hydroxyapatite עבור שתלים אורתופדיים 29.
בהפגנות שלנו biofabrication, הראינו גם את יחסי הגומלין בין מרכיבים ביולוגיים על פני ממשק ביו אלקטרונית לחול במידה שווה, זה מביא את האפשרות להגיע לשלב את כל סוגי אינטראקציות עבור ביצועים מתוחכמים של העברת אותות על השבב. בהתאם לכך, עשויה להקל על biofabrication ייצור של מכשירים עם "גדלים תכונה מינימום" צומצמו המשך ישיר על ההתפתחויות מהירים microfabrication, המונעים לעתים קרובות על ידי מוצרי האלקטרוניקה. כלומר, הבא של הדור הבא התקנים עלולה למעשה לכלול רכיבים ביולוגיים יציב המציעים הרכבה מופלאה של הטבע ויכולות זיהוי באריכות SCA קטן עוד יותרles מאשר מעשה ידי אדם מערכות. אנחנו מדמיינים לטווח הקרוב יישומים מכשור אנליטי, חיישנים סביבתיים, והתקנים מושתלת ביולוגית אפילו.
Disclosures
הפקה וגישה חופשית למאמר זה ממומן על ידי הרשות האמריקנית האיום הביטחון הפחתת.
Acknowledgments
אנו מכירים במימון DTRA לתמיכה של כתב היד הזה ומן ONR, DTRA, ו-NSF לתמיכה חלקית של המחקר הבסיסי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
