Summary
यह लेख एक biofabrication दृष्टिकोण का वर्णन: पक्षपाती biocompatible है फिल्मों है जो कोशिकाओं या प्रोटीन के साथ है functionalized किया जा सकता है बनाने के इलेक्ट्रोड की उपस्थिति में उत्तेजनाओं उत्तरदायी polysaccharides के बयान. हम के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रयोगशाला-on-a-चिप अनुप्रयोगों के लिए इंटरैक्टिव biofunctionalized सतहों बनाने के लिए फिल्मों को उनके मूल का उपयोग करता है की पीढ़ी के लिए एक पीठ टॉप रणनीति प्रदर्शित करता है.
Protocol
1. Alginate electrodeposition
- पैच डोरियों मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर के माध्यम से कस्टम गढ़े इलेक्ट्रोड के लिए एक बिजली की आपूर्ति कनेक्ट. एक ईण्डीयुम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) को कवर गिलास स्लाइड anode के रूप में कार्य (इलेक्ट्रोड काम कर रहे है) और प्लैटिनम पन्नी कैथोड (काउंटर इलेक्ट्रोड) के रूप में काम करेगा. इलेक्ट्रोड की स्थिति तो इतो है functionalized जा सतह काउंटर इलेक्ट्रोड का विरोध करता है और या तो खड़ी तैनात करने के लिए एक समाधान या क्षैतिज है कि इस तरह के बयान समाधान सतह पर निहित है में डूबा हुआ जा.
- आसुत जल में alginate 1% और 0.5% Caco 3 (वजन द्वारा) मिश्रण और फिर समाधान वाष्पदावी विसंक्रण द्वारा एक alginate बयान के समाधान तैयार करें. यह लगातार उपयोग में नहीं जब समाधान हलचल की सिफारिश की है.
- दोनों इलेक्ट्रोड बयान समाधान में डूब. इस्तेमाल किया alginate fluorescently FluoroSpheres (Invitrogen) के साथ लेबल किया जा सकता है, चेंग एट अल. 14 प्रति के रूप में, fluorescen के लिए अनुमतिCE के परिणामस्वरूप फिल्म की इमेजिंग.
- 2 मिनट के लिए एक निरंतर वर्तमान घनत्व (3/2 मीटर) लागू, वोल्टेज सीमा के भीतर 2-3 बदलाव होगा वी.
- इलेक्ट्रोड डिस्कनेक्ट और गैर - जमा समाधान निकालने. धीरे NaCl (0.१४५ एम) के साथ फिल्म का ज़रूरत से ज़्यादा alginate को दूर कुल्ला.
- फिल्म में 2 CaCl (0.1 एम) संक्षिप्त (~ 1 मिनट) सेते हैं जेल को मजबूत बनाने के लिए. NaCl (0.१४५ एम) के साथ कुल्ला और एक वांछित 2 CaCl (1 मिमी) के साथ पूरक समाधान में सेते हैं.
- एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर छवि.
2. संचार Alginate में सेल आबादी की codeposition
- संकेत प्रेषक सेल संस्कृति (W3110 wt ई. कोलाई), लेग मीडिया में हो, और एक सेल संकेत रिसीवर संस्कृति (MDAI2 + pCT6 - lsrR-amp आर पीईटी dsRed - कण नि.), लेग मीडिया में उगाई 50 + μg / एमएल kanamycin और एम्पीसिलीन के प्रत्येक बड़े हो जाना चाहिए एक रातोंरातएन डी 1 के एक ऑप्टिकल घनत्व में वृद्धि (600 एनएम) के लिए फिर से टीका. 0.4-0.6 के लिए रिसीवर सेल संस्कृति का उपयोग करने से पहले लेग साथ ऑप्टिकल घनत्व को समायोजित करें.
- 2% alginate समाधान के एक बयान और 1% Caco 3, और प्रत्येक सेल संस्कृति के साथ मिश्रण, तैयार alginate 1%, 0.5% 3 Caco के अंतिम एकाग्रता के लिए एक 1:1 अनुपात में के बारे में आधे के घनत्व को पतला कोशिकाओं के साथ संवर्धन घनत्व.
- एक गिलास स्लाइड दो इतो (PDMS) अच्छी तरह से polydimethylsiloxane (Sylgard निर्देश के अनुसार तैयार है और इच्छित आकार करने के लिए कटौती) और एक प्लैटिनम काउंटर इलेक्ट्रोड के द्वारा निहित इलेक्ट्रोड के साथ नमूनों का प्रयोग करें. प्लैटिनम के साथ एक बिजली की आपूर्ति के रूप में 1 प्रक्रिया (Alginate electrodeposition) में वर्णित एक इतो इलेक्ट्रोड कनेक्ट.
- एक बयान रिसीवर कोशिकाओं से युक्त समाधान में इलेक्ट्रोड को विसर्जित कर दिया. 3 ए / 2 मीटर, जहां सतह क्षेत्र आयाम एकल इलेक्ट्रोड के द्वारा परिभाषित किया गया है की एक घनत्व में बिजली आपूर्ति के लिए एक निरंतर वर्तमान सेट पर depositioपता होते हैं जाएगा.
- 2 मिनट के लिए वर्तमान alginate मैट्रिक्स कोशिकाओं की codeposition के लिए अनुमति देने के लिए लागू होते हैं.
- 1.5 चरण में वर्णित के रूप में फिल्म कुल्ला.
- दूसरा, आसन्न, इतो इलेक्ट्रोड को anodic कनेक्शन स्विच.
- बयान प्रक्रिया दोहराएँ (2.4 कदम - 2.7), लेकिन इस समय प्रेषक कोशिकाओं से युक्त समाधान शुरू.
- 2 इलेक्ट्रोड युक्त चिप codeposited कोशिकाओं और कैल्शियम alginate 37 पर रातोंरात सेते हैं डिग्री सेल्सियस फॉस्फेट में बफर खारा (पीबीएस) 10% लेग मीडिया और 1 मिमी 2 CaCl के साथ पूरक है.
- बाद ऊष्मायन, एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 2B) का उपयोग कर छवि.
3. Chitosan electrodeposition
- मगरमच्छ क्लिप के माध्यम से इलेक्ट्रोड के लिए बिजली की आपूर्ति कनेक्ट. सोना लेपित सिलिकॉन चिप (इलेक्ट्रोड काम कर) कैथोड के रूप में कार्य और एक प्लैटिनम पन्नी के anode के काउंटर (इलेक्ट्रोड) के रूप में काम करेगा. सोने के इलेक्ट्रोड की सतह की स्थिति तो वेंपर यह काउंटर इलेक्ट्रोड का विरोध और दोनों या तो खड़ी तैनात कर रहे हैं के लिए एक समाधान या क्षैतिज है कि इस तरह के बयान समाधान सतह पर निहित है में डूबा हुआ जा.
- पानी में chitosan के गुच्छे के मिश्रण से तैयार chitosan के समाधान और धीरे धीरे दो जोड़ने एम एचसीएल polysaccharides (अंतिम पीएच 5.6) को भंग करने, मेयर एट अल 15. द्वारा उल्लिखित प्रक्रिया का पालन सुनिश्चित करने के.
- एक chitosan के समाधान (0.8%) में इलेक्ट्रोड रखें, पूरी तरह से बयान के लिए वांछित क्षेत्र submerging. chitosan के इस्तेमाल fluorescently 5 के साथ लेबल किया जा सकता है (और 6) carboxyrhodamine 6G succinimidyl एस्टर (Invitrogen), वू एट अल प्रति के रूप में 8, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी electrodeposited फिल्म के छवि को.
- 2 मिनट के लिए एक निरंतर वर्तमान घनत्व (4/2 मीटर) लागू होते हैं. वोल्ट 2-3 की सीमा के भीतर बदलाव वी. depositio के लिए संपर्क काम इलेक्ट्रोड के सोने की सतह क्षेत्र के एक समारोह के रूप में वर्तमान घनत्व की गणनापता समाधान.
- डि पानी के साथ इलेक्ट्रोड के लिए ज़रूरत से ज़्यादा chitosan दूर कुल्ला. पानी या पीबीएस (10 मिमी, 7.0 पीएच) चिप में संग्रहीत किया जा सकता है.
- छवि का उपयोग कर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (चित्रा 3C).
4. Functionalized Chitosan फिल्म के साथ विद्युत पारगमन
- Codeposit 4 के एक वर्तमान घनत्व एक नमूनों इलेक्ट्रोड पर ए / 2 3 प्रक्रिया Chitosan electrodeposition के अनुसार मीटर पर एक समाधान (1% chitosan, 680 यू / एमएल GOx, 5.6 पीएच) से chitosan और ग्लूकोज oxidase (GOx). Chitosan GOx में फँस फिल्म उत्पन्न हो जाएगा.
- काम कर इलेक्ट्रोड, काउंटर इलेक्ट्रोड और एजी / AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में है, के रूप में चित्रा -4 ए में वर्णित के रूप में एक प्लैटिनम तार के रूप में एक तीन इलेक्ट्रोड प्रणाली को इलाज इलेक्ट्रोड देते हैं.
- एक फॉस्फेट बफर समाधान (एम 0.1, 7.0 पीएच) NaCl (0.1 एम) से युक्त में इलेक्ट्रोड को विसर्जित कर दिया.
- Electrochemically chitosan के प्रोटीन संयुग्म10 chronoamperometry का उपयोग 60 के दशकों के लिए एक निरंतर वोल्टेज (0.9 वी) लागू करने के द्वारा फिल्म.
- फॉस्फेट बफर (एम 0.1, 7.0 पीएच) में चिप रखें और एक कक्षीय हिलनेवाला पर 10 मिनट के लिए किसी भी unreacted NaCl और unconjugated GOx हटाने के लिए धोने.
- तीन इलेक्ट्रोड प्रणाली के लिए पुनः संलग्न 4.2 5 मिमी ग्लूकोज की एक समाधान में और कदम ध्यानमग्न करना में वर्णित के रूप में. उपयोग चक्रीय voltammetry, एक सकारात्मक दिशा में 0.7 संभावित वी. झाडू नियंत्रण ऑक्सीकरण की राशि झाड़ू में देखा (4B चित्रा) के लिए एक तुलना के रूप में कोई ग्लूकोज oxidase युक्त फिल्म का उपयोग करें.
- ग्लूकोज के समाधान से निकालें इलेक्ट्रोड और बफर फॉस्फेट (एम 0.1, 7.0 पीएच) के साथ कुल्ला तो एक 10 एमएल फॉस्फेट बफर के 8 एमएल (एम 0.1, 7.0 पीएच) युक्त बीकर में इलेक्ट्रोड जगह. पूर्वाग्रह GOx functionalized 0.6 वी चिप काम कर इलेक्ट्रोड (चित्रा 4C) के रूप में सेवा करने के लिए.
- बफर करने के लिए ग्लूकोज की aliquots जोड़ें (प्रत्येक अशेष भाजक द्वारा ग्लूकोज एकाग्रता बढ़ जाती है4) मिमी.
- स्थिर राज्य और ग्लूकोज एकाग्रता GOx functionalized chitosan फिल्म के लिए वर्तमान के बीच एक मानक वक्र उत्पन्न करता है.
5. प्रोटीन Enzymatic विधानसभा का प्रयोग functionalization
- एक गिलास स्लाइड एक आसन्न सोना और इतो इलेक्ट्रोड एक PDMS अच्छी तरह के भीतर निहित के साथ नमूनों का प्रयोग करें. पूर्वाग्रह एक cathodic chitosan के electrodeposit के रूप में पहले से पता चला है की क्षमता के साथ में सोने इलेक्ट्रोड. फिल्म संक्षिप्त विंदुक द्वारा डि पानी और फिर पीबीएस में कुल्ला.
- 3 नीले माइक्रोन fluorescently "Synthase ऐ-2" 16 (एक DyLight लेबलिंग किट का उपयोग करके) + 100 / यू एमएल पीबीएस में tyrosinase लेबल की एक समाधान में जोड़ें.
- कमरे के तापमान 1 घंटे के लिए सेते हैं, तो पीबीएस के साथ फिल्म कुल्ला.
- इतो इलेक्ट्रोड एक anodic संभावित एक alginate बयान के रिसीवर कोशिकाओं (2.1-2.2 चरणों में तैयार) युक्त समाधान codeposit लागू करें. 2 प्रक्रिया (alginate में सेल आबादी की Codeposition) 2.3-2.6 चरणों का पालन करें.
- उत्पन्न करने के लिएसंचरित संकेत (ऐ -2) enzymatically, rinsing के बाद फिल्मों पीबीएस में 500 माइक्रोन एस adenosyl homocysteine (SAH), 10% लेग मीडिया और 1mm CaCl 2 के साथ पूरक के एक समाधान जोड़ने के. इलेक्ट्रोड को कवर करने के लिए समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए और 37 पर रात भर सेते हैं डिग्री सेल्सियस यह एक रिसीवर सेल प्रतिक्रिया के लिए एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (dsRed) द्वारा पैदा की अनुमति देगा.
- आसन्न इलेक्ट्रोड फिल्टर को समायोजित करने के लिए Synthase ऐ-2 और लाल प्रतिदीप्ति codeposited रिसीवर कोशिकाओं (चित्रा 5 ब) द्वारा व्यक्त की नीले रंग प्रतिदीप्ति पर कब्जा करके प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ imaged किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
लगाया विद्युत संकेतों को एक इलेक्ट्रोड सतह और इन उत्तेजनाओं alginate और chitosan इलेक्ट्रोड सतह पर एक hydrogel फिल्म के रूप में जमा के रूप में polysaccharides के विधानसभा स्वयं को गति प्रदान कर सकते हैं (जैसे क्षेत्रों, और ढ़ाल) के पास स्थानीयकृत microenvironments बना सकते हैं. क्योंकि टीअपने संक्रमण प - जेल इलेक्ट्रोड सतह पर, जिसके परिणामस्वरूप फिल्म, अपने ज्यामिति मिलान पैटर्न इलेक्ट्रोड (आंकड़े 1B, 3C) के साथ electroaddressed है होता है. Alginate और chitosan के रूप में biocompatible फिल्मों सतहों कि जैविक घटकों के साथ है functionalized किया जा सकता है प्रदान करते हैं. Alginate का प्रयोग, अद्वितीय सेल आबादी अलग पतों पर codeposited है. उनके electroaddressment का सबूत प्रेषक और रिसीवर सेल जनसंख्या के बीच बातचीत पर मनाया जाता है. प्रेषक कोशिकाओं और से अणु autoinducer -2 (ऐ-2) diffuses रिसीवर कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, dsRed लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (2A चित्रा) की अभिव्यक्ति है. चित्र 2B में, लाल प्रतिदीप्ति इलेक्ट्रोड जहां रिसीवर संबोधित कर रहे हैं पर ही मनाया जाता है.
amine chitosan पर मौजूद समूहों पीएच के रूप में अच्छी तरह से एक उपयुक्त सतह functionalization के लिए electrodeposition के लिए आवश्यक जवाबदेही के साथ प्रदान करते हैं. हमelectrochemically biosensing है एंजाइम ग्लूकोज oxidase (GOx) conjugating chitosan फिल्मों electrodeposited द्वारा इन अद्वितीय गुण का उपयोग किया. इस एंजाइम तो एक enzymatic (4A चित्रा) प्रतिक्रिया हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उत्पादन जो तो electrochemically उत्पादन वर्तमान उत्पादन कर सकते हैं ऑक्सीकरण के माध्यम से ग्लूकोज का पता लगाने के लिए क्षमता प्रदान करता है. इस तरह, एक रासायनिक संकेत बिजली. 4B चित्रा transduced किया जा सकता है पता चलता है कि फिल्मों में GOx electrochemically ग्लूकोज की उपस्थिति में एक मजबूत anodic संकेत के रूप में उन नहीं GOx युक्त फिल्मों में विरोध का उत्पादन संयुग्मित था. इन परिणामों से संकेत मिलता है GOx जमा chitosan फिल्म पर इकट्ठा किया जा सकता है और उत्प्रेरक गतिविधि को बनाए रखने जाएगा. इसके अलावा, चित्र 4C anodic ग्लूकोज सांद्रता में वृद्धि के जवाब में उत्पादन वर्तमान में कदम वृद्धि दर्शाता है. मानक भी चित्रा 4C में वर्तमान वक्र से पता चलता है कि कदम बढ़ जाती है एक के पास रैखिक एफएएस में दींग्लूकोज की मात्रा पर निर्भर hion. ये परिणाम दिखाते हैं कि एंजाइम भी chitosan फिल्म के विकार पर ग्लूकोज सांद्रता बढ़ाने के लिए अपनी संवेदनशीलता को बरकरार रखे हुए है. पता लगाने की निचली सीमा नहीं अध्ययन के रूप में यह पहले किया गया है इस प्रणाली के लिए मेयर नैतिकता के काम में विशेषता थी. अल.
हम भी ब्याज की एक एंजाइम की सहसंयोजक स्थिरीकरण, एक कस्टम penta tyrosine enzymatically नियंत्रित तरीके में chitosan के टैग, शामिल इंजीनियर का प्रदर्शन किया है. विशेष रूप से, इस प्रक्रिया एंजाइम tyrosinase द्वारा मध्यस्थता है. योजना चित्रा 5A में (ऊपरी), एक एंजाइम द्वारा दर्शाया है, ऐ - 2 Synthase Penta - tyrosine टैग शामिल हैं. Tyrosinase टाइरोसीन टैग पर कार्य करता है, हे quinones, जो तब covalently chitosan के amines के लिए बाध्य अवशेषों phenol के समूहों ऑक्सीकरण. Chitosan के, tyrosinase विधानसभा Synthase ऐ-2 के साथ फिल्म functionalization के सबूत चित्रा 5B में मनाया जाता है (चित्रा (कम) 5A). रिसीवर कोशिकाओं की लाल प्रतिदीप्ति (चित्रा 5 ब) फिर ऐ - 2 के एक से दूसरे के प्रसार के कारण पते के बीच बातचीत को दर्शाता है, और आगे इंगित करता है कि एंजाइमों chitosan गतिविधि को बनाए रखने के एक बार covalently बाध्य स्थिर है.
चित्रा 1. Alginate electrodeposition. (ए) alginate electrodeposition के तंत्र के रूप में एक इलेक्ट्रोड anodically से पक्षपाती है, पानी इलेक्ट्रोलीज़ इसकी सतह पर होता है, एक स्थानीयकृत कम पीएच. कैल्शियम कार्बोनेट कणों अधिशेष के साथ प्रतिक्रियाप्रोटॉन कैल्शियम फैटायनों जारी कणों के रूप में भंग. Alginate बहुलक श्रृंखला की उपस्थिति में, आयनों एक "eggbox" नेटवर्क में chelated हो जाते हैं, इलेक्ट्रोड पर crosslinked hydrogel बनाने. इलेक्ट्रोड बढ़ जाती है से दूरी के रूप में, alginate कैल्शियम आयनों की कम उपस्थिति के कारण समाधान में रहने के लिए एक बड़ा प्रवृत्ति है. (बी) एक एल के आकार नमूनों इतो इलेक्ट्रोड electrodeposit alginate के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक PDMS अच्छी तरह से इलेक्ट्रोड के लिए तय की गई थी एक हरे रंग की fluorescently लेबल (1%) alginate और 3 Caco (0.5%) बयान समाधान होते हैं. 2 मिनट के लिए electrodepositing के बाद. 3A / 2 मीटर के एक वर्तमान घनत्व पर, electroaddressed alginate hydrogel प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया गया है.
चित्रा 2 सेल आबादी की Codeposition. (ए) दो ई. के बीच योजना दिखा बातचीत कोलाई उपभेदों: एक जनसंख्या autoinducer-2 उत्पादन (ऐ-2), एक संकेत अणु, और "प्रेषक ऐ-2." कहा जाता है अन्य आबादी, रिसीवर ऐ-2 "ऐ-2 के एक संवाददाता करार दिया, ऐ-2 प्रेषक से प्रसार द्वारा प्राप्त होने पर, यह व्यक्त लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन dsRed. (ख) लाल ऐ - 2 प्रेषक जनसंख्या के साथ इलेक्ट्रोड जोड़ी के प्रतिदीप्ति छवि बाईं इलेक्ट्रोड पर alginate के साथ codeposited और ऐ-2 रिसीवर जनसंख्या सही इलेक्ट्रोड पर alginate के साथ codeposited की की. आवर्धित दृश्य केवल ऐ-2 रिसीवर के dsRed अभिव्यक्ति को दर्शाता है.
3. Chitosan electrodeposition आंकड़ा. (ए) योजना chitosan के पीएच पर निर्भर electrodeposition दिखा. एक cathodically पक्षपाती इलेक्ट्रोड पर पानी इलेक्ट्रोलीज़ एक स्थानीय उच्च (माइक्रोग्राफ में कैथोड के पास पीएच सूचक डाई का एक स्थानीयकृत रंग के परिवर्तन से दिखाया गया है) पीएच है जो इस क्षेत्र में chitosan के प - जेल संक्रमण को बढ़ावा देने का कारण बनता है. (बी) amines chitosan पर वर्तमान मैं देटी पीएच उत्तरदायी गुणों. पीएच 6.3 (PKA chitosan के) के ऊपर amines deprotonated कर रहे हैं, अपनी protonated घुलनशील रूप से अघुलनशील जेल के फार्म के लिए एक संक्रमण की सुविधा. (ग) नमूनों सोना इलेक्ट्रोड electrodeposit chitosan के लिए इस्तेमाल किया गया था. इलेक्ट्रोड, बिजली की आपूर्ति करने के लिए cathodically जुड़े, एक हरे रंग की fluorescently लेबल (0.8%) chitosan के बयान समाधान में डूब गया था. 2 मिनट के लिए electrodepositing के बाद. 4 ए / 2 मीटर के एक वर्तमान घनत्व पर, electroaddressed chitosan फिल्म प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया गया था.
चित्रा 4. एक functionalized chitosan फिल्म के साथ विद्युत रासायनिक पारगमन. (ए) योजनाबद्ध एक तीन इलेक्ट्रोड प्रणाली का सेट अप दिखा. Functionalized chitosan के फिल्म में काम कर इलेक्ट्रोड, काउंटर और संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में इलेक्ट्रोड / एजी AgCl के रूप प्लैटिनम तार के रूप में कार्य करता है. ग्लूकोज आय वें के माध्यम से विद्युत पारगमनई एंजाइमी और विद्युत दिखाया जहां उत्पादन हाइड्रोजन पेरोक्साइड और ऑक्सीकरण जा सकता है इलेक्ट्रोड पर काम कर पाया प्रतिक्रियाओं. (बी) chitosan electrochemically संयुग्मित ग्लूकोज oxidase (GOx) युक्त फिल्म के साथ इलेक्ट्रोड में चक्रीय voltammagram (सीवी) 5 मिमी ग्लूकोज समाधान में एक मजबूत anodic संकेत से पता चलता है. एक जिसमें कोई GOx शामिल फिल्म एक नियंत्रण के रूप में सेवा की और एक ही समाधान में कोई संकेत प्रदर्शित. (सी) anodic वर्तमान और ग्लूकोज एकाग्रता के बीच एक मानक वक्र के निकट एक रैखिक संबंध प्रदर्शित करता है (प्रत्येक अशेष भाजक 4 मिमी से ग्लूकोज एकाग्रता में वृद्धि हुई और यह भी एक कदम वार तरीके में इनसेट ग्राफ में वर्तमान आयाम में वृद्धि हुई).
5 प्रोटीन एंजाइमी विधानसभा का उपयोग functionalization, चित्रा. (एक ऊपरी) योजना tyrosine टैग दिखा रहा है "ऐ-2 Synthase" covalently tyrosinase विधानसभा द्वारा किया जा रहा है एक chitosan फिल्म के लिए सीमित है. tyrosine अवशेषों Oxid हो जाते हैंtyrosinase कार्रवाई द्वारा हे - quinones है ized और chitosan फिल्म पर amine समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, एक सहसंयोजक बांड बनाने. (एक कम,) Synthase ऐ 2 ऐ-2 एक सब्सट्रेट (SAH) से उत्पन्न; रिसीवर कोशिकाओं dsRed प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति द्वारा उत्पन्न ऐ-2 रिपोर्ट. (बी) प्रतिदीप्ति सोने पर एक chitosan फिल्म के छवियाँ दिखा, नीले लेबल Synthase ऐ-2 के साथ है functionalized. Adjacently, ऐ-2 रिसीवर कोशिकाओं से इतो पर alginate के साथ codeposited हैं. एंजाइमी सब्सट्रेट अच्छी तरह से और ऊष्मायन के अलावा के बाद, ऐ-2 रिसीवर कोशिकाओं dsRed व्यक्त.
Discussion
हमारे प्रक्रियाओं electrodeposition और biopolymer फिल्मों के functionalization, एक हम biofabrication अवधि प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. कोशिकाओं और biomolecules साथ functionalization के माध्यम से हम जैविक सतहों एक दूसरे को और इलेक्ट्रोड पते पर वे इकट्ठा कर रहे हैं के साथ बातचीत करने में सक्षम बनाते हैं. पहला कदम, electrodeposition, ट्रिगर, biopolymers है, और हमारे अध्ययन में alginate chitosan के विधानसभा स्वयं के माध्यम से एक बिजली के संकेत के जवाब में जगह लेता है. जैसा कि पहले कहा पीएच ढाल उत्पन्न होता है जो वर्तमान घनत्व और बयान समय से नियंत्रित किया जा सकता है, फिल्म आयाम और 6,17 गुणों के अतिरिक्त नियंत्रण प्रदान. हमने पाया है कि वर्तमान घनत्व और बयान समय संयोजनों की एक किस्म तालिका 1 में दर्शाए गए इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि अन्य इलेक्ट्रोड का उपयोग संभव है, प्रक्रिया के समायोजन आवश्यक हो जाएगा. फिल्म के गठन अन्य electrodeposi की प्रक्रिया तकनीक के साथ तुलना मेंइस tion सरल, तीव्र और reagentless है. महंगे उपकरण और श्रमसाध्य तैयारी की एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची के लिए कोई ज़रूरत नहीं है. महत्वपूर्ण बात, इस प्रक्रिया को मामूली प्रयोगात्मक विचलन का सामना और आसानी से शुरू कर सकते हैं यदि कोई समस्या उत्पन्न होती है सकते हैं.
Chitosan एक उच्च cathodic पीएच महत्वपूर्ण कार्य यह करने के लिए प्राथमिक amines के एक उच्च सामग्री के द्वारा प्रदत्त गुण के कारण ढाल करने के लिए जवाब देने में सक्षम है. उच्च pH (6.3 ~ की pKa से अधिक) पर amines deprotonated और chitosan के अघुलनशील हो जाता है, फिल्म निर्माण के लिए अनुमति देता है. बयान के बाद, फिल्म इलेक्ट्रोड के लिए संलग्न रहेगा. हालांकि, क्षमता उन्हें delaminate अगर वांछित मौजूद है. फिल्मों समाधान के पीएच pKa नीचे छोड़ नहीं करता है के रूप में लंबे समय के रूप में स्थिर रहेगा. अम्लीय समाधान के amines protonate बाद electrostatic repulsions जेल प्रफुल्लित जब तक यह 18 घुल. यही है, प्रक्रिया विधानसभा / disassembly के मांग और allo पर पलटवाँ हैजमा फिल्मों और इलेक्ट्रोड का पुन: उपयोग के हटाने के लिए गया था. आसानी से, पीएच सीमा जिस पर प - जेल संक्रमण जगह लेता है कि जो में सबसे जैविक घटकों बेहतर कार्य के लिए करीब है. यह 6 विधानसभा दौरान कार्यक्षमता की अवधारण के लिए प्रक्रिया आदर्श बनाता है.
Alginate फिल्म गठन पानी की anodic इलेक्ट्रोलीज़ के रूप में अच्छी तरह के रूप में कैल्शियम कार्बोनेट 7 की उपस्थिति से मदद की है. anode पर स्थानीयकृत कम पीएच कैल्शियम रिहाई कैल्शियम फैटायनों के लिए अग्रणी कार्बोनेट solubilizes. इन आयनों alginate द्वारा chelated कर रहे हैं, इलेक्ट्रोड सतह पर एक crosslinked नेटवर्क बनाने. Alginate फिल्मों साइट्रेट या EDTA के रूप में अन्य chelating यौगिकों, जो फिल्मों को भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अंतर्निहित इलेक्ट्रोड का पुनः प्रयोग के लिए अनुमति देने से कैल्शियम आयनों के लिए प्रतिस्पर्धा द्वारा विशेष रूप से पलटवाँ हैं. इस प्रकार, alginate फिल्मों के अपेक्षाकृत कमजोर है जब शारीरिक शर्तों के अधीन हैं क्योंकि कैल्शियम आयनों आसानी से कर रहे हैंजेल मैट्रिक्स से cavenged, इसकी संरचना कमजोर है और फिल्म को बढ़ावा देने के delamination या redissolution. इस सीमा पर काबू पाने के लिए, हम इस फिल्म के लिए एक एम 1 2 CaCl में ऊष्मायन चरण के लिए जेल को मजबूत बनाने शामिल है. इसके अतिरिक्त, हम अनुशंसा करते हैं कि फिल्म के ऊष्मायन समाधान (सेल मीडिया, आदि) 2 CaCl साथ 500 मिमी माइक्रोन-3 की एकाग्रता में पूरक होना.
दूसरा प्रमुख प्रक्रिया फिल्म प्रासंगिक जैविक घटकों के साथ जमा की functionalization है. यह दो तरीके हैं, पहली बार जा रहा विद्युत विकार, एक रणनीति है कि तेजी से, असाधारण स्थानिक 10 नियंत्रण के साथ प्रोटीन की reagentless विधानसभा के लिए अनुमति देता है में प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, इस तरह से functionalization, सीएल के प्रसार द्वारा सीमित है - फिल्म के माध्यम से इलेक्ट्रोड आयनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से HOCl का प्रसार, उत्पन्न प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती, समाधान में वापस बाहर. electrochemically सक्रिय अणुओं की क्षमता पारित करने के लिएफिल्म के माध्यम से आसान को पढ़ने के लिए बिजली 15 संकेतों में रासायनिक और जैविक संकेतों के पारगमन के लिए अनुमति देता है. हम chitosan के लिए एंजाइम functionalization के लिए एक दूसरे की रणनीति के रूप में tyrosinase की मध्यस्थता युग्मन दिखाया है, covalently ऐ - 2 Synthase संलग्न द्वारा प्रदर्शन. एक विशिष्ट अभिकर्मक, tyrosinase, जो एक tyrosine 9 टैग युक्त प्रोटीन पर discriminately में कार्य करता है पर निर्भर - इस रणनीति functionalization प्रक्रिया नियंत्रित और चयनात्मक होना करने की अनुमति देता है.
हम उपयोगिता और एक चिप पर प्राकृतिक रास्ते नकल biocompatibility बहु - पता प्रणालियों के दिखाते हैं. पहले हम अलग पते पर दो सेल आबादी (यानी "प्रेषकों" और "रिसीवर") का आयोजन किया, और पता चला है कि वे आसन्न इलेक्ट्रोड भर में बातचीत करने के लिए ऐ-2 देने और एक प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया उत्पन्न. इस अवधारणा को भी चेंग एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया. एक microfluidic चिप में 14. हम भी बातचीत मजाक उड़ाया, लेकिन बजाय प्रयोग किया जाताऐ-2 synthesize करने के वितरण के लिए एंजाइम. इस तरह, एक सिंथेटिक intracellular मार्ग है, ऐ - 2 संश्लेषण biofabrication के माध्यम से दोहराया गया था और बहुत कार्य के रूप में यह समाधान में होगा.
दोनों ही मामलों में, एकाधिक पतों की विधानसभा क्योंकि प्रत्येक समाधान के बयान पूरे इलेक्ट्रोड सरणी के लिए शुरू किया जाना चाहिए, भले ही electrodeposition केवल एक पते पर करना है पते के बीच गैर विशिष्ट बंधन से बचने की चुनौती प्रस्तुत करता है. कोमल अभी तक पूरी तरह से धोने गैर पक्षपाती इलेक्ट्रोड से अवशिष्ट समाधान के बहुमत को दूर कर सकते हैं, microfluidic चैनलों में आगे प्रवाह का उपयोग गैर विशिष्टता कम से कम हो सकता है. Chitosan के और alginate पते के आसन्न biofabrication के लिए विशेष रूप से, हम chitosan फिल्म पहले जमा, biofunctionalization कदम के साथ इस का पालन करने की सलाह देते हैं, और इस के बाद, electrodepositing alginate. हालांकि हम तो यहाँ नहीं किया है, हमने पाया है कि निष्क्रिय प्रोटीन (जैसे मिल के रूप में के साथ chitosan के फिल्म अवरुद्धकश्मीर, बीएसए, आदि) बहुत में chitosan aminated सतह अवांछित अणुओं के गैर विशिष्ट बंधन घटता है.
हम नमूनों इलेक्ट्रोड, अक्सर BioMEMS उपकरणों में पाया कोशिकाओं और biomolecules के एक जटिल व्यवस्था के लिए "खाका" के रूप में स्थापित करने में उपयोगिता पाया है. का उपयोग करता है electrodeposited BioMEMS उपकरणों में chitosan उदाहरण अच्छी तरह से परे जा सकते हैं 19 यहाँ उल्लेख किया है. Microchannels में और गैर planar 20,15 सतहों पर जैसे - chitosan विभिन्न microscale geometries पर जमा किया जा सकता है. फिल्मों को भी अन्य पॉलिमर और एक किस्म के प्रोटीन, डीएनए, नैनोकणों, और उपन्यास 21,22,23 गुण के लिए redox सक्रिय अणुओं के साथ संशोधित किया जा सकता है. BioMEMS उपकरणों में chitosan फिल्मों दवा वितरण, redox और छोटे अणु का पता लगाने, biocatalysis, और सेल 20,23,24,25 अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी तरह, alginate व्यापक रूप से एक मैट्रिक्स सेल फंसाने के रूप में प्रयोग किया जाता है और है के पलटवाँ की fluidic रोकथाम के लिए पता लगाया गयासेल आबादी और फिल्म में 26,27,28 immunoanalysis. ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए समग्र फिल्मों alginate electrodeposition का उपयोग किया गया 29 आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण के लिए hydroxyapatite साथ जैसे घटकों के साथ, गढ़े.
हमारे प्रदर्शनों की biofabrication में हम समान रूप से लागू हो जैविक घटकों के बीच और जैव इलेक्ट्रॉनिक इंटरफ़ेस भर दोनों बातचीत से पता चला है, इस पर चिप संकेत संचरण में परिष्कृत प्रदर्शन के लिए बातचीत की सभी किस्मों को एकीकृत करने की संभावना तक पहुँचने में लाता है. तदनुसार, biofabrication के कम के रूप में "न्यूनतम सुविधा आकार के साथ उपकरणों के निर्माण की सुविधा हो सकती है एक सीधे पर कि microfabrication में तेजी से विकास, के रूप में अक्सर उपभोक्ता इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा प्रेरित करने के लिए - का पालन करें. यही है, अगले अगली पीढ़ी के उपकरणों वास्तव में अस्थायी जैविक घटक है कि प्रकृति के उत्तम और विधानसभा में भी छोटे लंबाई sca के मान्यता क्षमताओं की पेशकश शामिल हो सकता हैमानव निर्मित सिस्टम से लेस. हम विश्लेषणात्मक उपकरण, पर्यावरण सेंसर, और भी biocompatible है implantable उपकरणों में निकट भविष्य अनुप्रयोगों कल्पना.
Disclosures
उत्पादन और इस लेख के लिए नि: शुल्क प्रवेश संयुक्त राज्य अमेरिका डिफेंस थ्रेट रिडक्शन एजेंसी द्वारा प्रायोजित है.
Acknowledgments
हम DTRA से इस पांडुलिपि की सहायता के लिए और ONR,, DTRA, और NSF से अंतर्निहित अनुसंधान का आंशिक समर्थन के लिए धन स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
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