Summary
이 문서 biofabrication 접근 방식을 설명합니다 : 세포 또는 단백질과 기능화 수 biocompatible 영화를 만드는 편견 전극의 존재에 자극 - 반응 다당류의 증착. 우리는 실험실 - 온 - 칩 애플 리케이션을위한 인터랙티브 biofunctionalized 표면을 만들기위한 영화뿐만 아니라 그들의 기본적인 용도의 생성을위한 벤치 최고 전략을 보여줍니다.
Abstract
낮은 비용, 더 나은 감도, 이동성 및 높은 처리량을 통해 연구와 의학을 모두 혁명을 위해 실험실 - 온 - 칩 기술 약속을 향상. 생물 학적 microelectromechanical 시스템 (bioMEMS)쪽으로 생물 학적 구성 요소의 결합은 이러한 목표 달성을위한 큰 잠재력을 보이지 않고있다. Microfabricated 전자 칩은 마이크로 미터 규모의 기능뿐만 아니라 센싱 및 작용을위한 전기적 연결을 허용합니다. 기능성 생물 학적 구성 요소는 시스템에게 analytes, 효소 기능, 그리고 전체 세포 기능의 특정 검색을위한 용량을 제공합니다. 표준 microfabrication 프로세스 및 바이오 분석 기술이 성공적으로 각각 컴퓨터와 생물 산업 분야에서 수십 년간 이용하고 있습니다. 실험실 - 온 - 칩 환경에서 그들의 조합과 사용자 인터페이스, 그러나, 앞으로 새로운 도전을 제공합니다. 전극 및 생물 학적 compon 사이의 인터페이스를 구축할 수있는 기술에 대한 요구가온화하고 엔트는 조작과 패턴 쉽습니다.
Biofabrication, 여기서 설명한대로 사용되는 온칩 기능의 다양성과 생물 학적 구성 요소의 쉬운 조립 설립을위한 큰 약속을 보여주었다 하나의 방법입니다. Biofabrication은 상향식 계층 어셈블리에 대한 생물 학적 물질 및 생물 학적 메커니즘을 (자기 조립, 조립 효소)를 사용합니다. 저희 실험실은 여러 형식의 1,2,3에서 이러한 개념을 입증했지만, 우리가 신호 기반의 상호 작용의 여러 응용 프로그램에서 다음 전착에 따라 조립하는 과정을 보여줍니다. 조립 공정은 전극과 같은 DNA, 효소, 또는 4,5 살아있는 세포와 같은 생물 학적 구성 요소들은 이후 작용화에 biocompatible 자극 - 반응하는 폴리머 필름의 전착으로 구성되어 있습니다. 전착는 전기 분해에서 편견 전극의 표면에 생성된 산도 기울기 활용물 6,7 중. 키토산과 알지네이트요가 부과하는 전기 신호를 8 응답 히드로겔 필름으로 자기 조립으로 트리 거할 수 있습니다 자극 - 반응하는 생물 학적 고분자입니다. 이러한 hydrogels의 두께는 pH의 기울기는 전극에서 확장하는 정도에 의해 결정됩니다. 이것은 다양한 전류 밀도와 증착 시간 6,7를 사용하여 수정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 키토산 필름은 covalently 효소 또는 전기 화학 방법 9,10 중 하나를 통해 필름에 존재하는 풍부한 일차 아민 그룹에 생물 학적 구성 요소를 첨부하여 입금 및 기능화되는 방법을 설명합니다. 알긴산 필름, 라이브 세포들의 함정 수사도 11을 처리해 드리겠습니다. 마지막으로, biofabrication의 유틸리티 화학 - 투 - 전기, 휴대 전화, 또한 효소 - 투 - 세포 신호 전송을 포함한 신호 기반의 상호 작용의 예를 통해 증명된다.
전착 모두그리고 작용화는 시약없이도 거의 생리적 조건에서 수행하기 때문에 가혹한 조건에서 불안 정한 생물 학적 구성 요소를 아끼지 수 있습니다. 또한, 키토산 및 알지네이트요 모두 오랫동안 생물학 - 관련 목적으로 12,13 위해 사용되었습니다. 전반적으로, biofabrication, 간단히 benchtop에서 수행할 수 급속한 기술은 전극에 기능성 생물 학적 구성 요소의 마이크론 스케일 패턴을 만드는 데 사용할 수 있으며 실험실 - 온 - 칩 다양한 어플 리케이션에 사용될 수 있습니다.
Protocol
1. 알긴산의 전착
- 악어 클립을 사용하여 패치 코드를 통해 사용자 정의 가공 전극에 전원 공급 장치를 연결합니다. 인듐 주석 산화물 (ITO)는 유리 슬라이드 양극 역할을합니다 (전극 작업) 및 백금 호일은 음극 (반대 전극) 될 것입니다 있었다. 기능화되는 ITO 표면 카운터 전극을 반대하고 해결책이나 증착 솔루션 표면에 포함되는 수평 등으로 담근 것으로 수직 어느 위치하도록 전극을 둡니다.
- 증류수에 1 %의 알긴산과 0.5 % CaCO 3 (중량으로) 혼합 후 솔루션을 autoclaving하여 알지네이트요 증착 솔루션을 준비합니다. 그것은 지속적으로 사용하지 않는 솔루션을 끓게하는 것이 좋습니다.
- 증착 용액에 잠수함 두 전극을. 사용 알지네이트요는 fluorescently fluorescen 가능하도록하기 위해서, 같은 쳉 외. 14 당 FluoroSpheres (Invitrogen)으로 표시됩니다결과 필름의 CE 이미징.
- 2 분 동안 일정한 전류 밀도 (3 / M 2)를 적용, 전압 2-3의 범위 내에서 변경됩니다 V.
- 전극을 분리하고 비 예금 솔루션을 제거합니다. 부드럽게 불필요한 프로그램 알지네이트요을 제거 NaCl (0.145 M)과 필름을 린스.
- 젤을 강화하기 위해 CaCl 2 (0.1 M)에서 필름을 간단히 (~ 1 분) 품다. NaCl (0.145 M)와 헹굼 및 CaCl 2 (1 ㎜)로 보완 원하는 솔루션에 품어.
- 형광 현미경 (그림 1B)를 사용하여 이미지.
2. 알긴산의 의사 소통 세포 인구의 Codeposition
- LB 미디어 재배 신호 발신자 세포 배양 (W3110 wt E. 대장균), 그리고 신호 수신기 세포 배양 (MDAI2 + pCT6-lsrR - A R + PET-dsRed - 관 R), LB 미디어 재배 + 50 μg / ML kanamycin과 암피실린 각, 하룻밤 사이에 어른이되어야합니다차 1의 광학 밀도 증가 (600 nm의시)에 다시 주사. 사용하기 전에 LB과 0.4-0.6에 수신기 세포 배양의 광학 밀도를 조정합니다.
- 절반 정도의 농도로 희석 세포로, 1 % 알지네이트요, 0.5 % CaCO 3의 최종 농도로 1:1 비율에 증착 2 %의 알지네이트요의 솔루션과 1퍼센트 CaCO 3, 각각의 세포 배양과 믹스를 준비 culturing 밀도.
- 잘 polydimethylsiloxane (PDMS) (Sylgard 지침에 따라 작성하고 원하는 크기로 절단) 및 백금 카운터 전극에 의해 포함된 두 ITO 전극과 패턴 유리 슬라이드를 사용하십시오. 지원 절차 1 (알긴산의 전착)에 설명된대로 백금과 전원 공급 장치 하나의 ITO 전극을 연결합니다.
- 수신기 세포를 포함하는 증착 용액에 전극을 담가. 3 면적 치수가 하나의 전극에 의해 정의됩니다 / M 2의 밀도에 정전류로 전원 공급 장치를 설정하는 대한 deposition은 발생합니다.
- 알지네이트요 행렬에서 셀 codeposition 수 있도록하기 위해 2 분을 전류를 적용합니다.
- 1.5 단계에서 설명한대로 필름을 씻어.
- 두 번째, 인접, ITO 전극에 양극 연결을 전환합니다.
- 증착 절차 (단계 2.4-2.7)를 반복하되 이번에는 보낸 사람의 세포를 포함하는 솔루션을 소개합니다.
- 37 하룻밤 codeposited 세포와 칼슘 알지네이트요를 포함하는 2 전극 칩을 품어 ° C 인산에 식염수 (PBS)가 10 % LB 미디어와 1 ㎜ CaCl 2와 함께 보충 버퍼.
- 후 형광 현미경 (그림 2B)을 사용하여 부화, 이미지.
3. 키토산의 전착
- 악어 클립을 통해 전극에 전원 공급 장치를 연결합니다. 금이 코팅된 실리콘 칩은 음극 (전극 작업) 역할을하며 백금 호일은 양극 (반대 전극)이 될 것입니다. 금 전극의 표면의 위치를 이렇게 일에서 그것은 카운터 전극을 반대하고 모두 해결하거나 증착 솔루션 표면에 포함된되는 수평 등으로 담근 수 중 수직 위치가 결정됩니다.
- 물에 키토산 부스러기를 혼합하여 키토산 용액을 준비하고 서서히 M HCL은 메이어 외. 15 일까지 설명된 절차를 수행하십시오 만드는 다당류 (최종 산도 5.6) 해산하기 위해 2를 추가.
- 완전히 증착을위한 원하는 영역을 잠수함이 잠수, 키토산 용액 (0.8 %)에 전극을 삽입합니다. 키토산로는이 fluorescently 5 레이블 수 (-와-6) - carboxyrhodamine 6G succinimidyl 에스테르 (Invitrogen), 우 외에 따라 8, 형광 현미경에 의한 이미지 전착된 필름에..
- 2 분 동안 일정한 전류 밀도 (4 / M 2)를 적용합니다. 전압 2-3의 범위 내에서 이동 V. depositio에 노출된 작업 전극의 금색 표면 영역의 함수로 전류 밀도를 계산합니다N 솔루션입니다.
- 불필요한 키토산를 제거하는 DI 워터로 전극을 씻어. 칩은 물 또는 PBS (10 MM, 산도 7.0)에 저장할 수 있습니다.
- 형광 현미경 (그림 3C)를 사용하여 이미지.
4. 기능화 키토산 필름과 전기 화학 형질 도입
- 4의 전류 밀도 절차 3 (키토산의 전착)에 따라 패턴 전극을 향해 / 평방 미터에서 솔루션 (1 % 키토산, 680 U / ML GOx, 산도 5.6)에서 Codeposit 키토산과 포도당 산화 효소 (GOx). GOx에 속은 키토산 필름이 생성됩니다.
- 작업 전극, 반대 전극과 자세 / 같은 그림 4A에 설명된 기준 전극과 같은 AgCl와 같은 백금 와이어 등 3 전극 시스템으로 취급 전극을 부착합니다.
- NaCl (0.1 M)를 포함하는 인산염 완충 용액 (0.1 M, pH를 7.0)에 전극을 담가.
- Electrochemically 키토산에 단백질을 결합하다chronoamperometry 10을 사용 60에 대해 일정한 전압 (0.9 V)을 적용하여 필름.
- 인산염 완충액에서 칩 (0.1 M, 산도 7.0) 장소 및 unreacted NaCl과 unconjugated GOx을 제거하는 궤도 흔드는에서 10 분간 씻는다.
- 5 밀리미터의 포도당 용액으로 단계 4.2 잠그다에 설명된대로 세 전극 시스템에 다시 첨부합니다. 순환의 voltammetry 사용 0.7에 긍정적인 방향으로 잠재력을 청소 V. 스위프에서 본 산화의 크기 (그림 4B)에 대한 비교와 같은 더 포도당 산화 효소를 포함하지 컨트롤 필름을 사용합니다.
- 포도당 용액에서 전극을 제거하고 인산염 완충액 (0.1 M, pH를 7.0)와 헹굼 후 인산염 완충액 8 ML (0.1 M, pH를 7.0을) 포함한 10 ML의 비커에 전극을 배치. 바이어스 0.6 V까지 GOx-작용 칩은 작동 전극 (그림 4C) 역할을합니다.
- (각 나누어지는가에 의해 포도당 농도를 증가 버퍼에 포도당의 aliquots 추가4 ㎜).
- GOx-작용 키토산 필름의 안정 상태 전류 및 포도당 농도 사이의 표준 커브를 생성합니다.
5. 효소 어셈블리를 사용하여 단백질 작용화
- PDMS를 잘 내에 포함된 인접 금색과 ITO 전극과 패턴 유리 슬라이드를 사용하십시오. 이전 그림과 같이 키토산을 electrodeposit하기 cathodic 잠재력을 가진 편견은 황금 전극. 피펫으로 다음 DI 워터와 PBS에서 간단히 필름을 씻어.
- fluorescently "AI-2 Synthase"16 일 (DyLight 라벨 키트를 사용하여) PBS의 + 100 U / ML Tyrosinase 표시된 파란색 3 μm의의 솔루션을 추가합니다.
- 실온에서 1 H 위해 부화 후 PBS로 필름을 린스.
- 수신기 세포를 (같은 단계 2.1-2.2로 준비)가 포함된 알지네이트요 증착 솔루션을 codeposit 위해 ITO 전극에 양극 잠재력을 적용합니다. 절차 2 2.3-2.6 (알지네이트요의 세포 인구의 Codeposition) 단계를 수행하십시오.
- 생성하려면전송 신호 (AI-2) 효소, rinsing 후 필름이 10 % LB 미디어 및 1mM CaCl 2 보충 PBS 500 μm의 S-adenosyl의 호모 시스테인 (SAH)의 솔루션을 추가합니다. 솔루션의 증발을 방지 37에서 하룻밤 부화 전극을 커버 ° C. 이것은 빨간 형광 단백질 (dsRed) 발생하여 수신기 세포 응답을하실 수 있습니다.
- 인접 전극은 codeposited 수신기 세포 (그림 5B)에 의해 표현 AI-2 Synthase와 붉은 형광의 청색 형광을 캡처하는 필터를 조정하여 형광 현미경으로 몇 군데있을 수 있습니다.
6. 대표 결과
부과되는 전기 신호는 전극 표면과 이러한 자극과 같은 전극 표면에 히드로겔 영화로 입금하는 알긴산과 키토산 등의 다당류의 자기 조립을 유발 근처화된 microenvironments (예, 필드 및 그라디언트)을 만들 수 있습니다. 때문에 t자신의 졸 - 겔 전이는 전극 표면에서 발생하는 필름 전극 패턴 (인물 1B, 3C)를 일치의 지오메 트리와 함께 electroaddressed되어 발생합니다. 이러한 알긴산과 키토산 등 Biocompatible 영화는 생물 학적 구성 요소와 기능화 수있는 표면을 제공합니다. 알지네이트요 사용하여 고유의 세포 집단은 별도의 주소에 codeposited되었습니다. 그들의 electroaddressment 증거는 발신자와 수신기 전지 인구 사이의 상호 작용에 따라 관찰하고 있습니다. 보낸 사람 세포에서 분자 autoinducer-2 (AI-2) diffuses는 dsRed 적색 형광 단백질 (그림 2A)의 표현 그 결과 수신기 세포에 의해 촬영된다. 그림 2B에서는 적색 형광은 수신기가 해결되는 전극에서 관찰된다.
키토산에 존재하는 아민 그룹은 전착뿐만 아니라 작용화에 적합한 표면에 필요한 산도 대응으로 제공하고 있습니다. 우리electrochemically 키토산 필름을 전착된하는 biosensing 효소 포도당 산화 효소 (GOx)를 결합하여 이러한 독특한 성질을 이용. 이 효소는 그때 그때 electrochemically 출력 전류를 생산하는 산화 수있는 과산화수소를 생산하는 효소 반응 (그림 4A)를 통해 포도당을 검출하기위한 기능을 제공합니다. GOx 더 GOx를 포함하지 그 영화들은 반대로 포도당의 존재에 강한 양극 신호를 생성 electrochemically 복합이었다 필름있는 것을 보여주는 이러한 방법으로 화학적 신호는 전기. 그림 4B로 transduced 수 있습니다. 이러한 결과는 GOx은 입금 키토산 필름에 조립 수 있으며, 촉매 활동을 유지 나타냅니다. 또한, 그림 4C는 증가 포도당 농도에 대한 응답으로 생산되는 양극 전류의 단계 증가를 보여줍니다. 그림 4C 또한 현재 표준 곡선은 단계 증가 근처 선형 FAS에서 진행 하는것을 보여준다포도당의 양에 의존 hion 덧붙였다. 이러한 결과는 효소도 키토산 필름으로 활용시 포도당 농도를 증가시키는 그것의 감도를 유지한다는 것을 보여주기. 그것은 이전에 동부 표준시 메이어의 작품에서이 시스템의 특징왔다으로 감지 낮은 한도는 이곳에서 공부되지 않았습니다. 알.
우리는 또한 효소 제어 방식으로 키토산에 대한 정의 펜타-티로신 태그를 포함할 수 있도록 설계 관심있는 효소의 공유 결합 고정을 증명하고있다. 특히,이 과정은 효소 tyrosinase에 의해 매개된다. 그림 5A에서 스키마 (상단), 효소에 의해 묘사된 바와 같이, AI-2 Synthase은 펜타-티로신 태그를 포함합니다. Tyrosinase 다음 covalently 키토산의 아민에 바인딩 O-quinones로 잔류물 '페놀 그룹을 산화, 티로신 태그에 역할을합니다. tyrosinase 조립에 의한 AI-2 Synthase와 키토산 필름 작용화 증거는 그림 5B에서 관찰된다 (그림 5A (아래)). 리시버 세포의 적색 형광 (그림 5B)은 또 하나의 다른 사람에게 AI-2의 확산으로 인해 주소 사이의 상호 작용을 보여줍니다, 그리고 추가로 효소는 키토산 한번 covalently 바인딩된 활동을 유지하기 위해 움직일 수 있음을 나타냅니다.
1. 알긴산의 전착 그림. 알지네이트요의 전착의 () 원리 : 전극 anodically 편견되면서 물의 전기 분해가 지역화된 낮은 산도를 생성할 때, 그 표면에 발생합니다. 탄산 칼슘 입자가 과잉으로 반응양자 인해 칼슘 양이온을 방출하는 입자들이 녹아 있습니다. 알지네이트요의 고분자 체인의 존재에서 이온이 전극에서 가교 히드로겔을 형성, "eggbox"네트워크에 chelated된다. 전극 증가의 거리로서 알지네이트요는 칼슘 이온의 감소 존재로 인해 용액에 남아있는 큰 경향이있다. (B) L 모양의 패턴 ITO 전극은 electrodeposit의 알지네이트요로 사용되었다. PDMS 잘 그린 fluorescently-라벨 알지네이트요 (1 %)와 CaCO 3 (0.5 %) 증착 솔루션을 포함하는 전극으로 해결되었습니다. 2 분 동안 electrodepositing 후에. 3A / M 2의 전류 밀도에서 electroaddressed 알지네이트요의 히드로겔은 형광 현미경으로 몇 군데했습니다.
그림 2. 세포 인구의 Codeposition. 이 E. 사이 (A) 제도 보여주는 상호 작용 대장균의 변종 : 한 인구가 autoinducer-2를 생산 (AI-2), 신호 전달 분자, 그리고 "AI-2를 보낸 사람. '되나 있습니다 다른 인구는 되나 "AI-2 수신기,"AI-2의 기자이며, 발신자의 확산에 의한 AI-2가 접수되면, 그것은 빨간 형광 단백질은 dsRed 표현합니다. (B) AI-2 발신자 인구 전극 쌍 레드 형광 이미지는 왼쪽 전극에서 알지네이트요 함께 codeposited와 AI-2 수신기 인구는 오른쪽 전극에서 알지네이트요 함께 codeposited. 확대보기에만 AI-2 수신기의 dsRed 표현을 보여줍니다.
그림 3. 키토산의 전착. () 제도는 키토산의 산도 종속 전착을 보여주고 있습니다. cathodically 편견 전극에서 물의 전기 분해는이 지역에서 키토산의 졸 - 겔 전이를 자극화된 높은 산도를 (현미경의 음극 근처의 산도 표시기 염료화된 색깔 변화로 표시)됩니다. (B) 아민은 키토산을 제시 내가 줘t 산도 - 응답 특성. 6.3 (키토산의 pKa)의 산도 위 아민은 그 protonated 용해 형태에서 자사의 불용성 겔 형태로 전환을 촉진, deprotonated있다. (C) 패턴 골드 전극은 electrodeposit 키토산으로 사용되었다. 전원 공급 장치에 cathodically 연결된 전극은, 녹색 키토산 (0.8 %) 증착 솔루션 fluorescently-라벨에 열중했다. 2 분 동안 electrodepositing 후에. 4 / M 2의 전류 밀도에서 electroaddressed 키토산 필름은 형광 현미경으로 몇 군데했습니다.
작용 키토산 필름과 그림 4. 전기 형질 도입. () 도식은 세 전극 시스템의 설정을 보여주고 있습니다. 기능화 키토산 필름은 작업 전극, 기준 전극과 같은 카운터 전극과 자세 / AgCl와 같은 백금 와이어 역할을한다. 회를 통해 포도당 수익금의 전기 화학 형질 도입생산 과산화수소가 작동 전극에서 산화 및 발견되지 수있는 표시 전자 효소와 전기 화학 반응. (B) electrochemically 복합 포도당 산화 효소 (GOx)를 포함하는 키토산 필름과 전극의 순환 voltammagram (CV)는 5 밀리미터 포도당 용액에 강한 양극 신호를 보여줍니다. 더 GOx를 포함하지 필름 컨트롤을 역임하고 동일한 솔루션에서 신호가 표시되지 않습니다. (C) 양극 전류 및 포도당 농도 간의 표준 곡선 근처 선형 관계를 (각각 나누어지는 4 밀리미터로 포도당 농도 증가하며 단계 현명한 방식으로 삽입된 페이지 그래프에서 현재의 진폭을 증가)가 표시됩니다.
5 그림. 효소 어셈블리를 사용하여 단백질 작용화합니다. 티로신 - 태그가를 보여주는 (위) 제도는 "AI-2 Synthase"는 covalently tyrosinase 조립에 의해 키토산 필름에 닿는 곳에되고있다. 티로신 잔류물은 oxid가tyrosinase의 작용에 의해 O-quinones에 ized과 공유 결합을 형성 키토산 필름의 아민 그룹과 반응 수 있습니다. (낮은) AI-2 Synthase는 기판 (SAH)에서 AI-2를 생성, 수신기 전지 dsRed 형광 표현에 의해 생성된 AI-2를보고합니다. (B) 골드에 키토산 필름을 보여주는 형광 이미지는 블루 라벨 AI-2 Synthase와 기능화. Adjacently, AI-2 수신기 전지는 이토에 알지네이트요로 codeposited있다. 잘과 부화에 효소 기판의 추가 후, AI-2 수신기 전지는 dsRed 표현합니다.
Discussion
우리의 절차는 생체 고분자 필름의 전착 및 작용화, biofabrication 우리가 학기 과정을 보여줍니다. 세포 biomolecules과 작용화을 통해 우리는 서로와 그들이 즉시 조립되는 전극 주소와 상호 작용 가능한 생물 학적 표면을 만듭니다. 첫 번째 단계는, 전착은 전기 신호에 대한 응답으로, 우리의 연구에 biopolymers, 알긴산과 키토산의 계기로 자기 조립을 통해 이루어진다. 로 산도 기울기가 필름 크기와 속성 6,17 이상의 추가 제어 기능을 제공 전류 밀도와 증착 시간에 따라 제어할 수있는 생성된 앞에서 언급한. 우리는 전류 밀도와 증착 시간 조합의 다양한는 표 1에 표시된 전극에 사용할 수있는 것으로 나타났습니다. 다른 전극의 사용이 가능하지만, 절차에 대한 조정이 필요할 것입니다. 필름 형성의 다른 기술 electrodeposi의 과정과 비교기은 단순하고 신속하고 reagentless입니다. 고가의 장비와 힘드는 준비 광범위한 레퍼토리 필요는 없습니다. 중요한 것은 과정은 사소한 실험적인 편차를 견딜 수 있으며, 문제가 발생하는 경우 쉽게여 시작할 수 있습니다.
키토산은 일차 아민의 높은 콘텐츠에 의해 그것에 수여 중요한 기능적 특성으로 인해 높은 cathodic 산도 기울기에 대응이 가능합니다. 높은 산도 (~ 6.3 자사의 pKa보다 큼)에서 아민은 deprotonated과 키토산은 필름 형성을위한있게 불용성되고있다. 증착에 따라 필름 전극에 부착된 상태로 유지됩니다. 그러나 능력은 원하는 경우 그들을 delaminate하기 위해 존재합니다. 영화는 솔루션의 산도가 pKa 이하로 떨어뜨리지 않는만큼 안정적으로 유지됩니다. 산성 솔루션은 아민을 protonate하고 18 녹이고 때까지 이후의 정전 repulsions가 젤 가득차게됩니다. 즉, 조립 / 분해 과정은 수요와 allo에 가능해입금 영화와 전극의 재사용 제거를위한 WS. 편리 졸 - 겔 전이가 이루어지는되는 pH의 범위는 대부분의 생물 학적 구성 요소가 최적으로 작동하는 그 가까운 거리에 있습니다. 이것은 어셈블리 6시 기능 보존의 프로세스 이상을 만듭니다.
알긴산 필름 형성은 물 양극 전기 분해뿐만 아니라 탄산 칼슘 7의 존재에 의해 촉진된다. 양극에서 지역화된 낮은 산도를 릴리스 칼슘 양이온으로 이어지는 탄산 칼슘을 solubilizes. 이러한 이온들은 전극 표면에 가교 네트워크를 형성 알지네이트요 의해 chelated됩니다. 알긴산 필름은 기본 전극의 재사용을 위해 허용하는 영화를 용해하는 데 사용할 수있는 등 구연산이나 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 같은 다른 chelating 화합물,에서 칼슘 이온에 대한 경쟁에 의해 특히 되돌릴 수 있습니다. 칼슘 이온이 쉽게들 때문에 따라서 알지네이트요 필름은 생리적 조건에 노출되면 상대적으로되기의 구조를 약화와 필름 박리 또는 redissolution 추진 겔 매트릭스에서 cavenged. 이러한 한계를 극복하기 위해 젤을 강화하기 위해 1 M CaCl 2의 영화 인큐베이션 단계를 포함시켰습니다. 또한, 우리는 영화의 인큐베이션 솔루션 (세포 미디어 등) 500 μm의-3 mm의 농도에 CaCl 2와 함께 보충하는 것이 좋습니다.
두 번째 주요 절차와 관련된 생물 학적 구성 요소로 입금 영화의 작용화입니다. 이것은 두 가지, 첫 번째되는 전기 화학 결합, 탁월한 공간적 제어 10와 단백질의 급속한, reagentless 조립을 허용 전략으로 형성될 수 있습니다. 그러나,이 방식으로 작용화는 망할 CIA의 확산에 의해 제한됩니다 - 전극에 필름을 통해 이온뿐만 아니라 HOCl의 확산, 솔루션에 다시 생성되는 반응 중간, 나가 있습니다. 전달할 electrochemically 활성 분자의 능력필름을 통해 읽기 쉬운 전기 신호를 15으로 화학적 및 생물 학적 신호의 전달을 허용합니다. 우리는 covalently AI-2 Synthase을 첨부하여 증명, 키토산에 효소 작용화을위한 두 번째 전략으로 tyrosinase-매개 커플링을 보여주었다. 티로신 태그 9를 포함하는 단백질에 discriminately 역할을 특정 시약, tyrosinase,에 의존 -이 전략은 작용화 프로세스가 제어하고 선택이 될 수 있습니다.
우리는 칩에 자연 경로를 복제하여 다중 주소는 시스템의 유용 성과 biocompatibility을 보여줍니다. 처음에 우리는 별개의 주소에 두명의 세포 집단 (예 : "보낸 사람"과 "수신기") 조직, 그리고 그들은 AI-2를 제공하고 형광 응답을 생성하기 위해 인접한 전극간에 교류 것으로 나타났다. 이 개념은 또한 쳉 외 의해 입증되었습니다. microfluidic 칩 14인치 우리는 또한 상호 작용을 했었 대신 사용배달 AI-2를 합성하는 효소. 이러한 방법으로 합성 세포 통로, AI-2 합성은 biofabrication 통해 복제하고 솔루션처럼 많이 작용했다.
두 경우 모두, 여러 개의 주소를 조립 전착은 하나의 주소로 의도된 경우에도 각각의 증착 솔루션, 전체 전극 배열에 도입해야하기 때문에 주소 사이가 아닌 특정 바인딩을 피할 수있는 도전을 선물한다. 젠틀 아직 철저한 세척이 아닌 바이어스 전극에서 잔류 용액의 대부분을 제거할 수 있으며, microfluidic 채널의 흐름의 사용은 더욱 비 특이성을 최소화 수 있습니다. 특히 키토산과 알지네이트요 주소의 인접 biofabrication를 위해, 우리는 알지네이트요을 electrodepositing, biofunctionalization 단계로 이것을 따라 먼저 키토산 필름을 예금하는 것이 좋습니다,이 후. 우리가 여기를 완료하지 않은 있지만, 우리가 찾은 그 불활성 단백질 (예 : 밀 같은과 키토산 필름을 차단K, BSA 등) 크게 키토산의 aminated 표면에 원치 않는 분자가 아닌 특정 바인딩을 감소.
우리는 세포 biomolecules의 복잡한 배열의 "청사진"로, 종종 bioMEMS 장치에서 발견된 패턴 전극을 확립에서 유틸리티를 발견했다. 의 용도는 여기 언급된 19 bioMEMS 장치의 키토산이 잘 예제를 넘어 갈 수 전착된. 이러한 microchannels 및 비 평면 표면 20,15에 같이 - 키토산은 다양한 microscale 형상에 기탁 수 있습니다. 필름은 다른 고분자와 다양한 단백질, DNA, nanoparticles, 그리고 소설 속성 21,22,23를위한 산화 환원 활성 분자로 수정할 수 있습니다. bioMEMS 장치에서 키토산 필름은 약물 전달, 산화 환원과 작은 분자 감지, biocatalysis, 그리고 세포 연구 20,23,24,25 사용되었습니다. 마찬가지로, 알지네이트요 널리 셀 함정 수사 매트릭스로 사용 및 가역 유체 억제에 대한 탐험되었습니다세포 인구 및 인 - 영화 immunoanalysis 26,27,28. 조직 엔지니어링 애플 리케이션을위한 복합 필름은 이러한 정형 외과 이식 29 히드록 시아파 타이트와 같은 구성 요소로, 알지네이트요의 전착을 사용하여 조작되었다고.
biofabrication 우리의 데모에서 우리는 생물 학적 구성 요소 사이 바이오 전자 인터페이스 전반에 걸쳐 상호 작용을 모두 동일하게 적용되는 것으로 나타났습니다, 이것은 온칩 신호 전송에 정교한 성능을 위해 상호 작용의 모든 품종을 통합의 가능성에 도달로 제공합니다. 따라서 biofabrication는 감소 "최소 기능 크기 '로 장치의 제조를 용이하게 수도 직접 자주 가전 제품에 의해 동기 microfabrication의 급속한 발전, 대에 따릅니다. 즉, 다음 차세대 디바이스는 실제로도 작은 길이 SCA에서 자연의 절묘한 조립 및 인식 기능을 제공하고 불안 정한 생물 학적 구성 요소를 포함할 수 있습니다인간이 만든 시스템보다 레. 우리는 분석 계측, 환경 센서, 심지어 biocompatible implantable 장치 단기적 응용 프로그램을 구상.
Disclosures
이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스는 미국 국방 위협 감소 기관에 의해 후원된다.
Acknowledgments
우리는 기본적인 연구의 부분적인 지원을 위해 원고의 지원과 ONR, DTRA 및 NSF로부터 DTRA에서 기금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
