Summary
Este artículo describe un enfoque biofabrication: deposición de estímulos-respuesta polisacáridos en la presencia de electrodos sesgadas para crear películas biocompatibles que pueden ser funcionalizados con células o proteínas. Se demuestra una estrategia de sobremesa para la generación de las películas, así como sus usos básicos para crear superficies interactivas biofuncionalizadas de laboratorio-en-un-chip de aplicaciones.
Abstract
Los avances en la promesa de la tecnología de laboratorio-en-un-chip para revolucionar la investigación y la medicina a través de menores costos, una mejor sensibilidad, portabilidad, y un mayor rendimiento. La incorporación de componentes biológicos biológicos Desciende en sistemas microelectromecánicos (bioMEMS) ha mostrado un gran potencial para el logro de estos objetivos. Microfabricated chips electrónicos para permitir características escala micrómetro-así como una conexión eléctrica para la detección y accionamiento. Funcionales componentes biológicos dar al sistema la capacidad para la detección específica de analitos, funciones enzimáticas y las capacidades de células enteras. Los procesos estándar de microfabricación y técnicas de bio-analíticos se han utilizado con éxito durante décadas en las industrias de la informática y biológica, respectivamente. Su combinación y la interconexión en un entorno de laboratorio-en-un-chip, sin embargo, da a luz a nuevos desafíos. Hay una convocatoria de técnicas que puede crear una interfaz entre el electrodo y COMPON biológicaENT que es suave y es fácil de fabricar y el patrón.
Biofabrication, que se describe aquí, es un enfoque de tal manera que se ha demostrado una gran promesa para su fácil montaje incorporación de los componentes biológicos con una versatilidad en las funciones en el chip que están habilitadas. Biofabrication utiliza materiales biológicos y los mecanismos biológicos (auto-ensamblaje, ensamblaje enzimática) de abajo hacia arriba asamblea jerárquica. Mientras que nuestros laboratorios han demostrado que estos conceptos en muchos formatos 1,2,3, aquí se demuestra el proceso de montaje sobre la base de electrodeposición seguido de múltiples aplicaciones de base de la señal de las interacciones. El proceso de montaje consiste en la electrodeposición de películas de polímeros biocompatibles estímulos-respuesta en los electrodos y su funcionalización posterior con componentes biológicos tales como ADN, enzimas, o células vivas 4,5. La electrodeposición se aprovecha de la gradiente de pH creado en la superficie de un electrodo sesgado de la electrólisisde agua 6,7,. El quitosano y alginato son sensibles a estímulos polímeros biológicos que se pueden activar a la auto-ensamblan para formar películas de hidrogel en respuesta a señales eléctricas impuestas por el 8. El espesor de estos hidrogeles se determina por el grado en que el gradiente de pH se extiende desde el electrodo. Esto se puede modificar mediante diferentes densidades de corriente y los tiempos de deposición 6,7. Este protocolo se describe cómo las películas de quitosano se depositan y funcionalizado por unión covalente de los componentes biológicos de los grupos amina primarios abundantes presentes en la película a través de cualquiera de los métodos enzimáticos o electroquímica 9,10. Películas de alginato y su atrapamiento de células vivas también se abordarán 11. Finalmente, la utilidad de biofabrication se demuestra mediante ejemplos de la señal basada en la interacción química, incluyendo-a-eléctrica, de célula a célula, y también enzima-a-célula de transmisión de la señal.
Tanto la electrodeposicióny funcionalización puede llevarse a cabo en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas sin la necesidad de reactivos y, por tanto sobra lábiles componentes biológicos de las duras condiciones. Además, tanto el quitosano y alginato han sido utilizados para los propósitos biológicamente relevantes 12,13. En general, biofabrication, una técnica rápida que puede ser simplemente realiza en una mesa de trabajo, se puede utilizar para crear patrones micras escala de funcionales componentes biológicos en los electrodos y se puede utilizar para una variedad de laboratorio en un chip aplicaciones.
Protocol
1. Alginato de electrodeposición
- Conecte una fuente de alimentación a los electrodos personalizados fabricados a través de los cables de conexión con pinzas de cocodrilo. Un óxido de indio y estaño (ITO) cubierto portaobjetos de vidrio actuará como el ánodo (electrodo de trabajo) y una lámina de platino servirá como el cátodo (contra-electrodo). Coloque los electrodos manera que la superficie ITO para ser funcionalizados se opone a la contra-electrodo y se coloca en forma vertical que se sumerge en una solución o horizontalmente de tal manera que la solución de deposición está contenida en la superficie.
- Preparar una solución de deposición química mediante la mezcla de alginato al 1% de alginato y el 0,5% de CaCO 3 (en peso) en agua destilada y luego autoclave la solución. Se recomienda para agitar continuamente la solución cuando no esté en uso.
- Sumergir los dos electrodos en la solución de deposición. El alginato utilizado puede ser marcada con fluorescencia con fluoroesferas (Invitrogen), como por Cheng et al. 14, para permitir fluorescence imágenes de la película resultante.
- Aplicar una densidad de corriente constante (3 A / m 2) durante 2 minutos; tensión se desplazará dentro del intervalo de 2-3 V.
- Desconectar el electrodo y se retira la solución no depositado. Enjuagar suavemente la película con NaCl (0,145 M) para eliminar alginato superfluo.
- Incubar la breve película (~ 1 minuto) en CaCl 2 (0,1 M) para fortalecer el gel. Enjuagar con NaCl (0,145 M) y se incuba en una solución deseada suplementado con CaCl 2 (1 mM).
- Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 1B).
2. Co-deposición de las poblaciones celulares Comunicación en alginato
- Una señal-emisor de cultivo celular (W3110 peso de E. coli), que se cultiva en medio LB, y un cultivo de células de la señal-receptor (MDAI2 + pCT6-LSRR - amplificador de I + pET-dsRed - kan r), que se cultiva en medio LB + 50 ug / ml cada uno de kanamicina y ampicilina, debe ser crecido durante la noche unand de re-inoculado para el crecimiento hasta una densidad óptica (a 600 nm) de 1. Ajustar la densidad óptica del cultivo celular receptor a 0.4-0.6 con LB antes de su uso.
- Preparar una solución de deposición química de 2% y 1% de alginato de CaCO 3, y se mezcla con cada cultivo de células en una proporción de 1:1 a una concentración final de 1% de alginato, 0,5% de CaCO 3, con las células diluidas a una densidad de aproximadamente media la densidad de cultivo.
- Utilizar un portaobjetos de vidrio estampada con dos electrodos ITO contenidas por un polidimetilsiloxano (PDMS) bien (preparado de acuerdo con las instrucciones Sylgard y cortar al tamaño deseado) y un electrodo de platino contador. Conectar un electrodo de ITO a una fuente de alimentación con el platino como se describe en el Procedimiento 1 (electrodeposición alginato).
- Sumergir los electrodos en una solución de deposición que contiene las células receptoras. Establecer el suministro de energía a una corriente constante a una densidad de 3 A / m 2, donde se define la dimensión del área superficial por el único electrodo en el que Deposition va a producir.
- Aplicar la corriente durante 2 minutos para permitir la co-deposición de las células en la matriz de alginato.
- Lavar la película como se describe en el Paso 1,5.
- Cambiar la conexión anódica a la segunda, el electrodo adyacente, de ITO.
- Repetir el procedimiento de deposición (Pasos 2,4 - 2,7), pero esta vez la introducción de la solución que contiene las células del remitente.
- Incubar el chip 2-electrodo que contiene células codepositado y alginato de calcio-durante la noche a 37 ° C en tampón fosfato salino (PBS) suplementado con medio LB 10% y 1 mM de CaCl 2.
- Después de la incubación, la imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 2B).
3. El quitosano Electrodeposición
- Conecte el suministro de energía a los electrodos a través de pinzas de cocodrilo. Un chip de silicio recubierto de oro actuará como el cátodo (electrodo de trabajo) y una lámina de platino servirá como el ánodo (contra-electrodo). Posición de la superficie del electrodo de oro, de modo ªen ella se opone a la contra-electrodo y ambos están posicionados en forma vertical que se sumerge en una solución o horizontalmente de tal manera que la solución de deposición está contenida en la superficie.
- Preparar una solución de quitosano mezclando copos quitosán en agua y añadiendo lentamente HCl 2 M para disolver los polisacáridos (pH final 5,6), asegurándose de que siga el procedimiento descrito por Meyer et al. 15.
- Colocar los electrodos en una solución de quitosano (0,8%), sumergiendo completamente el área deseada para la deposición. El quitosano utilizado puede ser marcada con fluorescencia con 5 - (y-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidil éster (Invitrogen), como por Wu et al 8, a la imagen de la película electrodepositada por microscopía de fluorescencia..
- Aplicar una densidad de corriente constante (4 A / m 2) durante 2 minutos. Tensión se desplazará dentro del intervalo de 2-3 V. Calcular la densidad de corriente como una función del área de superficie de oro del electrodo de trabajo expuesto a la Deposition solución.
- Enjuagar el electrodo con agua desionizada para eliminar superfluos quitosano. El chip puede ser almacenado en agua o PBS (10 mM, pH 7,0).
- Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia (Figura 3C).
4. Electroquímica Transducción con una película funcionalizado quitosano
- Codepósito quitosano y glucosa oxidasa (GOx) de una solución (1% de quitosano, 680 U / ml GOx, pH 5,6) a una densidad de corriente de 4 A / m 2 sobre un electrodo de modelado de acuerdo con el Procedimiento 3 (electrodeposición quitosano). Una película de quitosano atrapado en GOx será generada.
- Una el electrodo tratado a un sistema de tres electrodos como el electrodo de trabajo, un alambre de platino como el contra-electrodo y Ag / AgCl como electrodo de referencia, como se describe en la Figura 4A.
- Sumergir los electrodos en una solución tampón de fosfato (0,1 M, pH 7,0) que contenía NaCl (0,1 M).
- Electroquímicamente conjugar la proteína a la quitosanapelícula mediante la aplicación de un voltaje constante (0,9 V) para 60s utilizando cronoamperometría 10.
- Coloque el chip en tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) y se lava durante 10 minutos en un agitador orbital para eliminar cualquier GOx sin reaccionar NaCl y no conjugada.
- Vuelva a colocar el sistema de tres electrodos como se describe en el paso 4.2 y sumergirse en una solución de glucosa 5 mM. Usando voltametría cíclica, barrer el potencial en una dirección positiva a 0,7 V. Utilizar una película de control que no contiene glucosa oxidasa como una comparación de la cantidad de oxidación se ve en el barrido (Figura 4B).
- Retirar los electrodos de la solución de glucosa y enjuague con tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0) a continuación, colocar los electrodos en un vaso de precipitados de 10 ml que contiene 8 ml de tampón fosfato (0,1 M, pH 7,0). El sesgo del chip GOx funcionalizado a 0,6 V para servir como el electrodo de trabajo (Figura 4C).
- Añadir alícuotas de glucosa a la memoria intermedia (cada alícuota aumenta la concentración de glucosa por4 mM).
- Generar una curva estándar entre el actual estado de equilibrio y la concentración de glucosa para la película GOx funcionalizado quitosano.
5. La proteína enzimática funcionalización Uso de la Asamblea
- Utilizar un portaobjetos de vidrio con un patrón de oro adyacente y el electrodo de ITO contenida dentro de un pozo de PDMS. El sesgo el electrodo de oro con un potencial catódico para electrodepósito de quitosano como se muestra anteriormente. Enjuagar película brevemente en agua desionizada y luego PBS mediante pipeta.
- Añadir una solución de 3 micras azules marcadas fluorescentemente "AI-2 sintetasa" 16 (utilizando un kit de marcaje DyLight) + 100 U / ml en PBS tirosinasa.
- Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente, luego enjuagar la película con PBS.
- Aplicar un potencial anódico al electrodo ITO para codepósito una solución de deposición química de alginato que contiene células receptoras (como se preparó en pasos 2.1-2.2). Siga los pasos 2.3-2.6 de Procedimiento 2 (co-deposición de las poblaciones celulares en alginato).
- Para generarla señal transmitida (AI-2) enzimáticamente, después de aclarar las películas añadir una solución de 500 mM de S-adenosil homocisteína (SAH) en PBS, suplementado con 10% de medios LB y 1 mM de CaCl 2. Cubrir los electrodos para evitar la evaporación de la solución y se incuba durante una noche a 37 ° C. Esto permitirá una respuesta de las células del receptor mediante la generación de una proteína fluorescente de color rojo (dsRed).
- Electrodos adyacentes pueden ser reflejados con microscopía de fluorescencia mediante el ajuste de los filtros para capturar la fluorescencia azul de la sintetasa de AI-2 y fluorescencia roja expresado por las células del receptor codepositado (Figura 5B).
6. Los resultados representativos
Impuestas las señales eléctricas pueden crear microambientes localizados (por ejemplo, los campos y gradientes) cerca de una superficie del electrodo y estos estímulos pueden desencadenar el auto-ensamblaje de los polisacáridos como el alginato y el quitosano para depositar una película de hidrogel en la superficie del electrodo. Debido a que tsu transición sol-gel se produce en la superficie del electrodo, la película resultante se electroaddressed, con su geometría que coincida con el modelo de electrodos (Figuras 1B, 3C). Películas biocompatibles tales como alginato y quitosano proporcionar superficies que pueden ser funcionalizados con componentes biológicos. Uso de alginato, poblaciones únicas de células se han codepositado en direcciones separadas. Evidencia de su electroaddressment se observa en la interacción entre el emisor y el receptor población celular. La molécula autoinductora-2 (IA-2) se difunde desde las células del remitente y es absorbido por las células del receptor, lo que resulta en la expresión de la proteína dsRed rojo fluorescente (Figura 2A). En la Figura 2B, fluorescencia roja se observó sólo en el electrodo donde se tratan los receptores.
Los grupos amina presentes en quitosano se proporcionan con la capacidad de respuesta pH requerido para la electrodeposición así como una superficie adecuada para funcionalización. Nosotrosutilizado estas propiedades únicas por vía electroquímica conjugar la enzima glucosa oxidasa biosensores (GOx) para electrodepositado quitosano películas. Esta enzima a continuación proporciona la capacidad para la detección de glucosa a través de una reacción enzimática (Figura 4A) que produce peróxido de hidrógeno que puede ser oxidado electroquímicamente para producir una corriente de salida. De esta manera, una señal química puede ser transducidas a la Figura eléctrica. 4B muestra que las películas en las que GOx fue electroquímicamente conjugado producir una fuerte señal anódica en presencia de glucosa en comparación con aquellas películas que no contienen GOx. Estos resultados indican GOx puede ser montado sobre una película depositada quitosano y conservará su actividad catalítica. Además, la Figura 4C muestra un paso aumento en la corriente anódica produce en respuesta a las concentraciones de glucosa en aumento. La curva estándar también presente en la Figura 4C muestra que los aumentos de paso procedió en un FAS lineal cercaHion depende de la cantidad de glucosa añadida. Estos resultados muestran que la enzima también conserva su sensibilidad a aumentar las concentraciones de glucosa en la conjugación a la película de quitosano. El límite inferior de detección no se estudió aquí como se ha caracterizado previamente para este sistema en el trabajo de Meyer et. col.
También hemos demostrado la inmovilización covalente de un enzima de interés, diseñado para contener una costumbre penta-tirosina etiqueta, al quitosano en una manera controlada enzimáticamente. Específicamente, este proceso está mediada por la enzima tirosinasa. Como se muestra en el esquema en la Figura 5 (arriba), una enzima, la sintasa de AI-2 incluye una etiqueta de penta-tirosina. La tirosinasa actúa sobre la etiqueta tirosina, oxidar grupos los residuos de fenol a O-quinonas, que luego se unen covalentemente a las aminas de quitosano. Evidencia de funcionalización película quitosana con la sintetasa de AI-2 por la tirosinasa montaje se observa en la Figura 5B (Figura 5A (inferior)). Fluorescencia roja de las células del receptor (Figura 5B) demuestra nuevamente la interacción entre las direcciones debido a la difusión de AI-2 a partir de una a la otra, y se indica además que las enzimas inmovilizadas para retener la actividad quitosano una vez unido covalentemente.
Figura 1. Electrodeposición alginato. (A) Mecanismo de electrodeposición alginato: Como un electrodo se anódicamente sesgada, la electrólisis del agua se produce en su superficie, generando un bajo pH localizado. Partículas de carbonato de calcio reacciona con el excedentede protones, liberando cationes de calcio como las partículas se disuelven. En la presencia de cadenas de polímero de alginato, los iones se quelado en un "eggbox" red, formando un hidrogel reticulado en el electrodo. A medida que la distancia de los aumentos de los electrodos, alginato tiene una mayor tendencia a permanecer en solución debido a la presencia reducida de iones de calcio. (B) Una forma de L con patrón electrodo ITO fue utilizado para alginato electrodepósito. Un PDMS bien se fijó al electrodo para contener un alginato verde marcadas con fluorescencia (1%) y CaCO 3 (0,5%) solución de deposición. Después de electrodeposición durante 2 min. a una densidad de corriente de 3A / m 2, el hidrogel de alginato electroaddressed fue fotografiada por microscopía de fluorescencia.
Figura 2. Codeposición de poblaciones celulares. (A) Esquema que muestra la interacción entre los dos E. cepas de E. coli: una población produce autoinductor-2 (IA-2), Una molécula de señalización, y se llama "AI-2 del remitente." La otra población, calificó de "AI-2 del receptor," es un reportero de la IA-2, tras la recepción de AI-2 por la difusión del remitente, que expresa la proteína fluorescente de color rojo DsRed. (B) la imagen de fluorescencia roja par de electrodos con la población de AI-2 del remitente codepositado con alginato en el electrodo de la izquierda y el AI-2 receptor de la población codepositado con alginato de electrodo de la derecha. La vista ampliada demuestra la expresión de la dsRed sólo los receptores de AI-2.
Figura 3. Electrodeposición quitosano. (A) Esquema que muestra la electrodeposición dependiente del pH de quitosano. Electrólisis del agua en un electrodo de catódicamente sesgada provoca un pH localizado alta (que se muestra por un cambio de color localizada de un colorante indicador de pH cerca del cátodo en la micrografía) que estimula la transición sol-gel de quitosana en esta región. (B) Las aminas presentes en quitosano doyt pH sensibles propiedades. Por encima de un pH de 6,3 (pKa de quitosano) las aminas se desprotona, facilitando una transición de su forma soluble protonado a su forma de gel insoluble. (C) Un electrodo de oro modelado se utilizó para electrodepósito de quitosano. El electrodo, conectado catódicamente a la fuente de alimentación, se sumergió en un verde fluorescente marcado con quitosano (0,8%) solución de deposición. Después de electrodeposición durante 2 min. a una densidad de corriente de 4 A / m 2, la película electroaddressed quitosano fue fotografiada por microscopía de fluorescencia.
Figura 4. Electroquímico de transducción con una película funcionalizado quitosano. (A) Esquema que muestra la configuración de un sistema de tres electrodos. Funcionalizado película quitosano sirve como electrodo de trabajo, un alambre de platino como electrodo contador y Ag / AgCl como electrodo de referencia. Electroquímico de transducción de los ingresos de glucosa a través ªe reacciones enzimáticas y electroquímico mostrado en peróxido de hidrógeno producido puede ser oxidado y se detecta en el electrodo de trabajo. (B) cíclico voltammagram (CV) en el electrodo con una película de quitosano que contiene glucosa oxidasa electroquímicamente conjugado (GOx) muestra una fuerte señal anódica en una solución de glucosa 5 mM. Una película que no contiene GOx sirvió como un control y muestra ninguna señal en la misma solución. (C) Una curva estándar entre la corriente anódica y la concentración de glucosa muestra una relación casi lineal (cada alícuota aumentó la concentración de glucosa por 4 mM y también aumentó la amplitud de la corriente en el gráfico de la inserción de una manera paso a paso).
Figura 5. Funcionalización proteína utilizando ensamblaje enzimático. (A, superior) Esquema que muestra la tirosina-etiquetado como "IA-2 sintasa" está atado de forma covalente a una película de quitosano por la asamblea la tirosinasa. Los residuos de tirosina convertido en óxidozado para O-quinonas por acción tirosinasa y puede reaccionar con grupos amino sobre la película de quitosano, formando un enlace covalente. (A menos) La sintasa de AI-2 genera el AI-2 a partir de un sustrato (HSA), las células del receptor del informe generado por el AI-2 por la expresión de fluorescencia dsRed. (B) Imágenes de fluorescencia que muestra una película de quitosano en el oro, funcionalizada con azul marcado con el AI-2 sintasa. Adyacente, AI-2 células del receptor se codepositado con alginato de la OIC. Después de la adición del sustrato enzimático para el pozo y la incubación, las células del receptor AI-2 Express DsRed.
Discussion
Nuestros procedimientos de demostrar la electrodeposición y funcionalización de películas de biopolímeros, un proceso que llamamos biofabrication. A través de funcionalización con las células y biomoléculas que crear superficies biológicas capaces de interactuar entre sí y la dirección de electrodos están montados sobre. El primer paso, electrodeposición, se lleva a cabo a través de la activa auto-ensamblaje de biopolímeros, alginato y quitosano en nuestros estudios, en respuesta a una señal eléctrica. Como se indicó anteriormente un gradiente de pH se genera que puede ser controlado por la densidad de corriente y el tiempo de deposición, proporcionando un control adicional sobre las dimensiones y propiedades de película 6,17. Hemos encontrado que una variedad de densidad de corriente y combinaciones de deposición de tiempo puede ser utilizado para los electrodos indicados en la Tabla 1. Mientras que el uso de otros electrodos es factible, ajustes en el procedimiento sería necesario. En comparación con otras técnicas de formación de la película el proceso de electrodeposición es simple, rápida y reactivos,. No hay necesidad de un extenso repertorio de equipos costosos y laboriosos preparativos. Es importante destacar que el proceso puede soportar pequeñas desviaciones experimentales y se pueden iniciar fácilmente por si ocurre algún problema.
El quitosano es capaz de responder a un gradiente de pH alto catódica debido a importantes propiedades funcionales que le confiere un alto contenido de aminas primarias. A pH elevado (mayor que su pKa de ~ 6,3) las aminas se desprotona y quitosano se vuelve insoluble, lo que permite la formación de película. Tras la deposición, las películas permanecerá unida al electrodo. Sin embargo, existe la capacidad para deslaminar si se desea. Las películas se mantiene estable siempre y cuando el pH de la solución no caiga por debajo del pKa. Las soluciones ácidas protonar las aminas y las repulsiones electrostáticas posteriores engrosar el gel hasta que se disuelva 18. Es decir, el proceso de montaje / desmontaje es reversible en la demanda y alloeb para la eliminación de películas depositadas y la reutilización de los electrodos. Convenientemente, el rango de pH en el que la transición sol-gel tiene lugar está cerca de aquel en el que los componentes más biológicos funcionar de manera óptima. Esto hace que el ideal procedimiento para la retención de la funcionalidad durante el montaje 6.
Formación alginato película se ve facilitada por la electrólisis anódica de agua, así como la presencia de carbonato de calcio 7. El pH bajo localizada en el ánodo solubiliza el carbonato de calcio que conduce a los cationes de liberación de calcio. Estos iones están quelado por alginato, formando una red reticulada sobre la superficie del electrodo. Películas de alginato son notablemente reversible por la competencia por los iones de calcio procedentes de otros compuestos quelantes tales como citrato o EDTA, que pueden ser utilizados para disolver las películas, lo que permite la reutilización de los electrodos subyacentes. Así, las películas de alginato son relativamente frágiles cuando se somete a condiciones fisiológicas debido a los iones de calcio son fácilmente scavenged de la matriz de gel, lo que debilita su estructura y la promoción de delaminación o redisolución. Para superar esta limitación, se ha incluido una etapa de incubación para la película en 1 M CaCl 2 para reforzar el gel. Además, se recomienda que la solución de la película de incubación (medios celulares, etc) se suplementado con CaCl 2 a una concentración de 500 mM-3 mM.
El procedimiento mayor segunda es la funcionalización de la película depositada con los correspondientes componentes biológicos. Esto se puede conseguir de dos maneras, siendo la primera conjugación electroquímica, una estrategia que permite un montaje rápido, reactivos, de las proteínas con un control excepcional espacial 10. Sin embargo, la funcionalización de esta manera está limitada por la difusión de los iones Cl - a través de la película al electrodo, así como la difusión de HOCl, la generada intermedio reactivo, de vuelta a cabo en solución. La capacidad de las moléculas electroquímicamente activas para pasara través de la película permite la transducción de señales químicas y biológicas en fácil de leer las señales eléctricas 15. Hemos demostrado la tirosinasa mediada por acoplamiento como una segunda estrategia para funcionalización enzima a quitosano, demostrado por unión covalente de AI-2 sintasa. Esta estrategia permite que el proceso de funcionalización a ser controlada y selectiva - depende de un reactivo específico, la tirosinasa, que actúa en forma discriminatoria las proteínas que contienen una etiqueta de la tirosina 9.
Se demuestra la utilidad y la biocompatibilidad de los sistemas multi-dirección mediante la replicación de las vías naturales en un chip. En primer lugar se organizaron dos poblaciones de células (es decir "remitentes" y "receptores") en direcciones distintas, y demostró que se relacionaban a través de electrodos adyacentes para entregar el AI-2 y generar una respuesta de fluorescencia. Este concepto también se ha demostrado por Cheng et al. en un 14 chip de microfluidos. También imitó la interacción, pero en lugaruna enzima para sintetizar el AI-2 para la entrega. De este modo, una vía de síntesis intracelular, AI-2 síntesis, se replica a través biofabrication y funcionaban tanto como lo haría en solución.
En ambos casos, el montaje de varias direcciones presenta el desafío de evitar no específicos de unión entre las direcciones porque cada solución de deposición deben ser introducidos a la matriz de electrodos todo, aunque electrodeposición sólo está destinado a una dirección. Lavado suave pero completa puede eliminar la mayor parte de la solución residual de electrodos e imparciales, el uso del flujo en canales de microfluidos puede además reducir al mínimo la no especificidad. En particular, para la biofabrication adyacente de quitosano y direcciones de alginato, se recomienda depositar la película de quitosano primero, después de esto con pasos biofuncionalización, y después de esto, electrodepositing alginato. A pesar de que no lo han hecho aquí, hemos encontrado que el bloqueo de la película de quitosano con proteínas inertes (tales como milésimask, BSA, etc) disminuye en gran medida no específicos de unión de las moléculas no deseadas a la superficie del quitosano aminado.
Hemos encontrado utilidad en el establecimiento de electrodos con dibujos, a menudo se encuentran en dispositivos bioMEMS, como los "planos" de un arreglo complejo de células y biomoléculas. Los usos de electrodepositado quitosano en dispositivos bioMEMS puede ir mucho más allá de los ejemplos aquí mencionados 19. El quitosano se puede depositar sobre diversos geometrías microescala, como en microcanales y sobre superficies no planas de 20,15. Las películas también se pueden modificar con otros polímeros y una variedad de proteínas, ADN, nanopartículas y moléculas activas redox para 21,22,23 propiedades novedosas. En los dispositivos bioMEMS, las películas de quitosano se han utilizado para la administración de fármacos, la detección de moléculas redox y pequeño, biocatálisis, y los estudios de células 20,23,24,25. De manera similar, el alginato se utiliza ampliamente como una matriz de células-atrapamiento y ha sido explorado para la contención de fluidos reversiblelas poblaciones de células y en la película inmunoanálisis 26,27,28. Películas compuestas para aplicaciones de ingeniería de tejidos han sido fabricados utilizando electrodeposición alginato, con componentes tales como con hidroxiapatita para implantes ortopédicos 29.
En nuestras manifestaciones de biofabrication, hemos demostrado tanto las interacciones entre los componentes biológicos ya través de la interfaz de bio-electrónico para ser igualmente aplicables; esto trae en llegar a la perspectiva de la integración de todas las variedades de interacciones para un rendimiento sofisticado en la transmisión de señales en el chip. En consecuencia, biofabrication puede facilitar la fabricación de dispositivos con la reducción de tamaños de la característica "mínimo", como una consecuencia directa de la rápida evolución de la microfabricación, como a menudo motivados por la electrónica de consumo. Es decir, próximos dispositivos de próxima generación podría, de hecho, son lábiles componentes biológicos que ofrecen conjunto exquisito de la naturaleza y las capacidades de reconocimiento en detalle aún más pequeño scales de los sistemas artificiales. Tenemos la visión de corto plazo en aplicaciones de instrumentación analítica, sensores ambientales, y los dispositivos implantables, incluso biocompatibles.
Disclosures
La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por la Agencia de los Estados Unidos de Defensa de Reducción de Amenazas.
Acknowledgments
Reconocemos la financiación de la DTRA para el apoyo de este manuscrito y de la ONR, DTRA, y la NSF para el apoyo parcial de la investigación subyacente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
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