Summary
Bu makale, bir biofabrication yaklaşımı tarif: hücreleri ya da proteinler ile fonksiyonelleştirilmiş edilebilir biyouyumlu filmler oluşturmak üzere yanlı elektrotlar varlığında uyaran-tepkisel polisakaritler çökelmesi. Biz, laboratuar-on-a-çip etkileşimli uygulamalar için biofunctionalized yüzeyler oluşturmak için filmler gibi temel kullanımların üretimi için, bir tezgah üstü stratejisi göstermektedir.
Abstract
Düşük maliyet, daha iyi hassasiyet, taşınabilirlik ve yüksek verimlilik aracılığıyla araştırma ve tıp hem devrim laboratuvar-on-a-chip teknolojisi vaadi alanındaki gelişmeler. Biyolojik mikroelektromekanik sistemler (bioMEMS) üzerine biyolojik bileşenlerin eklenmesi bu hedeflere ulaşmak için büyük potansiyel göstermiştir. Microfabricated elektronik çipler mikrometre ölçekli özelliklerin yanı sıra algılama ve kumanda için bir elektrik bağlantısına izin verir. Fonksiyonel biyolojik bileşenlerin sistemi analitler, enzimatik fonksiyonları ve tam hücreli yetenekleri belirli algılama kapasitesini verir. Standart mikroimalat süreçleri ve biyo-analitik teknikler başarıyla sırasıyla, bilgisayar ve biyolojik sektörlerde yıllardır kullanılmıştır. Bir laboratuar-on-a-chip ortamda bunların kombinasyonu ve arayüz Ancak, ortaya yeni sorunlar getiriyor. Elektrotu ve biyolojik compon arasında bir arabirim oluşturabilir teknikleri için bir çağrı varhafiftir ve ent imal ve desen kolaydır.
Biofabrication, burada açıklanan, etkin çip fonksiyonları çok yönlülük ile biyolojik bileşenlerin kendi kolay montaj dahil edilmesi için büyük umut göstermiştir böyle bir yaklaşımdır. Biofabrication aşağıdan yukarıya hiyerarşik montaj için biyolojik materyal ve biyolojik mekanizmaları (self-montaj, enzimatik montaj) kullanır. Laboratuvarlarımızda birçok biçimleri 1,2,3 bu kavramları göstermiştir iken, burada sinyal tabanlı etkileşim birden çok uygulama tarafından takip elektrodepozisyon dayalı montaj işlemi göstermektedir. Montaj işlemi elektrotlar ve DNA, enzimler, ya da 4,5 canlı hücreleri gibi biyolojik bileşenleri ile bunların sonraki fonksiyonlandırmalar üzerine biyouyumlu uyaranlara duyarlı polimer filmlerin elektrodepozisyon oluşur. Elektrodepozisyon elektroliz bir yanlı elektrot yüzeyinde oluşturulan pH gradyanı yararlanırsu 6,7,. Kitosan ve aljinat dayatılan elektrik sinyalleri 8 yanıt hidrojel filmlerinde kendine monte tetiklenebilir uyaranlara duyarlı biyolojik polimerlerdir. Bu hidrojeller kalınlığı pH elektrodu gradyanı uzanan üzere ölçüde tarafından belirlenir. Bu değişen akım yoğunluğu ve çökelme süreleri 6,7 kullanılarak değiştirilebilir. Bu protokol kitosan filmlerin kovalent enzimatik veya elektrokimyasal yöntemler 9,10 yoluyla ya film üzerinde mevcut bol primer amin gruplarının biyolojik bileşenleri ekleyerek yatırılır ve fonksiyonelleştirilmiş nasıl anlatacağız. Aljinat filmleri ve canlı hücrelerin kendi tuzak da 11 ele alınacaktır. Son olarak, biofabrication bir yardımcı-kimyasal etmek-elektriksel, hücre-hücre için, ve ayrıca enzim için hücre sinyal iletimi gibi sinyal bazlı etkileşim örnekler yoluyla gösterilmiştir.
Elektrodepozisyon ikive işlevsel reaktifler için gerek kalmadan yakın fizyolojik koşullar altında gerçekleştirilir ve böylece sert koşullar gelen labil biyolojik bileşenlerini ayırmak edilebilir. Buna ek olarak, kitosan ve aljinat her iki uzun biyolojik olarak uygun-amaçlar 12,13 için kullanılmıştır. Genel olarak, biofabrication, basitçe bir tezgah üstü üzerinde gerçekleştirilebilir hızlı bir teknik, elektrotlar üzerinde işlevsel biyolojik bileşenlerin mikron ölçeğinde desen oluşturmak için de kullanılabilir ve laboratuar-on-a-çip çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir.
Protocol
1. Aljinat Elektrodepozisyon
- Timsah klipler kullanarak patch kablo ile özel fabrikasyon elektrotlar için bir güç kaynağı bağlayın. Bir indiyum kalay oksit (ITO) cam slayt anot olarak hareket edecek (çalışan elektrotlar) ve platin folyo katot (karşı elektrot) olarak görev yapacak kaplıdır. Fonksiyonelleştirilmiş edilecek yüzey ITO karşı elektrot karşı ve bir çözelti veya depolanması çözelti yüzeyinde bulunan yatay olarak bu tür içine daldırılır üzere dikey olarak yerleştirilir, böylece elektrotlar yerleştirin.
- Damıtılmış su içinde% 1 ve% 0.5 aljinat CaCO 3 (ağırlıkça) karıştırılarak ve daha sonra çözelti otoklavda bir aljinat biriktirme çözeltisi hazırlayın. Sürekli kullanımda olmadığı zaman çözüm karıştırılması tavsiye edilir.
- Birikimi çözüm inmeye her iki elektrot. Kullanılan alginat fluoresan flüoresan için izin vermek için, hem Cheng ve ark. 14 başına, Flüorosferlerini (Invitrogen) ile etiketlenmiş edilebilirOrtaya çıkan filmin ce görüntüleme.
- 2 dakika boyunca sabit bir akım yoğunluğu (3 A / m 2) uygulanır; gerilimi 2-3 aralığında kayacak V.
- Elektrot çıkarın ve olmayan yatırılan çözüm kaldırın. Yavaşça gereksiz aljinat kaldırmak için NaCl (0.145 M) ile filmi durulayın.
- Jeli güçlendirmek için CaCI2 (0.1 M) içerisinde filmin kısaca (~ 1 dk) inkübe. NaCl (0.145 M) ile durulanır ve CaCl2 (1 mM) ile desteklenmiş istenen bir çözelti içinde inkübe edilir.
- Bir floresan mikroskop (Şekil 1B) kullanarak görüntü.
2. Alginat iletişim kurmak Hücre Populasyonlarının Codeposition
- LB ortamında yetişen bir sinyal gönderici hücre kültürü (W3110 wt E. coli), ve sinyal alıcı hücre kültürü (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + PET-DsRed - kan r), LB ortamında yetişen + 50 mcg / mL kanamisin ve ampisilin her biri, bir gecede büyümüş olmalıdırnd 1 optik yoğunluğu ile büyüme (600 nm) için yeniden aşılandı. Kullanmadan önce LB ile 0.4-0.6 için alıcı hücre kültürü optik yoğunluğunu ayarlayın.
- Yarısı kadar bir yoğunluğa kadar seyreltilir hücreleri,% 1 aljinat,% 0.5 CaCO 3 arasında bir nihai konsantrasyona 1:1 oranında bir yerleştirme% 2 aljinat solüsyonu ve% 1 CaCO 3, ve her bir hücre kültürü ile karışım hazırlamak kültür yoğunluğu.
- Iyi bir polidimetilsiloksan (PDMS) (Sylgard talimatlarına göre hazırlanan ve istenilen büyüklükte kesilir) ve bir platin elektrot tarafından bulunan iki İTO elektrotlar desenli cam bir slayt kullanın. Prosedür 1 (aljinat elektrodepozisyon) de anlatıldığı gibi platin ile bir güç kaynağı için bir ITO elektrot bağlanır.
- Alıcısının hücre ihtiva eden bir çözelti içinde depolanması elektrotlar batırmak. 3 yüzey alanı boyutu tek elektrot ile tanımlanır A / m 2, bir yoğunlukta sabit bir akım besleme ayarlanır hangi deposition meydana gelecektir.
- Aljinat matris içinde hücrelerinin codeposition için izin vermek üzere 2 saat için mevcut geçerlidir.
- Basamak 1.5 'de tarif edildiği gibi filmin çalkalayın.
- Ikinci, bitişik, İTO elektrot için anodik bağlantı açın.
- Çökelme işlemi (Adımlar 2,4-2,7) tekrarlayın, ancak bu sefer gönderici hücreleri içeren çözüm tanıtılması.
- 37 'de bir gece codeposited hücreleri ve kalsiyum-aljinat içeren 2-elektrot çip ° C'de inkübe fosfat salin (PBS) ile% 10 LB ortamı ve 1 mM CaCI2 ile desteklenmiş tamponlu.
- Sonra bir floresan mikroskop (Şekil 2B) kullanan inkübasyon, görüntü.
3. Chitosan Elektrodepozisyon
- Timsah klipler aracılığıyla elektrotlar için güç kaynağı bağlayın. Bir altın kaplamalı silikon çip katot (elektrot çalışma) olarak hareket edecek ve bir platin folyo anot (karşı elektrot) olarak görev yapacak. Altın elektrot yüzeyine yerleştirin böylece thazından bir elektrot karşı koyar ve hem de bir solüsyon veya depolanması çözelti yüzeyinde bulunan yatay olarak bu tür içine daldırılır edilmesi ya da dikey olarak yerleştirilirler.
- Suya kitosan gevreği karıştırarak bir kitosan çözeltisi hazırlayın ve yavaş yavaş M HCl Meyer ve ark. 15 tarafından açıklanan işlemleri emin olarak, polisakkaritler (nihai pH 5.6) eritmek için 2 ekledi.
- Tamamen tevdi edilmesi için arzu edilen bölgeye daldırarak, kitosan, bir solüsyonu (% 0.8) içine elektrotlar yerleştirin. Kitosan kullanılan floresan 5 ile sokulabileceği - (ve-6)-carboxyrhodamine 6G süksinimidil ester (Invitrogen), Wu ve ark göre 8, floresan mikroskop ile görüntü elektrobirikimli film..
- 2 dakika boyunca sabit bir akım yoğunluğu (4 A / m 2) uygulayın. Voltaj 2-3 aralığında kaydırmaya V. depositio maruz çalışan elektrot arasında altın yüzey alanı bir fonksiyonu olarak akım yoğunluğu hesaplarn çözüm.
- Gereksiz kitosan kaldırmak için DI su ile elektrot durulayın. Çip su veya PBS (10 mM, pH 7,0) içinde depolanabilir.
- Bir floresan mikroskop (Şekil 3C) kullanarak görüntü.
4. Bir Fonksiyonlu Kitosan Film ile Elektrokimyasal İletimi
- 4 bir akım yoğunluğu Prosedür 3 (kitosan elektrodepozisyon) 'e göre bir model verilmiş elektrot üzerine A / m 2 azından bir çözelti (% 1 kitosan, 680 U / mL Gox, pH 5,6) ile Codeposit kitosan ve glukoz oksidaz (Gox). Gox içinde sıkışıp kalan bir kitosan filmi oluşturulur.
- Çalışan elektrot, karşı elektrot ve Ag / Şekil 4A'da anlatıldığı gibi AgCİ referans elektrotu gibi bir platin tel gibi bir üç-elektrot sistemine muamele elektrot takın.
- NaCl (0,1 M) ihtiva eden bir fosfat tampon solüsyonu (0.1 M, pH 7.0) içine batırmak elektrotlar.
- Elektrokimyasal kitosan için protein konjugekronoamperometri 10 ile 60'lar için sabit voltaj (0.9 V) uygulayarak filmi.
- Fosfat tamponu içinde çip (0.1 M, pH 7.0) yerleştirilir ve tepkimeye girmemiş NaCl ve konjuge olmayan Gox kaldırmak için bir orbital karıştırma cihazı üzerinde, 10 dakika boyunca yıkanır.
- 5 mM glukoz çözeltisi içine batırmak adım 4.2 ve tarif edildiği gibi üç elektrot sistemi için yeniden takın. Voltametri kullanarak, 0,7 olumlu yönde potansiyel süpürüp V. süpürme görülen oksitlenme miktarı (Şekil 4B) için bir karşılaştırma olarak hiçbir glukoz oksidaz içeren bir denetim film kullanın.
- Glikoz çözeltisi ile elektrot kaldırmak ve fosfat tamponu (0.1 M, pH 7.0) ile daha sonra durulama fosfat tampon 8 mL (0.1 M, pH 7.0) ihtiva eden bir 10 mL behere elektrotlar yerleştirin. Önyargı 0.6 V Gox-fonksiyonlandırılmış çip çalışan elektrot (Şekil 4C) olarak hizmet vermektedir.
- (Her tablet ile glikoz konsantrasyonu artırır tampon glikozun alikotları ekle4 mM).
- Gox-fonksiyonlandırılmış kitosan film için kararlı durum akım ve glukoz konsantrasyonu arasında standart bir eğri oluşturur.
5.. Enzimatik Meclisi Kullanımı Protein fonksiyonlandırmalar
- Bir PDMS de içinde bulunan bitişik bir altın ve İTO elektrot ile desenli cam bir slayt kullanın. Daha önce gösterildiği gibi kitosan electrodeposit bir katodik potansiyeli olan Bias altın elektrot. Pipet ile daha sonra DI su ve PBS kısaca filmi durulayın.
- Floresan "AI-2 Sentaz" 16 (a DyLight etiketleme kiti kullanılarak) PBS ile + 100 U / mL tirosinaz mavi etiketli 3 uM'lik bir solüsyonu eklenir.
- Oda sıcaklığında 1 saat inkübe, sonra PBS ile filmin durulanır.
- Alıcı hücreler (gibi adımlar 2.1-2.2 hazırlanan) içeren bir aljinat birikimi çözüm codeposit için İTO elektrot bir anodik potansiyel uygulayın. Prosedür 2 2.3-2.6 (aljinat hücre popülasyonlarının Codeposition) adımları izleyin.
- Üretmek içiniletilen sinyali (AI-2) enzimatik olarak, durulamadan sonra filmlerin% 10 LB ortamı ve 1 mM CaCI2 ile desteklenmiş PBS ile 500 uM S-adenozil homosistein (kan) içindeki bir çözeltisine, ekleyin. Çözeltinin buharlaştırılması önlemek ve 37, bir gece boyunca inkübe için elektrotlar kapsamaktadır ° C. Bu bir kırmızı floresan proteini (DsRed) oluşturarak bir alıcı hücre yanıtı için izin verecektir.
- Komşu elektrotlar codeposited alıcı hücreler (Şekil 5B) tarafından ifade edilen AI-2 Sentaz ve kırmızı floresan mavi floresan yakalamak için filtreler ayarlayarak floresan mikroskobu ile görüntülenebilir olabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Uygulanan elektrik sinyalleri bir elektrot yüzeyi ve bu uyaranların gibi elektrot yüzeyinde bir hidrojel film olarak yatırmak aljinat ve kitosan gibi polisakkaritlerin kendinden montaj tetikleyebilir yakın lokalize mikroçevrelerde (örneğin, alanlar ve degradeler) oluşturabilirsiniz. Çünkü tOnun sol-jel geçiş elektrot yüzeyinde, ortaya çıkan filmin elektrot desen (Şekil 1B, 3C) eşleşen geometrisi ile, electroaddressed için oluşur. Böyle aljinat ve kitosan gibi Biyouyumlu filmleri biyolojik bileşenleri ile fonksiyonelleştirilmiş edilebilir yüzeyler sağlar. Aljinat kullanarak, benzersiz hücre popülasyonlarının ayrı adreslerde codeposited edilmiştir. Kendi electroaddressment kanıtı gönderici ve alıcı hücre popülasyonu arasındaki etkileşimi üzerine gözlenmektedir. Gönderenden gelen hücre ve molekül Otoendüktörün-2 (AI-2) yayılır DsRed kırmızı floresan proteini (Şekil 2A) ifade sonuçlanan alıcı hücreler tarafından alınır. Şekil 2B, kırmızı floresans sadece alıcıları ele alınmaktadır elektrot gözlenmektedir.
Kitosan mevcut amin gruplarının elektrodepozisyon gibi fonksiyonlandırmalar için uygun bir yüzey için gerekli olan pH yanıt sağlamamıştır. Bizelektrokimyasal kitosan filmlerin elektrobirikimli için biyoalgı enzim glukoz oksidaz (Gox) conjugating bu eşsiz özellikleri kullanılmıştır. Bu enzim sonra sonra elektrokimyasal bir çıkış akımı üretmek için okside olabilen hidrojen peroksit üreten bir enzimatik reaksiyon (Şekil 4A) aracılığıyla glukoz tayini için yeteneği sağlar. Gox herhangi Gox ihtiva edenler filmler karşıt olarak glukoz varlığında güçlü bir anodik sinyal üretmek elektrokimyasal olarak konjuge olmuştur filmler içinde olduğunu gösterir, bu sayede, bir kimyasal sinyali elektriksel. Şekil 4B için transdük edilebilir. Bu sonuçlar Gox bir tevdi kitosan film üzerine monte edilebilir ve katalitik aktivite sürdürecek göstermektedir. Bundan başka, Şekil 4C artan glukoz konsantrasyonu karşılık olarak üretilen anodik akımı içinde bir adım artış gösterir. Şekil 4C de mevcut standart eğri adım artışlar yakın doğrusal Haldun'un ilerledi gösterirglikoz miktarına bağlıdır hion eklendi. Bu sonuçlar, aynı zamanda enzim kitosan filmin üzerine konjugasyon glukoz konsantrasyonu artan duyarlılığı muhafaza olduğunu göstermektedir. Bu, daha önce Meyer ve çalışmalarında bu sistem için karakterize edildiği gibi tespit alt limit burada çalışılmamıştır. ark.
Ayrıca, bir enzimatik olarak kontrollü bir şekilde kitosan için özel bir penta-tirozin etiketi içerir için tasarlanmış, ilgilenilen bir enzim kovalent immobilizasyon, göstermiştir. Spesifik olarak, bu işlem enzim tirosinaz aracılık etmektedir. Şekil 5A yılında şeması (üst), bir enzim tarafından görüldüğü gibi, AI-2 Sentaz bir penta-tirozin etiketi içerir. Tirozinaz sonra kovalent kitosan Kullanıcı aminler bağlamak O-kinonlar için artıkları 'fenol grupları oksitleyici, tirozin etiketi üzerinde hareket eder. Tirozinaz meclis tarafından AI-2 Sentaz ile kitosan filmi fonksiyonlandırmalar kanıtı Şekil 5B görülmektedir (Şekil 5A (alt)). Alıcısının hücre kırmızı flöresanlı (Şekil 5B) tekrar birinden diğerine AI-2 difüzyon nedeniyle adresler arasındaki etkileşimi gösterir, ve daha da enzimleri kitosan kez kovalent bağlanmış etkinliğini korudukları immobilize olduğunu gösterir.
1. Aljinatta elektrodepozisyon Şekil. Aljinat elektrodepozisyon (A) mekanizması: bir elektrot anodically yanlı gibi, su elektroliz lokalize bir düşük pH getirici, yüzeyi meydana gelir. Kalsiyum karbonat partikülleri fazlası ile reaksiyonaproton, kalsiyum katyonları salgılatıcı partiküller olarak çözülür. Aljinat polimer zincirleri varlığında, iyonları elektrod bir çapraz bağlı hidrojel oluşturan, bir "eggbox" ağ şelatlanmış olur. Elektrot artar mesafe olarak, aljinat, kalsiyum iyonlarının indirgenmiş varlığı nedeniyle çözelti içinde kalmasını daha büyük bir eğilim sahiptir. (B) bir L-şekilli desenli ITO elektrot electrodeposit aljinat için kullanıldı. A PDMS de yeşil bir floresan-etiketli aljinat (% 1) ve CaCO 3 (% 0.5) çökelme solüsyonu içeren elektrot ile tespit edildi. 2 dakika süreyle electrodepositing sonra. 3A / m 2 akım yoğunluğunda, electroaddressed aljinat hidrojel floresan mikroskop ile görüntülendi.
Şekil 2. Hücre popülasyonlarının Codeposition. İki E. arasındaki (A) 'Şema gösteren bir etkileşim coli: Bir toplumun Otoendüktörün-2 üreten (AI-2), Bir sinyalleşme molekülü, ve "AI-2 gönderenden." Olarak adlandırılmaktadır Diğer nüfus olarak adlandırılan "AI-2 alıcı," AI-2 bir muhabir; gönderenden gelen difüzyon ile AI-2 aldıktan sonra, o kırmızı floresan proteini DsRed ifade eder. (B) AI-2 gönderenin nüfusa sahip elektrot çifti Kırmızı floresan görüntü sol elektrot üzerinde aljinat ile codeposited ve AI-2 alıcı nüfus sağ elektrot üzerinde aljinat ile codeposited. Büyütülmüş görünüm yalnızca AI-2 alıcıları DsRed ifadesi gösteriyor.
Şekil 3. Kitosan elektrodepozisyon. (A) Şema kitosan, pH değerine bağımlı elektrodepozisyon gösteren. Bir cathodically önyargılı elektrot su elektroliz bu bölgede chitosanın sol-jel geçiş uyarır yerelleştirilmiş bir yüksek pH (mikrograflarında katot yakınında pH indikatörü boya yerelleştirilmiş bir renk değişimi ile gösterilir) neden olur. (B) aminler kitosana sunmak i vermekt pH duyarlı özellikleri. 6.3 (chitosanın pKa) pH Üstü aminler onun protonlanmış çözünebilir formdaki onun çözünmeyen jel formunda bir geçişi kolaylaştırmak, deprotonated edilir. (C) desenli bir altın elektrot electrodeposit kitosan için kullanıldı. Güç kaynağına cathodically bağlı elektrot, yeşil bir kitosan (% 0.8) birikimi çözüm floresan etiketli batırılır edildi. 2 dakika süreyle electrodepositing sonra. 4 A / m 2 akım yoğunluğunda, electroaddressed kitosan filmi floresan mikroskop ile görüntülendi.
Bir fonksiyonlandırılmış kitosan film ile Şekil 4. Elektrokimyasal iletimi. (A) şematik bir üç elektrotlu sistem set-up gösteren. Fonksiyonlandırılmış kitosan filmin çalışan elektrot, referans elektrotu olarak elektrot ve Ag / AgCI gibi bir platin tel olarak hizmet eder. Th ile glikoz gelirlerinin Elektrokimyasal iletimiüretilen hidrojen peroksit çalışma elektrotta okside ve tespit edilebilir olduğu gösterilmiştir e enzimatik ve elektrokimyasal reaksiyon. (B) elektrokimyasal olarak konjuge glukoz oksidaz (Gox) ihtiva eden bir film ile kitosan elektrotta Siklik voltammagram (KV), 5 mM glikoz çözeltisi içinde anodik kuvvetli bir sinyal gösterir. Hiçbir Gox içeren bir film, bir kontrol olarak görev yaptı ve aynı çözüm hiçbir sinyal görünür. (C) anodik akım ve glukoz konsantrasyonu arasında standart eğri yakın bir doğrusal ilişki (Her tablet 4 mM glukoz konsantrasyonu artmış ve ayrıca kademeli bir şekilde ilave grafikte geçerli genliği artış) görüntüler.
Şekil 5. Enzimatik derleme kullanarak Protein fonksiyonlandırmalar. Tirozin etiketli gösteren (A, üst) Programı "AI-2 Sentaz" kovalent tirozinaz meclisi tarafından bir kitosan film mecburiyetinden. Tirozin kalıntıları oksit halinetirosinaz eylemiyle O-kinonlar için ized ve kovalent bir bağ oluşturan, kitosan film üzerine amin grubu ile reaksiyona girebilir. (A, alt) AI-2 Sentaz substrat (SAK) AI-2 üretir; alıcı hücreler DsRed floresan ifade tarafından oluşturulan AI-2 rapor. (B) altın bir kitosan filmi gösteren Floresans görüntüler, mavi etiketli AI-2 Sentaz ile fonksiyonelleştirilmiş. Adjacently, AI-2 alıcı hücreleri İTO üzerinde aljinat ile codeposited edilir. İyi ve inkübasyon için enzimatik substrat ilave edildikten sonra, AI-2 alıcısı hücreleri DsRed ifade eder.
Discussion
Bizim usul biyopolimer filmlerin elektrodepozisyon ve işlevsel, biofabrication biz vadeli bir süreç göstermektedir. Hücreleri ve biyomoleküllerle fonksiyonlandırmalar sayesinde birbirimize ve onlar üzerine monte edilen elektrot adresi ile etkileşim yeteneğine biyolojik yüzeyler oluşturur. İlk adım, elektrodepozisyon, bir elektrik sinyaline yanıt olarak, çalışmalarımızda biyopolimerler, aljinat ve kitosan tetikleyen kendinden montaj yoluyla gerçekleşir. Gibi bir pH gradienti filmin boyutları ve özellikleri 6,17 ek denetim sağlayan, akım yoğunluğu ve birikimi zaman kontrol edilebildiği oluşturulur önceki belirtti. Bu akım yoğunluğu ve biriktirme zaman kombinasyonlar çeşitli Tablo 1 'de gösterilen elektrotlar için kullanılabileceğini bulmuşlardır. Diğer elektrotların kullanımının uygun olmasına rağmen, prosedüre ayarlamalar gerekli olacaktır. Film formasyonu, diğer teknikler electrodeposi işlemi ile karşılaştırıldığındaTION, basit, hızlı ve reagentless olduğunu. Pahalı ekipman ve zahmetli hazırlıkları geniş bir repertuar gerek yoktur. Önemlisi, süreç küçük deneysel sapmalar dayanabilir ve bir sorun çıkması durumunda kolayca üzerinden başlatılabilir.
Chitosan birincil aminler içeriği yüksek bir tarafından kendisine takdim önemli fonksiyonel özellikleri nedeniyle yüksek katodik pH gradienti yanıt yeteneğine sahiptir. Yüksek pH (~ 6.3 onun pKa daha büyük) At aminler deprotonated ve kitosan film oluşumu için izin çözünmez hale gelir. Çökelme takiben, filmlerin elektrot bağlı kalacaktır. Bununla birlikte, eğer istenirse yeteneği bunların tabakalara ayırmak için vardır. Filmler çözeltinin pH pKa altına düşer sürece, stabil olacaktır. Asidik çözümler aminler protonate ve 18 eriyene kadar sonraki elektrostatik itmelerini jel şişer. Yani, montaj / demontaj işlemi talep ve allo üzerinde geri dönüşümlü olanyatırılan film ve elektrotların yeniden çıkarılması için ws. Elverişli, sol-jel geçişi gerçekleştikten pH aralığı en biyolojik bileşenlerin rahat hareket ettiği o yakındır. Bu montaj sırasında 6 işlevselliği tutma işlemi idealdir.
Aljinat film formasyonu su elektroliz anodik gibi kalsiyum karbonat 7 varlığı ile kolaylaştırılmaktadır. Anotta lokalize düşük pH serbest kalsiyum katyonları yol açan kalsiyum karbonat çözünür. Bu iyonlar elektrot yüzeyinde bir çapraz ağ oluşturarak, aljinat ile şelatlı edilir. Aljinat filmler yatan elektrotların yeniden kullanım için izin filmler çözünmesi için kullanılabilir örneğin sitrat ya da diğer EDTA şelatlama bileşikler, kalsiyum iyonları için rekabet özellikle ters vardır. Kalsiyum iyonları kolayca s, çünkü böylece, aljinat filmler fizyolojik koşullar maruz kaldığında nispeten kırılgandıryapısının zayıflaması ve film delaminasyon veya redissolution teşvik, jel matriksten cavenged. Bu sınırlamayı aşmak için, jel güçlendirmek için 1 M CaCl2 film için bir kuluçka adım dahil ettik. Buna ek olarak, filmin inkübasyon çözeltisi (hücre ortam, vs) 500 uM-3 mM bir konsantrasyonda CaCI2 ile takviye edilmesini önermektedir.
Ikinci temel prosedür ilgili biyolojik bileşenleri ile birlikte tevdi filmin fonksiyonlandırmalar olup. Bu iki yolla, ilk olarak elektrokimyasal konjugasyonu, istisnai mekansal kontrolü 10 ile proteinleri ani, reagentless montajı için izin veren bir stratejide elde edilebilir. Bununla birlikte, bu şekilde fonksiyonlandırmalar Cl difüzyon ile sınırlıdır - elektroduna filmi ile iyonları gibi HOCl difüzyonu, çözelti geri üretilen reaktif ara madde, çıkış. Geçirmek için elektrokimyasal aktif molekülün yeteneğifilmi ile kolay-okunur elektrik sinyalleri 15 içine kimyasal ve biyolojik sinyal transdüksiyonu için olanak sağlar. Biz kovalent AI-2 Sentaz takarak gösterdi, kitosan enzim fonksiyonlandırmalar için ikinci bir strateji olarak tirozinaz aracılı kaplin göstermiştir. Bir tirozin etiketi 9 içeren proteinler üzerinde discriminately davranan belirli bir reaktif, tirozinaz, bağımlı - Bu strateji fonksiyonlandırmalar proses kontrollü ve seçici olmasını sağlar.
Biz, bir çip üzerindeki doğal yollar çoğaltarak çoklu adres sistemlerin kullanışlılığı ve biyouyumluluk gösterir. Öncelikle farklı adreslerde iki tip hücre topluluğu (yani "gönderen" ve "alıcılar") düzenlenen ve onlar AI-2 sunmak ve bir floresan yanıtı oluşturmak için komşu elektrot arasında etkileşim olduğunu gösterdi. Bu kavram, aynı zamanda Cheng ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir. Bir mikroakışkan çip 14. Ayrıca etkileşimin taklit, fakat bunun yerine kullanılmıştırteslimat için AI-2 sentezlemek için bir enzim. Bu şekilde, sentetik bir hücre içi yol, AI-2 sentezi, biofabrication ile çoğaltılmış ve bu çözelti içinde olduğu gibi, çok fonksiyonlu edildi.
Her iki durumda da, birden çok adres montajı elektrodepozisyon sadece bir adrese amaçlanan olsa bile her yerleştirme çözeltisi, tüm elektrot dizisine getirilmesi için, çünkü adresler arasındaki spesifik olmayan bağlanma kaçınmak bir engel oluşturmaktadır. Yumuşak henüz ayrıntılı yıkama non-yanlı elektrotlardan artık çözelti çoğunluğu kaldırmak; mikroakışkan kanallarda akımının kullanılması daha fazla olmayan bir spesifisite en aza indirir. Özellikle kitosan ve aljinat adresleri bitişik biofabrication için, biz aljinat electrodepositing, biofunctionalization adımlarla bunu müteakip, ilk kitosan filmi yatırılması tavsiye ve bundan sonra. Biz bu nedenle burada yapılacak olmasına rağmen, biz bulduk eylemsiz proteinler (mil olarak sahip kitosan filmi engellemek, BSA, vb) önemli ölçüde kitosan en aminated yüzeyine istenmeyen moleküllerinin spesifik olmayan bağlanma azalır.
Bu hücreler ve biyomoleküllerin karmaşık bir düzenlemesi için "ozalitler" olarak, genellikle bioMEMS cihazlar bulunan desenli elektrotlar, kuran faydalı oldukları bulunmuştur. Ve kullanımlarını burada bahsedilen 19 bioMEMS cihazlarda kitosan iyi örnekler ötesine gidebilir elektrobirikimli. Böyle Mikrokanallarda ve düzlemsel olmayan yüzeyleri 20,15 on gibi - Kitosan çeşitli mikro geometri üzerine yatırılabilir. Film, aynı zamanda, diğer polimerler ve çeşitli proteinler, DNA, nanopartiküller, ve yeni özelliklerini 21,22,23 için redoks-aktif molekülleri ile değiştirilebilir. BioMEMS cihazlarda, kitosan filmlerin ilaç dağıtım, redoks ve küçük molekül algılama, biyokataliz ve hücre çalışmaları 20,23,24,25 süredir kullanılmaktadır. Benzer şekilde, aljinat, yaygın bir hücre-matriks tuzak olarak kullanılır ve geri dönüşlü akışkan saklama için keşfedilmiştirhücre popülasyonu ve film immunoanalysis 26,27,28. Doku mühendisliği uygulamaları için kompozit filmler gibi ortopedik implantlar 29 için hidroksiapatit gibi bileşenler ile birlikte, aljinat elektrodepozisyon kullanılarak imal edilmiştir.
Biofabrication bizim gösteriler, biz biyolojik bileşenleri arasında ve biyo-elektronik arabirim üzerinden etkileşimleri de eşit derecede uygulanabilir olduğunu göstermiştir; bu yonga üzerinde sinyal iletim gelişmiş performans için etkileşimleri tüm çeşitleri entegre umudu ulaşmak içine getiriyor. Buna göre, biofabrication azaltılması gibi "asgari özelliği boyutları" ile cihazların imalat kolaylaştırabilir doğrudan bir sıklıkta tüketici elektroniği motive mikroimalat hızlı gelişmeler, to-izleyin. Yani, gelecek nesil cihazlar aslında daha küçük boy SCA de doğanın mükemmel montaj ve tanıma yetenekleri sunmak labil biyolojik bileşenleri içerebilirinsan yapımı sistemlerden daha les. Biz analitik cihazlar, çevre sensörleri, ve hatta biyo-implant yakın vadeli uygulamaları öngörülüyor.
Disclosures
Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Amerika Birleşik Devletleri Savunma Tehdit Azaltma Dairesi tarafından desteklenmektedir.
Acknowledgments
Biz temel araştırma kısmi destek için bu yazının destek ve ONR, DTRA ve NSF DTRA fon kabul ederler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
