Summary
Questo articolo descrive un approccio biofabrication: deposizione di stimoli-responsive polisaccaridi in presenza di elettrodi polarizzati per creare film biocompatibili che possono essere funzionalizzati con cellule o proteine. Abbiamo dimostrare un banco strategia per la generazione dei film, nonché il loro uso base per creare superfici interattive biofunctionalized per lab-on-a-chip.
Abstract
I progressi nella promessa della tecnologia lab-on-a-chip di rivoluzionare sia la ricerca e la medicina attraverso la riduzione dei costi, una migliore sensibilità, portabilità e una maggiore produttività. L'incorporazione di componenti biologiche biologici su sistemi microelettromeccanici (BioMEMS) ha mostrato un grande potenziale per il raggiungimento di questi obiettivi. Microfabbricati chip elettronici consentono micrometro scala caratteristiche nonché un collegamento elettrico per il rilevamento ed attuazione. Funzionali componenti biologiche dare al sistema la capacità di rilevamento specifico di analiti, le funzioni enzimatiche e di cellule intere capacità. Processi di microfabbricazione standard e tecniche di bio-analitici sono stati utilizzati con successo da decenni nel settore delle industrie informatiche e biologiche, rispettivamente. La loro combinazione e l'interfacciamento in un lab-on-a-chip ambiente, tuttavia, produce nuove sfide. Vi è una richiesta per le tecniche che possono creare un'interfaccia tra l'elettrodo e compon biologicaent che è mite ed è facile da produrre e modello.
Biofabrication, qui descritto, è un approccio di questo tipo che ha mostrato una grande promessa per il suo facile da montare incorporazione dei componenti biologici con versatilità nelle on-chip le funzioni che vengono attivate. Biofabrication utilizza materiali biologici e meccanismi biologici (self-assembly, assemblaggio enzimatica) per la bottom-up assembly gerarchico. Mentre i nostri laboratori hanno dimostrato questi concetti in molti formati 1,2,3, qui dimostriamo il processo di assemblaggio sulla base di elettrodeposizione seguita da più applicazioni di segnale a base di interazioni. Il processo di assemblaggio consiste l'elettrodeposizione di biocompatibili stimoli-responsive pellicole polimeriche sugli elettrodi e la loro successiva funzionalizzazione con componenti biologiche quali DNA, enzimi, o cellule vive 4,5. Elettrodeposizione sfrutta il gradiente di pH creato sulla superficie di un elettrodo polarizzato dalla elettrolisidi acqua 6,7,. Chitosano e alginato sono stimoli-sensibili polimeri biologici che possono essere attivati per auto-assemblano in film di idrogel in risposta a segnali elettrici imposti 8. Lo spessore di questi idrogel è determinata dalla misura in cui il gradiente di pH si estende dall'elettrodo. Questo può essere modificato utilizzando diverse densità di corrente e tempi di deposizione 6,7. Questo protocollo descrive come film chitosano vengono depositati e funzionalizzati con covalentemente collegando componenti biologici ai gruppi amminici primari abbondanti presenti sulla pellicola sia attraverso metodi enzimatici o elettrochimico 9,10. Film di alginato e loro intrappolamento di cellule vive anche essere affrontato 11. Infine, l'utilità di biofabrication è dimostrato attraverso esempi di segnale a base di interazione, tra chimico-a-elettrico, cellula-cellula, e anche enzima-cellula trasmissione del segnale.
Sia l'elettrodeposizionee funzionalizzazione può essere eseguita in condizioni fisiologiche quasi senza la necessità di reagenti e quindi risparmiare labili componenti biologici da condizioni dure. Inoltre, sia chitosano e alginato sono da tempo utilizzati per scopi biologicamente rilevanti 12,13. Complessivamente, biofabrication, una tecnica rapida che possono essere semplicemente eseguita su un banco, può essere utilizzato per la creazione di modelli in scala micron di componenti funzionali biologici su elettrodi e può essere utilizzato per una varietà di lab-on-a-chip.
Protocol
1. Alginato elettrodeposizione
- Collegare un alimentatore agli elettrodi abitudine fabbricata tramite patch cord con morsetti a coccodrillo. Un ossido di indio e stagno (ITO), di cui vetrino fungerà da anodo (elettrodo di lavoro) e foglio di platino fungerà da catodo (contro-elettrodo). Posizionare gli elettrodi in modo che la superficie ITO da funzionalizzare oppone il controelettrodo ed è posizionato verticalmente per essere immerso in una soluzione o orizzontalmente in modo tale che la soluzione è contenuta deposizione sulla superficie.
- Preparare una soluzione di alginato di deposizione mescolando 1% e 0,5% alginato CaCO 3 (in peso) in acqua distillata e poi la soluzione in autoclave. Si raccomanda di agitare continuamente la soluzione quando non in uso.
- Immergere entrambi gli elettrodi nella soluzione di deposizione. L'alginato usato può essere marcato in modo fluorescente con fluorosfere (Invitrogen), come da Cheng et al. 14, per consentire FLUORESCENTEce l'imaging del film risultante.
- Applicare una densità di corrente costante (3 A / m 2) per 2 minuti; tensione sposterà nell'intervallo di 2-3 V.
- Scollegare l'elettrodo e rimuovere la soluzione non depositato. Lavare delicatamente il film con NaCl (0,145 M) per rimuovere alginato superfluo.
- Incubare brevemente il film (~ 1 min) in CaCl 2 (0,1 M) per rafforzare il gel. Risciacquare con NaCl (0,145 M) e incubare in una soluzione desiderata supplementato con CaCl 2 (1 mM).
- Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza (figura 1B).
2. Codeposition di popolazioni di cellule comunicanti in alginato
- Un segnale-mittente coltura cellulare (W3110 peso di E. coli), cresciute in un mezzo LB, e un segnale-ricevitore coltura cellulare (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + pET-DsRed - kan r), cresciute in un mezzo LB + 50 pg / ml ciascuno di kanamicina e ampicillina, devono essere cresciuto uno nottend re-inoculato per la crescita ad una densità ottica (a 600 nm) di 1. Regolare la densità ottica della coltura cellulare ricevitore a 0,4-0,6 con LB prima dell'uso.
- Preparare una soluzione di deposizione del 2% e 1% alginato CaCO 3, e mescolate con ogni coltura cellulare in un rapporto 1:1 a una concentrazione finale di 1% alginato, 0,5% CaCO 3, con le cellule diluite ad una densità di circa la metà la coltura densità.
- Utilizzare un vetrino modellato con due elettrodi di ITO contenuti in un polidimetilsilossano (PDMS) e (preparata secondo le istruzioni Sylgard e tagliato a misura desiderata) e un contro elettrodo di platino. Collegare un elettrodo di ITO ad un alimentatore con il platino come descritto nella Procedura 1 (elettrodeposizione alginato).
- Immergere gli elettrodi in una soluzione contenente le cellule deposizione ricevitore. Impostare l'alimentazione di una corrente costante ad una densità di 3 A / m 2, dove è definita la dimensione di superficie dal singolo elettrodo sulla quale deposition si verificherà.
- Applicare la corrente per 2 minuti per consentire codeposition delle celle della matrice di alginato.
- Risciacquare il film come descritto nella Fase 1,5.
- Passare il collegamento anodico al secondo, adiacente, elettrodo ITO.
- Ripetere la procedura di deposizione (Fasi 2,4 - 2,7), ma questa volta introduce la soluzione contenente le cellule mittente.
- Incubare la 2-elettrodo chip contenente cellule codeposited e calcio-alginato notte a 37 ° C in salina tamponata con fosfato (PBS) supplementato con mezzi LB 10% e 1 mM CaCl 2.
- Dopo incubazione, l'immagine usando un microscopio a fluorescenza (Figura 2B).
3. Chitosano elettrodeposizione
- Collegare l'alimentatore agli elettrodi attraverso coccodrilli. Un chip di silicio rivestito in oro fungerà da catodo (elettrodo di lavoro) e un foglio di platino fungerà da anodo (contro-elettrodo). Posizionare superficie dell'elettrodo d'oro in modo tha si oppone il controelettrodo ed entrambi sono posizionati verticalmente per essere immerso in una soluzione o orizzontalmente in modo tale che la soluzione è contenuta deposizione sulla superficie.
- Preparare una soluzione di chitosano mescolando fiocchi chitosano in acqua e aggiungendo lentamente 2 M HCl per sciogliere i polisaccaridi (finale pH 5.6), avendo cura di seguire la procedura descritta da Meyer et al. 15.
- Posizionare gli elettrodi in una soluzione di chitosano (0,8%), sommergendo completamente la zona desiderata per la deposizione. Il chitosano usato può essere marcato in modo fluorescente con 5 - (e-6)-carboxyrhodamine 6G succinimmidil estere (Invitrogen), come da Wu et al 8, il film di immagine elettrodepositata mediante microscopia a fluorescenza..
- Applicare una densità di corrente costante (4 A / m 2) per 2 minuti. Tensione sposterà nell'intervallo di 2-3 V. Calcolare la densità di corrente in funzione della superficie d'oro dell'elettrodo di lavoro esposto al Deposition soluzione.
- Risciacquare l'elettrodo con acqua deionizzata per rimuovere superfluo chitosano. Il chip può essere conservato in acqua o PBS (10 mM, pH 7,0).
- Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza (Figura 3C).
4. Trasduzione elettrochimica con un film funzionalizzato Chitosan
- Codeposit chitosano e glucosio ossidasi (GOX) da una soluzione (1% di chitosano, 680 U / mL GOX, pH 5,6) ad una densità di corrente di 4 A / m 2 su un elettrodo modellato secondo la procedura 3 (elettrodeposizione Chitosan). Un film chitosano intrappolata in GOX verrà generato.
- Attaccare l'elettrodo trattati per un sistema a tre elettrodi come elettrodo di lavoro, un filo di platino come contro-elettrodo e Ag / AgCl come elettrodo di riferimento, come descritto in Figura 4A.
- Immergere gli elettrodi in una soluzione tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenente NaCl (0,1 M).
- Elettrochimicamente la proteina coniugato al chitosanopellicola applicando una tensione costante (0,9 V) per 60 s utilizzando chronoamperometry 10.
- Posizionare il chip in tampone fosfato (0,1 M, pH 7.0) e lavare per 10 minuti su un agitatore orbitale per rimuovere qualsiasi GOX NaCl non ha reagito e non coniugata.
- Ricollegare il sistema a tre elettrodi come descritto al punto 4.2 e immerso in una soluzione di glucosio al 5 mM. Utilizzando voltammetria ciclica, spazzare il potenziale in una direzione positiva a 0,7 V. utilizzare un film di controllo non contenente glucosio ossidasi come confronto per la quantità di ossidazione visto nella scansione (Figura 4B).
- Rimuovere gli elettrodi dalla soluzione di glucosio e lavare con tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) quindi posizionare gli elettrodi in un becher da 10 mL contenente 8 ml di tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0). Bias il GOX-funzionalizzato chip a 0,6 V per servire come elettrodo di lavoro (Figura 4C).
- Aggiungere aliquote di glucosio nel buffer (ciascuna aliquota aumenta la concentrazione di glucosio da parte4 mM).
- Generare una curva standard tra l'attuale stato stazionario e la concentrazione di glucosio per il GOX pellicola chitosano funzionalizzato.
5. Protein Funzionalizzazione Utilizzo Assemblea enzimatico
- Utilizzare un vetrino modellato con un elettrodo d'oro adiacente e ITO contenuta in un pozzo PDMS. Bias l'elettrodo d'oro con un potenziale catodico per electrodeposit chitosano come illustrato in precedenza. Sciacquare pellicola brevemente in acqua deionizzata e poi PBS con pipetta.
- Aggiungere una soluzione di 3 pM fluorescente blu "AI-2 Synthase" 16 (usando un kit DyLight etichettatura) + 100 U / mL tirosinasi in PBS.
- Incubare per 1 ora a temperatura ambiente, quindi risciacquare il film con PBS.
- Applicare un potenziale anodico per l'elettrodo di ITO codeposit una soluzione di deposizione di alginato contenente cellule ricevitore (come preparati nei passaggi 2.1-2.2). Seguire i passaggi della procedura 2,3-2,6 2 (Codeposition di popolazioni di cellule in alginato).
- Per generareil segnale trasmesso (AI-2) enzimaticamente, dopo il risciacquo dei film aggiungere una soluzione di 500 pM S-adenosil omocisteina (SAH) in PBS, LB supplementato con mezzi 10% e 1 mM CaCl 2. Coprire gli elettrodi per evitare l'evaporazione della soluzione ed incubare durante la notte a 37 ° C. Ciò consentirà una risposta cellulare ricevitore generando una proteina fluorescente rossa (DsRed).
- Elettrodi adiacenti possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza regolando i filtri per catturare la fluorescenza blu del AI-2 Synthase e fluorescenza rossa espressa dalle cellule codeposited ricevitore (Figura 5B).
6. Risultati rappresentativi
Imposti segnali elettrici possono creare microambienti localizzate (ad esempio, campi e gradienti) vicino a una superficie dell'elettrodo e tali stimoli possono innescare l'auto-assemblaggio di polisaccaridi come alginato e chitosano per depositare una pellicola idrogel sulla superficie dell'elettrodo. Dato che tla transizione sol-gel si verifica sulla superficie dell'elettrodo, la pellicola risultante è electroaddressed, con la sua geometria corrispondente al modello di elettrodo (figure 1B, 3C). Film biocompatibile come alginato e chitosano fornire superfici che possono essere funzionalizzati con componenti biologici. Utilizzando alginato, le popolazioni di cellule uniche sono state codeposited a separare gli indirizzi. Prove di loro electroaddressment è osservato dopo interazione tra il mittente e il ricevitore popolazione di cellule. La molecola autoinducer-2 (AI-2) diffonde dalle cellule del mittente e viene assorbito dalle cellule del ricevitore, con conseguente espressione della proteina fluorescente rossa DsRed (Figura 2A). In Figura 2B, fluorescenza rossa è stata osservata solo in corrispondenza dell'elettrodo sono indirizzate ricevitori.
I gruppi amminici presenti sul chitosano fornendo la capacità di risposta pH richiesto per elettrodeposizione così come una superficie adatta per la funzionalizzazione. Noiutilizzato queste caratteristiche uniche dal elettrochimicamente coniugando la biosensori enzima glucosio ossidasi (GOX) per elettrodepositata chitosano film. Questo enzima fornisce quindi la possibilità per il rilevamento di glucosio mediante una reazione enzimatica (Figura 4A) producendo perossido di idrogeno che può quindi essere ossidato elettrochimicamente per produrre una corrente di uscita. In questo modo, un segnale chimico può essere trasdotta in Figura elettrica. 4B mostra che i film in cui GOX è elettrochimicamente coniugato produrre un segnale forte anodico in presenza di glucosio rispetto a quelle pellicole non contenenti GOX. Questi risultati indicano GOX può essere montato su una pellicola depositata chitosano e mantiene l'attività catalitica. Inoltre, la figura 4C mostra un passo-aumento di corrente anodica prodotta in risposta a concentrazioni crescenti di glucosio. La curva standard presenti anche nella figura 4C mostra che il passo di aumenti proceduto in una fas quasi linearehion dipende dalla quantità di glucosio aggiunto. Questi risultati mostrano che l'enzima conserva anche la sua sensibilità alle concentrazioni crescenti di glucosio sulla coniugazione al film chitosano. Il limite inferiore di rilevamento non è stato studiato qui come è stato precedentemente caratterizzati per questo sistema nel lavoro di Meyer et. al.
Abbiamo anche dimostrato l'immobilizzazione covalente di un enzima di interesse, progettato per contenere un costume penta-tirosina tag, di chitosano enzimaticamente in un modo controllato. In particolare, questo processo è mediato da tirosinasi. Come si vede dallo schema in figura 5A (superiore), un enzima, AI-2 Synthase include un penta-tirosina tag. Tirosinasi agisce sul tag tirosina, ossidando i gruppi fenolici dei residui »di O-chinoni, che poi si legano in modo covalente alle ammine del chitosano. Prove di funzionalizzazione del film chitosano con l'AI-2 Synthase dalla tirosinasi gruppo si osserva nella figura 5B (figura 5A (inferiore)). Fluorescenza rossa delle cellule ricevitore (Figura 5B) dimostra nuovamente l'interazione tra gli indirizzi a causa della diffusione di AI-2 da uno all'altro, e indica inoltre che gli enzimi immobilizzati per mantenere chitosano attività una volta legata in modo covalente.
Figura 1. Elettrodeposizione alginato. (A) Meccanismo di elettrodeposizione alginato: Come un elettrodo è anodicamente polarizzato, l'elettrolisi dell'acqua avviene alla sua superficie, generando un pH basso localizzato. Particelle di carbonato di calcio reagisce con l'avanzodi protoni, rilasciando cationi di calcio come particelle sciogliere. In presenza di catene polimeriche alginato, gli ioni diventano chelati in una rete "Eggbox", formando un idrogel reticolato all'elettrodo. Poiché la distanza aumenta elettrodi, alginato ha una maggiore tendenza a rimanere in soluzione a causa della ridotta presenza di ioni calcio. (B) Una forma di L modellato elettrodo ITO è stata utilizzata per alginato electrodeposit. Un PDMS pozzo è stato fissato l'elettrodo per contenere un alginato verde fluorescente-marcato (1%) e CaCO 3 (0,5%) soluzione di deposizione. Dopo elettrodeposizione per 2 min. ad una densità di corrente di 3A / m 2, l'idrogel è stato ripreso electroaddressed alginato mediante microscopia a fluorescenza.
Figura 2. Codeposition di popolazioni cellulari. (A) schema che mostra l'interazione tra due E. ceppi di E.: Una popolazione produce autoinducer-2 (AI-2), Una molecola di segnalazione, e viene chiamato "AI-2 mittente." L'altra popolazione, denominato "AI-2 ricevitore," è un reporter di AI-2, al ricevimento della AI-2 per diffusione da parte del mittente, che esprime la proteina fluorescente rossa DsRed. (B) l'immagine di fluorescenza rossa coppia di elettrodi con la popolazione AI-2 mittente codeposited con alginato sull'elettrodo sinistra e AI-2 popolazione ricevitore codeposited con alginato sull'elettrodo di destra. Visualizzazione ingrandita dimostra l'espressione DsRed dei soli AI-2 ricevitori.
Figura 3. Elettrodeposizione Chitosan. (A) schema che mostra il pH-dipendente elettrodeposizione di chitosano. Elettrolisi dell'acqua in un elettrodo polarizzato catodicamente provoca un pH elevato localizzato (indicato da un cambiamento di colore localizzata di un colorante indicatore di pH vicino al catodo in micrografia) che stimola la transizione sol-gel di chitosano in questa regione. (B) Le ammine presenti sul chitosano dòt pH-sensibili proprietà. Sopra un pH di 6,3 (pKa di chitosano) le ammine sono deprotonato, facilitare la transizione dalla sua forma protonata solubile alla sua forma di gel insolubile. (C) Un elettrodo d'oro modellato è stato utilizzato per electrodeposit chitosano. L'elettrodo, catodicamente collegato alla rete di alimentazione, è stato immerso in una verde fluorescente-marcato chitosano (0,8%) soluzione di deposizione. Dopo elettrodeposizione per 2 min. ad una densità di corrente di 4 A / m 2, il film electroaddressed chitosano è stato ripreso mediante microscopia a fluorescenza.
Figura 4. Trasduzione elettrochimica con un film chitosano funzionalizzato. (A) schematico che mostra la configurazione di un sistema a tre elettrodi. Chitosano funzionalizzato pellicola funge da elettrodo di lavoro, un filo di platino come contro-elettrodo e Ag / AgCl come elettrodo di riferimento. Trasduzione elettrochimica dei proventi di glucosio attraverso °elettroniche reazioni enzimatiche e elettrochimica mostrati in cui perossido di idrogeno prodotto possono essere ossidati e rilevati in corrispondenza dell'elettrodo di lavoro. (B) ciclico voltammagram (CV) ad elettrodo con una pellicola di chitosano contenente glucosio ossidasi elettrochimicamente coniugato (GOX) mostra un segnale forte anodica in una soluzione di glucosio 5 mM. Un film non contenente GOX servito come controllo e non mostrava alcun segnale nella stessa soluzione. (C) Una curva standard tra corrente anodica e la concentrazione di glucosio che presenta un rapporto quasi lineare (ciascuna aliquota aumentato la concentrazione di glucosio da 4 mM e aumentato anche l'ampiezza della corrente nel grafico inserto in un modo graduale).
Figura 5. Funzionalizzazione proteina usando montaggio enzimatica. (A, superiore) schema che mostra tirosina-tag "AI-2 Synthase" essere covalentemente legato a un film di chitosano dall'assemblea tirosinasi. I residui di tirosina diventano ossidoized a O-chinoni dall'azione tirosinasi e possono reagire con i gruppi amminici sulla pellicola chitosano, formando un legame covalente. (A, inferiore) L'IA-2 Synthase genera AI-2 da un substrato (SAH), le cellule del ricevitore segnalare il generata AI-2 da DsRed espressione di fluorescenza. (B) immagini a fluorescenza che mostrano un film di chitosano su oro, funzionalizzati con blu-marcato AI-2 sintasi. Adiacenti, IA-2 cellule ricevitore sono codeposited con alginato su Ito. Dopo aggiunta del substrato enzimatico al pozzo e l'incubazione, le cellule AI-2 ricevitore esprimono DsRed.
Discussion
Le nostre procedure di dimostrare l'elettrodeposizione e funzionalizzazione di film biopolimero, un processo che chiamiamo biofabrication. Attraverso funzionalizzazione con cellule e biomolecole creiamo superfici biologiche in grado di interagire con l'altro e l'indirizzo elettrodo sono assemblati su. Il primo passo, elettrodeposizione, avviene attraverso la attivato auto-assemblaggio di biopolimeri, chitosano e alginato nei nostri studi, in risposta ad un segnale elettrico. Come detto in precedenza un gradiente di pH viene generato che può essere controllato dalla densità di corrente e tempo di deposizione, fornendo ulteriore controllo sulla pellicola le dimensioni e le proprietà 6,17. Abbiamo trovato che una varietà di densità di corrente e combinazioni tempo di deposizione può essere utilizzata per gli elettrodi indicati nella Tabella 1. Anche se l'uso di altri elettrodi è fattibile, adattamenti la procedura sarebbe necessario. Rispetto ad altre tecniche di formazione di pellicola del processo di electrodeposizione è semplice, rapido e reattivi. Non c'è bisogno di un vasto repertorio di attrezzature costose e laboriose preparazioni. È importante sottolineare che il processo può sopportare piccole deviazioni sperimentali e può essere facilmente avviato in caso di problemi.
Il chitosano è in grado di rispondere a un elevato gradiente di pH catodica a causa importanti proprietà funzionali conferite ad essa da un elevato contenuto di ammine primarie. A pH elevato (superiore al suo pKa di ~ 6,3) le ammine sono deprotonato e chitosano diventa insolubile, permettendo per formazione di pellicola. Dopo la deposizione, i film rimarrà attaccato alla elettrodo. Tuttavia, esiste la possibilità di delaminazione, se desiderato. I film sono stabili fino a quando il pH della soluzione non scenda sotto il pKa. Le soluzioni acide protonate le ammine e le successive repulsioni elettrostatiche gonfiare il gel fino a completa dissoluzione 18. Cioè, il montaggio / smontaggio processo è reversibile su richiesta e allows per la rimozione dei film depositati e il riutilizzo degli elettrodi. Opportunamente, l'intervallo di pH in cui il sol-gel si perviene è vicino a quello in cui i componenti più biologici funzionare in modo ottimale. Ciò rende il processo ideale per la conservazione di funzionalità durante il montaggio 6.
Formazione di pellicola alginato è facilitato dalla elettrolisi di acqua anodica nonché la presenza di carbonato di calcio 7. Il pH basso localizzato in corrispondenza dell'anodo solubilizza il carbonato di calcio porta al rilascio i cationi di calcio. Questi ioni vengono chelato con alginato, formando una struttura reticolata sulla superficie dell'elettrodo. Film di alginato sono reversibili particolare da competizione per ioni calcio da altri composti chelanti come EDTA, citrato o che possono essere utilizzate per sciogliere i film, consentendo per il riutilizzo degli elettrodi sottostanti. Così, i film di alginato sono relativamente fragili quando sottoposto a condizioni fisiologiche perché gli ioni calcio sono facilmente scavenged dalla matrice gel, indebolendo la sua struttura e la promozione di film di delaminazione o ridissoluzione. Per superare questa limitazione, abbiamo incluso un passaggio di incubazione per il film in 1 M CaCl 2 per rafforzare il gel. Inoltre, si consiglia di soluzione di incubazione del film (mezzi cellulari, ecc) è integrato con CaCl 2 alla concentrazione di 500 pM-3 mM.
Il secondo procedimento principale è la funzionalizzazione del film depositato con relativi componenti biologici. Ciò può essere ottenuto in due modi, la prima coniugazione di essere elettrochimico, una strategia che consente una rapida, montaggio reattivi delle proteine con eccezionale controllo spaziale 10. Tuttavia, funzionalizzazione in questo modo è limitata dalla diffusione di ioni Cl - attraverso il film per l'elettrodo, nonché la diffusione della HOCl, l'intermedio reattivo generato, indietro in soluzione. La capacità di molecole elettrochimicamente attivi passareattraverso il film consente di trasduzione di segnali chimici e biologici in facile da leggere segnali elettrici 15. Abbiamo dimostrato tirosinasi-mediata accoppiamento come una seconda strategia per funzionalizzazione enzima di chitosano, dimostra covalentemente collegando AI-2 Synthase. Questa strategia consente il processo di funzionalizzazione di essere controllato e selettivo - dipendente da un reagente specifico, tirosinasi, che agisce su discriminately proteine contenenti un tag tirosina 9.
Mostriamo l'utilità e la biocompatibilità dei sistemi multi-indirizzo replicando vie naturali su un chip. In primo luogo abbiamo organizzato due popolazioni cellulari (ad esempio "mittenti" e "riceventi") agli indirizzi distinti, e ha dimostrato che hanno interagito tra gli elettrodi adiacenti per fornire AI-2 e generare una risposta di fluorescenza. Questo concetto è stato anche dimostrato da Cheng et al. in un chip microfluidico 14. Abbiamo anche imitato l'interazione, ma invece utilizzatoun enzima per sintetizzare AI-2 per la consegna. In questo modo, un percorso di sintesi intracellulare, AI-2 sintesi, è stata replicata attraverso biofabrication e funzionato quanto sarebbe in soluzione.
In entrambi i casi, l'assemblaggio di più indirizzi presenta il problema di evitare il legame non specifico tra indirizzi poiché ogni soluzione di deposizione devono essere introdotti agli elettrodi intero, anche se elettrodeposizione è destinato esclusivamente presso un indirizzo. Lavaggio delicato ma approfondito in grado di rimuovere la maggior parte della soluzione residua non-biased elettrodi, l'uso del flusso nei canali microfluidici può ridurre ulteriormente non-specificità. In particolare per la biofabrication adiacente di chitosano e alginato indirizzi, si consiglia depositando il primo film di chitosano, seguendo questa procedura con biofunctionalization, e dopo questo, elettrodeposizione alginato. Anche se non abbiamo fatto qui, abbiamo scoperto che bloccando il film chitosano con proteine inerti (come ad esempio milk, BSA, ecc) diminuisce notevolmente il legame non specifico di molecole indesiderate di superficie amminato chitosano.
Abbiamo trovato utilità nella creazione di elettrodi a motivi geometrici, spesso si trovano in dispositivi bioMEMS, come il "blueprint" per un complesso sistema di cellule e biomolecole. Gli usi di elettrodepositata chitosano nei dispositivi BioMEMS può andare ben oltre gli esempi menzionati qui 19. Chitosano può essere depositato su varie geometrie microscala - come in microcanali e su superfici non piane 20,15. I film possono essere anche modificati con altri polimeri e una varietà di proteine, DNA, nanoparticelle, e redox-attivi molecole per nuove proprietà 21,22,23. Nei dispositivi bioMEMS, film chitosano sono stati utilizzati per la somministrazione di farmaci, di rilevamento e piccola molecola redox, biocatalisi, e studi sulle cellule 20,23,24,25. Analogamente, alginato è ampiamente usato come cellula-matrice e intrappolamento è stata esplorata per reversibile contenimento fluidicopopolazioni cellulari e in film immunoanalysis 26,27,28. Film compositi per applicazioni di ingegneria tissutale sono state fabbricate utilizzando elettrodeposizione alginato, con componenti quali con idrossiapatite per impianti ortopedici 29.
Nelle nostre manifestazioni di biofabrication, abbiamo dimostrato entrambe le interazioni tra componenti biologiche e attraverso il bio-elettronico interfaccia ugualmente applicabile; questo porta nella raggiungere la prospettiva di integrare tutte le varietà di interazioni per prestazioni sofisticate in on-chip trasmissione del segnale. Di conseguenza, biofabrication può facilitare la realizzazione di dispositivi con ridotte dimensioni caratteristiche "minime" come un seguito diretto a rapidi sviluppi di microfabbricazione, come spesso motivati da elettronica di consumo. Vale a dire, nei prossimi dispositivi di nuova generazione potrebbe infatti comprendere labili componenti biologiche che offrono il montaggio squisito della natura e le capacità di riconoscimento a lungo sca ancora più piccololes di sistemi creati dall'uomo. Prevediamo a breve termine le applicazioni nella strumentazione analitica, sensori ambientali, dispositivi impiantabili e persino biocompatibili.
Disclosures
Produzione e l'accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato dall'Agenzia United Defense Threat Reduction Stati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo i finanziamenti DTRA per il supporto di questo manoscritto e da ONR, DTRA e NSF per il supporto parziale della ricerca di base.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
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