Summary
Denne artikkelen beskriver en biofabrication tilnærming: avsetning av stimuli-responsive polysakkarider i nærvær av tendensiøse elektroder for å skape biokompatible filmer som kan functionalized med celler eller proteiner. Vi viser en benk-top strategi for generering av filmene så vel som deres grunnleggende bruk for å lage interaktive biofunctionalized overflater for lab-on-a-chip-applikasjoner.
Abstract
Fremskritt i lab-on-a-chip teknologi lover å revolusjonere både forskning og medisin gjennom lavere kostnader, bedre følsomhet, bærbarhet, og høyere gjennomstrømning. Inkorporering av biologiske komponenter inn på biologiske mikroelektromekaniske systemer (BioMEMS) har vist stort potensial for å nå disse målene. Microfabricated elektroniske brikker tillate mikrometer skala funksjonene samt en elektrisk tilkobling for sensing og betjening. Funksjonelle biologiske komponenter gi systemet kapasitet for spesifikk påvisning av analytter, enzymatisk funksjoner og hel-celle evner. Standard microfabrication prosesser og bio-analytiske teknikker har blitt brukt i årtier i datamaskinen og biologisk industri, henholdsvis. Deres kombinasjon og grensesnitt i en lab-on-a-chip miljø, derimot, bringer frem nye utfordringer. Det er en oppfordring til teknikker som kan bygge et grensesnitt mellom elektroden og biologiske component som er mild og er lett å dikte og mønster.
Biofabrication, beskrevet her, er en slik tilnærming som har vist store løftet for sin lett-å-montere inkorporering av biologiske komponenter med allsidighet i on-chip funksjoner som er aktivert. Biofabrication bruker biologisk materiale og biologiske mekanismer (selv-montering, enzymatisk montering) for bottom-up hierarkisk montering. Mens våre laboratorier har vist disse begrepene i mange formater 1,2,3, her vi demonstrere montering prosessen basert på electrodeposition etterfulgt av flere anvendelser av signal-baserte interaksjoner. Oppsettingen består av electrodeposition av biokompatible stimuli-responsive polymer filmer på elektroder og deres påfølgende funksjonalisering med biologiske komponenter som DNA, enzymer, eller levende celler 4,5. Electrodeposition tar nytte av pH gradient opprettet på overflaten av en partisk elektrode fra elektrolyseav vann 6,7,. Kitosan og alginat er stimuli-responsive biologiske polymerer som kan utløses til selv montere inn hydrogel filmer i respons til pålagte elektriske signaler 8. Tykkelsen på disse hydrogeler bestemmes av i hvilken grad den pH gradient strekker seg fra elektroden. Dette kan endres ved hjelp av varierende strømtettheter og avsetning ganger 6,7. Denne protokollen vil beskrive hvordan kitosan filmene er avsatt og functionalized ved kovalent feste biologiske komponenter til de rike primære amin grupper tilstede på filmen gjennom enten enzymatiske eller elektrokjemisk metoder 9,10. Alginat filmer og deres entrapment av levende celler vil også bli behandlet 11. Endelig er nytten av biofabrication demonstrert gjennom eksempler på signal-basert samhandling, herunder kjemisk-til-strøm-, celle-til-celle, og også enzym-til-celle signaloverføring.
Både electrodepositionog funksjonalisering kan utføres under nær-fysiologiske forhold uten behov for reagenser og dermed spare labile biologiske komponenter fra tøffe forhold. I tillegg har både kitosan og alginat lenge blitt brukt for biologisk relevante formål 12,13. Generelt kan biofabrication, en rask teknikk som kan ganske enkelt utføres på en stasjonær, brukes for å lage mikron skala mønstre av funksjonelle biologiske komponenter på elektroder og kan brukes til en rekke lab-on-a-chip-applikasjoner.
Protocol
1. Alginat Electrodeposition
- Koble en strømforsyning til egendefinerte fabrikkert elektrodene via patch ledninger med krokodilleklemmer. En indium tin oksid (ITO) dekket glass-slide vil fungere som en anode (jobber elektrode) og platina folie vil fungere som katode (mot elektrode). Plasser elektrodene slik at ITO overflaten som skal functionalized motsetter telleren elektroden og er posisjonert enten vertikalt å bli dyppet i en løsning eller horisontalt slik at deponering løsningen finnes på overflaten.
- Forbered en alginat deponering løsning ved å blande 1% alginat og 0,5% CaCO 3 (etter vekt) i destillert vann og deretter autoklavering løsningen. Det anbefales å kontinuerlig røre løsningen når den ikke er i bruk.
- Senk begge elektrodene i avsetning løsningen. Den alginat brukes, kan fluorescensmerkede med Fluorosfærer (Invitrogen), som per Cheng et al. 14, for å muliggjøre fluorescenCE avbildning av den resulterende filmen.
- Påfør en konstant strøm tetthet (3 A / m 2) i 2 minutter, spenning vil skifte innenfor rekkevidde på 2-3 V.
- Koble fra elektroden og fjerne ikke-deponerte løsning. Skyll forsiktig filmen med NaCl (0,145 M) for å fjerne overflødig alginat.
- Inkuber filmen kort (~ 1 min) i CaCl 2 (0,1 M) for å styrke gel. Skyll med NaCl (0,145 M) og inkuberes i en ønsket løsning supplert med CaCl 2 (1 mm).
- Bilde med en fluorescens mikroskop (figur 1B).
2. Codeposition av kommuniserende Cell populasjoner i Alginat
- Et signal-avsender cellekultur (W3110 WT E. coli), dyrket i LB media, og et signal-mottaker cellekultur (MDAI2 + pCT6-lsrR - amp r + PET-dsRed - Kan r), dyrket i LB media + 50 mikrogram / ml hver av kanamycin og ampicillin, må vokst opp over natten ennd re-inokulert for vekst til en optisk tetthet (ved 600 nm) av en. Juster optisk tetthet av mottakeren cellekultur til 0,4 til 0,6 med LB før bruk.
- Forbered en deponering løsning av 2% alginat og 1% CaCO 3, og bland med hver celle kultur i forholdet 1:1 til en endelig konsentrasjon på 1% alginat, 0,5% CaCO 3, med cellene utvannet til en tetthet på om lag halvparten den dyrkning tetthet.
- Bruk et glass lysbilde mønstret med to ITO elektroder som finnes ved en polydimetylsiloksan (PDMS) godt (utarbeidet etter Sylgard instrukser og klippes til ønsket størrelse) og en platina teller elektrode. Koble en ITO elektroden til en strømforsyning med platina som beskrevet i Prosedyre 1 (Alginat electrodeposition).
- Fordyp elektrodene i en avsetning løsning som inneholder mottakeren cellene. Sett strømforsyningen til en konstant strøm på en tetthet på 3 A / m 2, hvor arealet dimensjonen er definert av singelen elektrode som deposition vil oppstå.
- Påfør gjeldende i 2 minutter for å tillate codeposition av cellene i alginat matrisen.
- Skyll filmen som beskrevet i trinn 1.5.
- Slå anodisk forbindelsen til andre, tilstøtende, ITO elektroden.
- Gjenta prosedyren nedfall (Steps 2.4 - 2.7), men denne gangen innføre løsningen inneholder avsendere cellene.
- Inkuber 2-elektroden chip som inneholder codeposited celler og kalsium-alginat natten ved 37 ° C i fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 10% LB media og 1 mm CaCl 2.
- Etter inkubasjon bilde med en fluorescens mikroskop (figur 2B).
3. Chitosan Electrodeposition
- Koble strømforsyningen til elektrodene via krokodilleklemmer. En gull belagt silisium chip vil fungere som katode (jobber elektrode) og en platina folie vil fungere som anode (mot elektrode). Plasser gull elektroden overflate slik thpå det motsetter disken elektroden og begge er plassert enten vertikalt å bli dyppet i en løsning eller horisontalt slik at deponering løsningen finnes på overflaten.
- Forbered en kitosan løsning ved å blande kitosan flak i vannet sakte legge 2 M HCl å oppløse de polysakkarider (endelig pH 5,6), og pass på å følge prosedyren skissert av Meyer et al. 15.
- Plasser elektrodene til en kitosan løsning (0,8%), helt submerging ønsket område for deponering. Den kitosan brukt kan fluorescensmerkede med 5 - (og-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester (Invitrogen), som per Wu et al 8, for å avbilde el film av fluorescens mikroskopi..
- Påfør en konstant strøm tetthet (4 A / m 2) i 2 minutter. Spenning vil skifte innenfor intervallet 2-3 V. Beregn strømtettheten som en funksjon av gull areal av arbeids elektroden utsatt for deposition løsning.
- Skyll elektroden med DI vann for å fjerne overflødig kitosan. Brikken kan lagres i vann eller PBS (10 mm, pH 7,0).
- Bilde med en fluorescens mikroskop (figur 3C).
4. Elektrokjemisk Transduksjon med en functionalized Chitosan Film
- Codeposit kitosan og glukose oksidase (GOx) fra en løsning (1% kitosan, 680 U / ml GOx, 5,6 pH) i en nåværende tetthet av 4 A / m 2 på en mønstret elektrode i henhold til prosedyre 3 (Chitosan electrodeposition). En kitosan film fanget i GOx vil bli generert.
- Fest behandlet elektroden til en tre-elektroder som arbeider elektrode, en platinatråd som mot elektroden og Ag / AgCl som referanse elektrode, som beskrevet i figur 4A.
- Dyppe elektrodene til en fosfat buffer løsning (0,1 M, 7,0 pH) som inneholder NaCl (0,1 M).
- Elektrokjemisk konjugat protein til kitosanfilm ved å bruke en konstant spenning (0,9 V) for 60s hjelp chronoamperometry 10.
- Plasser brikken i fosfat buffer (0,1 M, 7,0 pH) og vask i 10 minutter på en orbital shaker for å fjerne eventuelle ureagert NaCl og ukonjugert GOx.
- Re-feste til tre-elektroder som beskrevet i trinn 4,2 og senke det i en løsning av 5 mM glukose. Ved hjelp av syklisk voltammetry, feie potensialet i en positiv retning til 0,7 V. Bruk en kontroll film som ikke inneholder glukose oksidase som en sammenligning for mengden av oksidasjon sett i sweep (Figur 4B).
- Fjern elektrodene fra glukose løsning og skyll med fosfat buffer (0,1 M, pH 7,0) og deretter plassere elektrodene til en 10 mL begerglass inneholder 8 ml fosfat buffer (0,1 M, pH 7,0). Bias GOx-functionalized chip til 0,6 V for å tjene som arbeider elektrode (Figur 4C).
- Legg alikvoter av glukose til buffer (hver delmengde øker glukosekonsentrasjonen ved4 mm).
- Generer en standard kurve mellom steady state strøm og glukosekonsentrasjonen for GOx-functionalized kitosan film.
5. Protein Funksjonalisering Bruke Enzymatisk Assembly
- Bruk et glass lysbilde mønstret med en tilstøtende gull og ITO elektrode som finnes i en PDMS godt. Bias gull elektroden med en katodisk potensial til electrodeposit kitosan som vist tidligere. Skyll film kort i DI vann og deretter PBS med pipette.
- Legg til en løsning på 3 mM blå fluorescensmerkede "AI-2 syntase" 16 (ved hjelp av en DyLight merking kit) + 100 U / ml tyrosinase i PBS.
- Inkuber i 1 time ved romtemperatur, og deretter skylle filmen med PBS.
- Påfør en anodisk potensial til ITO elektroden til codeposit en alginat deponering løsning som inneholder mottaker celler (som utarbeides i trinn 2,1-2,2). Følg trinn 2.3-2.6 prosedyre 2 (Codeposition av celle populasjoner i alginat).
- For å generereden overførte signal (AI-2) enzymatisk, etter skylling filmene legge til en løsning på 500 mM S-adenosyl homocystein (SAH) i PBS, supplert med 10% LB media og 1mm CaCl 2. Dekk elektrodene for å hindre fordamping av løsningen og inkuberes over natten ved 37 ° C. Dette vil gi rom for en mottaker celle respons ved å generere en rød fluorescerende protein (dsRed).
- Tilstøtende elektroder kan avbildes med fluorescens mikroskopi ved å justere filtrene til å fange den blå fluorescens av AI-2 syntase og rød fluorescens uttrykkes ved codeposited mottaker cellene (Figur 5B).
6. Representative Resultater
Pålagte elektriske signaler kan skape lokaliserte microenvironments (f.eks felt og graderinger) nær en elektrode overflate og disse stimuli kan utløse selv-montering av polysakkarider som alginat og kitosan å sette som en hydrogel film på elektroden overflaten. Fordi thans sol-gel overgangen skjer ved elektroden overflaten, blir den resulterende filmen electroaddressed, med sin geometri matchende elektroden mønster (Tall 1B, 3C). Biokompatible filmer som alginat og kitosan gir overflater som kan functionalized med biologiske komponenter. Ved hjelp av alginat, har unike celle populasjoner blitt codeposited på separate adresser. Bevis av electroaddressment deres er observert på samspillet mellom avsender og mottaker celle befolkning. Den molekyl autoinducer-2 (AI-2) diffunderer fra avsenderen cellene og tas opp av mottakeren cellene, noe som resulterer i uttrykket for dsRed røde fluorescerende protein (Figur 2A). I figur 2B, blir rød fluorescens kun observert ved elektroden der mottakere blir adressert.
Amin gruppene presentere på kitosan gi den med pH reaksjonsevne nødvendig for electrodeposition samt en overflate egnet for funksjonalisering. Viutnyttet disse unike egenskapene ved elektrokjemisk conjugating den biosensing enzymet glukose oksidase (GOx) til el kitosan filmer. Dette enzymet gir da mulighet for påvisning av glukose gjennom en enzymatisk reaksjon (Figur 4A) produserer hydrogen peroxide som deretter kan elektrokjemisk oksidert å produsere en utgangsstrøm. På denne måten kan en kjemisk signal bli transduced til elektrisk. Figur 4B viser at filmer der GOx var elektrokjemisk konjugert lage en sterk anodisk signal i nærvær av glukose i motsetning til de filmene som ikke inneholder GOx. Disse resultatene indikerer GOx kan monteres på en avsatt kitosan film og vil beholde katalytisk aktivitet. Videre viser figur 4C en step-økning i anodisk strøm produsert i respons til økende glukose konsentrasjoner. Standardkurven også til stede i Figur 4C viser at trinnet-øker gikk i en nær lineær fashion avhengig av mengden glukose lagt. Disse resultatene viser at enzymet også beholder sin følsomhet til å øke konsentrasjonen av glukose ved konjugering til kitosan filmen. Den nedre grensen for deteksjon ble ikke undersøkt her som det tidligere har vært karakterisert for dette systemet i arbeidet Meyer et. al.
Vi har også demonstrert det kovalente immobilisering av et enzym av interesse, konstruert for å inneholde en egendefinert penta-tyrosin tag, til kitosan i en enzymatisk-kontrollert måte. Spesielt er denne prosessen formidlet av enzymet tyrosinase. Som avbildet av ordningen i figur 5A (øvre), et enzym, omfatter AI-2 syntase en penta-tyrosin tag. Tyrosinase virker på tyrosine tag, oksiderende rester 'Choice fenol grupper til O-kinoner, som da kovalent binder til kitosan sin aminer. Bevis av kitosan film funksjonalisering med AI-2 syntase ved tyrosinase forsamlingen er observert i figur 5B (Figur 5A (nedre)). Rød fluorescens av mottakeren cellene (Figur 5B) demonstrerer igjen interaksjon mellom adressene grunn av spredning av AI-2 fra den ene til den andre, og videre indikerer at enzymer immobilisert til kitosan beholde aktiviteten gang kovalent bundet.
Figur 1. Alginat electrodeposition. (A) Mekanisme i alginat electrodeposition: Som en elektrode er anodically forutinntatt, oppstår vannelektrolyse på overflaten, genererer en lokalisert lav pH. Kalsiumkarbonat partikler reagerer med overskuddav protoner, og slipper kalsium kationer som partiklene oppløses. I nærvær av alginat polymer kjeder, blir ionene chelated i en "eggbox" nettverk, danner en krysskoblet hydrogel ved elektroden. Som avstanden fra elektroden øker, har alginat en større tendens til å forbli i løsning på grunn av redusert tilstedeværelse av kalsiumioner. (B) En L-formet mønster ITO elektroden ble brukt til å electrodeposit alginat. En PDMS Brønnen ble festet til elektroden til å inneholde en grønn fluorescently-merket alginat (1%) og CaCO 3 (0,5%) deponering løsning. Etter electrodepositing i 2 min. ved en strøm tetthet av 3A / m 2, ble electroaddressed alginat hydrogel fotografert av fluorescens mikroskopi.
Figur 2. Codeposition av celle populasjoner. (A) Scheme viser samspillet mellom to E. coli-stammer: En befolkning produserer autoinducer-2 (AI-2), Et signalsystem molekyl, og er kalt "AI-2 avsender." Den andre befolkningen, kalt "AI-2-mottaker," er en reporter for AI-2, ved mottak av AI-2 ved diffusjon fra avsenderen, uttrykker det røde fluorescerende protein dsRed. (B) Rød fluorescens bilde av elektroden par med AI-2 sender befolkning codeposited med alginat på venstre elektroden og AI-2-mottaker befolkning codeposited med alginat på høyre elektroden. Forstørret visning demonstrerer dsRed uttrykk for bare AI-2 mottakere.
Figur 3. Chitosan electrodeposition. (A) Scheme viser pH-avhengig electrodeposition av kitosan. Vannelektrolyse ved en cathodically partisk elektrode forårsaker en lokalisert høy pH (vist av en lokalisert fargeendring av en pH indikator fargestoff ved katoden i micrograph) som stimulerer sol-gel overgang av kitosan i denne regionen. (B) De aminer presentere på kitosan gir jegt pH-responsive egenskaper. Over en pH på 6,3 (pKa av kitosan) aminene er deprotonated, tilrettelegge for en overgang fra sin protonerte løselig form til sin uløselig gel form. (C) En mønstret gull elektroden ble brukt til å electrodeposit kitosan. Elektroden, koblet cathodically til strømforsyningen, ble dyppes i en grønn fluorescently-merket kitosan (0,8%) deponering løsning. Etter electrodepositing i 2 min. ved en strøm tetthet av 4 A / m 2, ble electroaddressed kitosan filmen avbildes ved fluorescens mikroskopi.
Figur 4. Elektrokjemisk transduksjon med en functionalized kitosan film. (A) Skjematisk viser oppsett av en tre elektroder. Functionalized kitosan film fungerer som arbeids elektroden, en platinatråd som disken elektrode og Ag / AgCl som referanse elektrode. Elektrokjemisk transduksjon av glukose provenyet gjennom the enzymatiske og elektrokjemisk reaksjon vist hvor produsert hydrogen peroxide kan bli oksidert og oppdaget på arbeidsplassen elektroden. (B) Cyclic voltammagram (CV) ved elektroden med en kitosan film inneholder elektrokjemisk konjugert glukose oksidase (GOx) viser en sterk anodisk signal i en 5 mM glukose løsning. En film som ikke inneholder GOx fungert som en kontroll og vises ingen signal i samme løsning. (C) En standard kurve mellom anodisk strøm og glukosekonsentrasjonen viser en nær lineær sammenheng (hver delmengde økte glukosekonsentrasjonen ved 4 mM og økte også gjeldende amplituden i innfelte grafen i en trinnvis måte).
Figur 5. Protein funksjonalisering hjelp enzymatisk montering. (A, øvre) Scheme viser tyrosin-merket "AI-2 syntase" blir kovalent bundet til en kitosan film av tyrosinase montering. De tyrosinresiduene blir Oxidlisert til O-kinoner av tyrosinase handling, og kan reagere med aminer grupper på kitosan film, danne kovalente bindinger. (A, nedre) The AI-2 syntase genererer AI-2 fra et substrat (SAH); mottakeren cellene rapportere genererte AI-2 ved dsRed fluorescens uttrykk. (B) Fluorescens bilder som viser en kitosan film på gull, functionalized med blå-merket AI-2 syntase. Adjacently, blir AI-2-mottaker celler codeposited med alginat på ITO. Etter tillegg av den enzymatiske underlaget til brønnen og inkubering, uttrykker AI-2-mottaker celler dsRed.
Discussion
Våre prosedyrer demonstrere electrodeposition og funksjonalisering av biopolymer filmer, en prosess vi kaller biofabrication. Gjennom funksjonalisering med celler og biomolekyler skaper vi biologiske overflater som kan samhandle med hverandre og elektroden adressen de er montert på. Det første trinnet, electrodeposition, skjer gjennom utløste selv-montering av biopolymerer, alginat og kitosan i våre studier, som svar på et elektrisk signal. Som nevnt tidligere en pH gradient genereres som kan kontrolleres av den nåværende tetthet og avsetning tid, gir ekstra kontroll over filmen dimensjoner og egenskaper 6,17. Vi har funnet at en rekke nåværende tetthet og deponering tid kombinasjoner kan brukes til elektrodene angitt i tabell 1. Mens bruk av andre elektroder er gjennomførbart, vil justeringer prosedyren være nødvendig. Sammenlignet med andre teknikker for filmdannelse prosessen med electrodeposisjon er enkel, rask og reagentless. Det er ikke behov for en omfattende repertoar av kostbart utstyr og arbeidskrevende forberedelser. Viktigere, kan prosessen tåler mindre eksperimentelle avvik og kan lett startes på nytt hvis det oppstår et problem.
Chitosan er i stand til å svare på et høyt katodisk pH gradient på grunn viktige funksjonelle egenskaper overdratt til det ved et høyt innhold av primære aminer. Ved høy pH (større enn pKa av ~ 6,3) aminene er deprotonated og kitosan blir uløselig, noe som åpner for film formasjon. Etter deponering, vil filmene forbli festet til elektroden. Imidlertid finnes muligheten til å delaminate dem hvis ønskelig. Filmene vil være stabil så lenge pH av løsningen faller ikke under pKa. Sure løsninger protonate aminene og de påfølgende elektrostatiske repulsions hovne opp geleen til den oppløses 18. Det er, er det montering / demontering prosessen reversibel ved etterspørsel og allows for fjerning av avsatt filmer og gjenbruk av elektroder. Beleilig, er pH-område hvor sol-gel overgang skjer nær det som de fleste biologiske komponenter fungere optimalt. Dette gjør prosessen ideelle for oppbevaring av funksjonaliteten under montering seks.
Alginat filmdannelse er tilrettelagt av anodisk elektrolyse av vann, samt tilstedeværelse av kalsiumkarbonat 7. Den lokaliserte lav pH ved anoden solubilizes den kalsiumkarbonat som fører til utgivelsen kalsium kationer. Disse ionene er chelated av alginat, og danner en krysskoblet nettverk på elektroden overflaten. Alginat filmene er særlig reversible ved konkurranse om kalsiumioner fra andre chelaterande forbindelser som citrat eller EDTA, som kan brukes til å oppløse filmene, slik at for gjenbruk av de underliggende elektrodene. Dermed alginat filmene er relativt skjøre når de utsettes for fysiologiske forhold fordi kalsiumioner er lett scavenged fra gel matrix, svekke dens struktur og fremme film delaminering eller redissolution. For å overkomme denne begrensningen, har vi inkludert en inkubasjon steg for filmen i en M CaCl 2 å styrke gel. I tillegg anbefaler vi at filmens inkubasjonstiden løsning (celle media osv.) suppleres med CaCl 2 i en konsentrasjon på 500 mM-3 mm.
Den andre store Prosedyren er funksjonalisering av det deponerte filmen med relevante biologiske komponenter. Dette kan oppnås på to måter, den første var elektrokjemiske konjugering, en strategi som gir mulighet for rask, reagentless montering av proteiner med eksepsjonell romlig kontroll 10. Men funksjonalisering på denne måten begrenses av spredningen av Cl - ioner gjennom filmen til elektroden samt spredning av HOCl, den genererte reaktive mellomliggende, tilbake ut i løsningen. Muligheten av elektrokjemisk aktive molekyler å passeregjennom filmen åpner for transduksjon av kjemiske og biologiske signaler inn i lett-å-lese elektriske signaler 15. Vi har vist tyrosinase-mediert kobling som andre strategi for enzymet funksjonalisering til kitosan, demonstrert ved kovalent feste AI-2 syntase. Denne strategien gjør at funksjonalisering prosessen skal være kontrollert og selektiv - avhengig av en bestemt reagens, tyrosinase, som virker discriminately på proteiner inneholder en tyrosin tag ni.
Vi viser nytten og biokompatibilitet av multi-adresse systemer ved å kopiere naturlige trasé på en chip. Først vi arrangert to celle populasjoner (dvs. "avsendere" og "mottakere") på ulike adresser, og viste at de samhandlet over tilstøtende elektroder for å levere AI-2 og generere en fluorescens respons. Dette konseptet har også blitt demonstrert av Cheng et al. i en microfluidic chip 14. Vi har også etterlignet samspillet, men i stedet bruktet enzym for å syntetisere AI-2 for levering. På denne måten ble en syntetisk intracellulær vei, AI-2 syntese, replikeres gjennom biofabrication og fungerte mye som det ville gjort i løsningen.
I begge tilfeller presenterer montering av flere adresser utfordringen å unngå ikke-spesifikk binding mellom adressene fordi hver deponering løsning må innføres for hele elektroden array, selv om electrodeposition er kun ment til én adresse. Lett likevel grundig vask kan fjerne de fleste gjenværende løsning fra ikke-partisk elektroder, bruk av flyten i microfluidic kanaler kan ytterligere redusere ikke-spesifisitet. Spesielt for tilstøtende biofabrication av kitosan og alginat adresser, anbefaler vi å deponere kitosan filmen først, etter dette med biofunctionalization trinn, og etter dette, electrodepositing alginat. Selv om vi ikke har gjort det her, har vi funnet at blokkering av kitosan filmen med inerte proteiner (for eksempel milk, BSA, etc.) reduserer sterkt ikke-spesifikk binding av uønskede molekyler til kitosan er aminated overflate.
Vi har funnet nytte i å etablere mønstrede elektroder, ofte funnet i BioMEMS enheter, som "blåkopier" for en kompleks ordning av celler og biomolekyler. Bruken av el kitosan i BioMEMS enheter kan gå langt utover de eksemplene som er nevnt her 19. Chitosan kan deponeres på ulike mikroskala geometrier - for eksempel i microchannels og på ikke-plane overflater 20,15. Filmene kan også endres med andre polymerer og en rekke proteiner, DNA, nanopartikler, og redoks-aktive molekyler for romanen egenskaper 21,22,23. I BioMEMS enheter, har kitosan filmer blitt brukt for levering av legemidler, redoks og lite molekyl deteksjon, biocatalysis, og cellestudier 20,23,24,25. Tilsvarende er alginat mye brukt som en celle-entrapment matrise og har blitt undersøkt for reversibel fluidic containment avcelle populasjoner og i-film immunoanalysis 26,27,28. Composite filmer for tissue engineering applikasjoner har blitt fabrikkert ved hjelp av alginat electrodeposition, med komponenter som med hydroksyapatitt for ortopediske implantater 29.
I våre demonstrasjoner av biofabrication, har vi vist både samspillet mellom biologiske komponenter, og over bio-elektronisk grensesnitt for å være like aktuelt, og dette bringer inn nå utsikter til å integrere alle varianter av interaksjoner for sofistikert ytelse i on-chip signaloverføring. Følgelig kan biofabrication lette fabrikasjon av enheter med reduserte "Minimum funksjonen størrelser" som en direkte oppfølging på å raske utviklingen i microfabrication, som ofte motivert av forbrukerelektronikk. Det er, kanskje neste neste generasjons enheter faktisk er labile biologiske komponenter som tilbyr naturens utsøkt montering og anerkjennelse evner på enda mindre lengde SCAles enn menneskeskapte systemer. Vi ser kort sikt programmer i analytisk instrumentering, miljø sensorer, og selv biokompatible implanterbare enheter.
Disclosures
Produksjon og Fri tilgang til denne artikkelen er sponset av USA Defense Threat Reduction Agency.
Acknowledgments
Vi erkjenner midler fra DTRA for støtte for denne manuskript og fra ONR, DTRA, og NSF for delvis støtte av underliggende forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 | |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D | |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 | |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | ||
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 | |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 | |
| Slim Line 2" Alligator Clips | RadioShack | 270-346 | |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer | |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus Corporation | MVX10 MacroView | |
| cellSens Standard | Olympus Corporation | version 1.3 | |
| Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment. | |||
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 | |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR international | BDH3030 | |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR international | VW3247 | |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles | Speciality Minerals Inc. | 100-3630-3 | |
| Table 2. Chitosan and alginate solution reagents. | |||
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 | |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline | Fischer Scientific | S271 | |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich | P4417 | |
| Table 3. Other solution components and buffer reagents. | |||
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 | |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 | |
| "AI2-Synthase" (HGLPT) | Lab stock 16 | ||
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | ||
| MDAI2 + pCT6-lsrR-ampr + pET-dsRed-kanr cells | Lab stock 30 | ||
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 | |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 | |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | PI-53020 | |
| Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents. | |||
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, American Chemical Society. 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel "dual mode" actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
