Summary
培养神经外植体解剖
Abstract
轴突引导的复杂过程,主要是由,这是动态能动结构的尖端处的生长的轴突生长锥。在轴突生长,生长锥必须整合多种来源的指导提示信息,调节细胞的骨架,以推动生长锥和准确定位找到它的具体目标1。这种整合发生在细胞骨架的水平如何,仍是新兴的,在生长锥细胞骨架蛋白和效应动力学检查可以让这些机制的阐明。 非洲爪蟾生长锥足够大(直径10-30微米)进行高的高分辨率实时成像细胞骨架的动态( 如 2-4),很容易分离和操作在实验室设置比其他脊椎动物。青蛙是一个典型的模型系统发育神经生物学研究,以及重要的早期洞察生长锥话筒最初发现使用该系统5-7 rotubule动态。在此方法中8,鸡蛋收集受精卵在体外 ,注入与RNA编码荧光标记的细胞骨架的融合蛋白或其他结构,操纵基因的表达,然后使其发展到神经管阶段。神经管分离解剖,然后进行培养,和不敷神经突起生长锥成像。在这篇文章中,我们将介绍如何执行此方法,我们的目标,就是要培养非洲爪蟾生长锥为后续的高清晰度图像分析。虽然我们提供+ TIP融合蛋白EB1-GFP的例子中,此方法可应用于任意数量的蛋白质生长锥内澄清他们的行为。
Protocol
注:我们描述的前两部分只在简单的步骤,优良的协议的详细信息已在其他地方发表,重点更具体步骤( 如 8-12)。此外,一般的工作与非洲爪蟾脊髓神经元在活细胞培养的协议已经发表在了详细的方法第8条。我们强烈建议审查该文章的这个视频作为一种补充,虽然在这里我们提供足够的信息来成功地执行和故障诊断神经管的解剖和电镀协议在第3步中。
1。 非洲爪蟾卵的体外受精
- 获得卵雌蛙注射绒毛膜促性腺激素(400单位/青蛙)12-18小时前集蛋。收集鸡蛋1X马克的修改林格氏液(MMR)(0.1 M氯化钠,2.0毫米2.0毫米,1.0毫米硫酸镁 ,氯化钾氯化钙,5.0毫摩尔HEPES,pH值7.4 9)。
- 施肥鸡蛋在体外用剁碎睾丸,如前所述9。
- 至少20分钟后,取出胚胎果冻外套在2%以上的半胱氨酸在1X MMR(带来了用NaOH至pH为7.8)为3-5分钟孵育胚胎。洗净0.1X MMR(或0.1%的MBS(修改巴特的盐水,1X配方:88毫米氯化钠,氯化钾1毫米,0.7毫米氯化钙 ,1毫米硫酸镁 , 碳酸氢钠 2.5毫米,5毫米的HEPES,pH值7.8))3 -5倍,并保持在室温下的胚胎,直到注射,或如果需要的话,地方胚胎在14-18°C至发展缓慢。
2。微量注射RNA
注意:虽然我们在这里利用RNA注射,这些技术并不限于核糖核酸,并也可用于DNA,蛋白质,或修饰的核酸的基因操作和以前已经描述了12。
- 在实验中,RNA的标记细胞骨架或其他结构ARË使用mMessage mMachine试剂盒(Ambion公司)的线性DNA模板的转录。需要的mRNA的5'帽和一个3'多聚腺苷酸尾促进翻译和防止退化在胚胎。 PCS2 +是一种常用的用于此目的的载体,和转录试剂盒包括一个帽类似物的合成反应过程中。我们重新悬浮于无核酸酶的DDH 2 0的转录的mRNA,在500和2000之间的库存浓度纳克/微升,然后按提示存储于-80℃。在注射前,稀DDH 2 O中的RNA注射到适当的浓度。因为只有一小体积将被注入胚胎,再悬浮在缓冲液中是没有必要的。我们的最终注入浓度通常是50-200皮克/ NL,根据该构造,我们通常将注入每个胚胎至4 NL,尽管传统上,许多实验室注入10 NL,这是总体积的约1%的一个胚胎。 RNA可以是在高剂量的毒性,胚胎属的剂量为每从10pg LLY取值范围为1 ng,虽然可以耐受高达5纳克取决于特定的基因和纯度。然而,对于成像蛋白质的定位,应尽可能低的水平注入,以避免过度表达的文物。 RNA EB1-GFP在本协议中的最终金额为250微克每胎。
- 准备通过拉动针拉出器9,毛细管的前端直径为〜0.2μm的注射针头。随着萨特P-87拉拔器,我们使用下面的设置:热644,拉125,速度70,250,但这些参数的不同而不同的机器上,必须重新调整,改变后的灯丝(我们目前使用的2.5毫米方盒子丝,宽度为2.5 mm)。在显微镜下,用钳子打破针尖以一个角度到生成羽毛笔状。还有其它的方法为打破和填充注射针(例如,11,12),但我们通过将一小滴(0.5 - 1微升)的后端与RNA填充针针。对于显微注射到胚胎,有一些市售的喷射系统,两个最常见的是的Pico-喷射器(医疗系统),和Nanoject(德拉蒙德科学)(参见图11的详细信息)。我们使用的医疗系统PLI-100的Pico-喷油器,它使用的数字设定的时间内,以提供一致的纳升体积的压缩气体。注射体积必须被校准为每个新的微量吸移管,使用一个阶段微米,和注射时间应进行调整,以达到所需量的注射核糖核酸。
- 地点受精胚胎在1 - 4 - 细胞阶段的塑料培养皿含有5%聚蔗糖的0.1倍MMR。用钳子到位握住胚胎,或放置在一个保持平台(塑料网,与一个〜1毫米的网格中,附着于底部的菜用橡皮泥或牙科用蜡),注入到动物卵裂球所需音量(参见步骤2.1进样体积)的详细信息。分布在几个禄ations整个胚胎,所述至少一个喷射到每个动物卵裂球,以获得更均匀的分布(例如,一个4 - 细胞阶段的胚胎中,我们通常注入在每个卵裂球的1-2倍,而在2 - 细胞阶段胚胎中,我们注入的2-4倍,在每一个卵裂球)。等待2-4细胞阶段的一个好处是,你保证胚胎正常开始切割。但是,如果时间是最重要的,你可以在1 - 细胞期开始,在最终的结果,除需要注入更多的胚胎差别很小。可以使用旧的阶段的胚胎,这是特别有用的,如果特定的细胞类型有针对性的注射,但我们一般喜欢更广阔的表达,我们在年轻的胚胎注入更多的多次注资,以减少需要。
- 注射的胚胎转移到一个塑料培养皿中0.1X MMR,并让他们发展到阶段20日至23日13。孵育胚胎在14至22°C,根据所需的SPEED的发展。 (解剖神经管次日,使用〜22°C的一天后,使用〜14°C)
3。神经管的解剖和电镀
- 在此之前进行解剖,准备培养皿14。首先,外套盖玻片池的表面上方的盖玻片上,Mattek或的Lab-Tek培养皿,并孵育一小时(或者200微克/毫升多聚赖氨酸在PBS中有足够的溶液,人们可以使用玻璃盖玻片坐在宽松的培养皿中,后放置在载玻片上的成像和免疫组化)。吸干,并用PBS超过3次,让干。然后,用10μg/ ml的层粘连蛋白在PBS中的外套菜肴(我们通常使用500微升每盖玻片,足以在表面上池)一小时,在37度。吸液层粘连蛋白的溶液,并用过量的PBS洗3次,小心不要让层粘连蛋白涂层的表面成为暴露到空中接口。更换ë,使用培养基的PBS(50%林格氏液,49%的L-15的媒体,1%胎牛血清,加50微克/ ml青霉素/链霉素和庆大霉素,pH值7.4,过滤灭菌)。 (林格氏媒体,115 mM氯化钠,氯化钾2.5毫米,2毫米氯化钙 ,10 mM HEPES的pH为7.4 mM的EDTA,0.5)。虽然我们的协议,使用这个媒体,应该指出的是,这是一个丰富 的媒体共同为老年人爪蟾视网膜神经节培养的神经元减少能源保留。年轻的脊髓文化的生存和成长为超过24小时的纯林格的媒体,无需额外的增长因素,这确实是使用该系统的好处之一。可选:添加NT3和BDNF(最终浓度为25纳克/微升)培养基中增加轴突生长。
- 由于注入的mRNA的表达的变异,胚胎可能表现出的荧光的马赛克。在此之前执行解剖,屏幕胚胎荧光的存在下,以确定这些胚胎EXPRESS的荧光融合蛋白在神经管。将荧光胚胎阶段20-23到琼脂糖Steinberg的媒体(58毫摩尔NaCl,0.67 mM KCl中,0.44毫摩尔的Ca(NO 3)2,1.3 mM的用MgSO 4,4.6毫摩尔Tris,pH值至7.8,则充满了涂覆的塑料培养皿蒸压)5。为了使琼脂糖凝胶涂层菜,外套塑料盘底部的融化的1%琼脂糖0.1X MMR,让硬化。这提供了一个柔软的表面上,所以,不会发生损坏的罚款钳和钨针,在随后的解剖步骤。 23超越阶段的胚胎解剖是可能的,但它是更具挑战性的组织坚持更加紧密地彼此,因此需要较长的治疗与胶原酶。
- 在解剖的范围,删除用细镊子,卵黄膜,然后隔离整个背侧部的胚胎,进行了一系列的切口。当一个镊子胚胎在地方,使用第二个,做一个切口侧的胚胎暴露中空的内部。然后,用两个钳子捏沿背,腹部分的胚胎组织之间,从而削减一半,分离胚胎神经管的背侧部。
- 为15-20分钟,在旋转器上,松开组织,然后:移液器,背侧外植体到与新鲜Steinberg的溶液琼脂糖涂层的塑料培养皿中,将背侧的外植体在Eppendorf管中的2毫克/毫升胶原酶在Steinberg的媒体中。可选择地,外植体可以被放置在培养皿含有胶原酶溶液15分钟后,在整个剥离,然后可以进行。
- 使用钳子,轻轻地剖析了神经管背表皮和腹脊索。滑动的前端之间的表皮和皮下组织的钳子,慢慢拉回来的表皮,揭示神经管的下方。然后,使用1钳子组织保持和另一个以滑动的尖端之间的神经管和脊索。最后,使用镊子去除任一侧上的管的体节。
- 神经管转移到装满培养基琼脂糖涂覆培养皿,在步骤3.1中所描述。
- 几个神经管收集后,切成无数颗(约20是孤立的,如果整个管)磨钨针或镊子,然后在培养皿板件充满介质(步骤3.1编制),传播外植体均匀地行。
- 电镀后,不动的菜,因为这会干扰安装的细胞。镀神经管外植体孵育约20-22°C。我们通常的菜留在板凳上的细胞在室温下过夜。 非洲爪蟾神经元的好处之一是,无需特殊的培养箱中培养细胞培养,调节CO 2水平或温度。神经突起生长锥,可以观察和成像,在室温12-24小时后,化学镀,虽然生长可以加快与添加的生长因子。在一般情况下,表达的RNA或质粒的产品会导致在变量细胞之间的表达,并因此可能存在的范围内的荧光之间的表达水平生长锥。我们已观察到电镀后持续至48小时以外的荧光蛋白的RNA的表达,但是这依赖于特定的结构。
4。代表性的成果
继后的协议,该协议被概括在图1A中,将发送健康,正确的解剖和培养的神经外植体在层粘连蛋白/多聚赖氨酸的基板, 如图1B中所示的每一个方向上的众多轴突或神经突。提示的轴突的生长锥,无论是DIC的光学元件,在图1C,整体活力动态图像,或高分辨率荧光显微镜检查可成像的LOcalization荧光标记的细胞骨架蛋白,例如,EB1-GFP 如图1D所示。
图1总结的实验方案和预期的结果。 A)协议的流程图。在第3天的解剖细节,请参阅电影。整个神经管应切成约20个大小相等的块,并均匀地分布在盖玻片上的行展开。在这幅漫画描绘为代表,剪刀,切割组织用细镊子。 CG绒毛膜促性腺激素B)DIC图像的轴突或神经突起生长出来的外植体植(在左上角)。 C)放大图像的不断增长的轴突生长锥尖。 D)荧光显微镜图像的EB1-GFP在生长锥。比例尺10微米。 点击此处查看大图 。
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Discussion
非洲爪蟾神经外植体发出神经突起,在一个非常强大的方式24小时后电镀层粘连蛋白/聚赖氨酸基板上,如果条件合适的。该基板上,生长锥高度运动,并可以实现轴突长度可达1毫米,在所有方向上从外植体向外延伸,虽然典型的长度为100微米或以上。如果神经突起不生长出来,有这种情况的原因是这种情况的数量是有限的。一种可能性是,神经外植体没有正确坚持的菜。确保不破坏附件的意外移动的菜电镀后。此外,确保作出正确的层粘连蛋白和多聚赖氨酸涂层的菜肴新鲜制备的试剂。缺乏生长的另一种可能性是,细胞培养基的条件可能不是最优的。仔细检查,以确保所有的媒体解决方案已被正确地制定协议和计算。最后,它是可能的从外植体获得的胚胎可能会对不健康的,虽然如果胚胎可以开发的神经管阶段,这是不太可能的问题。不过,最好是保持整个完整的胚胎在0.1X MMR与解剖,以确保发生,持续发展。
本协议的最重要的步骤是神经管的解剖。与许多模型系统的胚胎微解剖,这是一个相对简单的技术和爪蟾胚胎用于解剖的最大和最宽容的生物之一。但是,如果实验者进行胚胎解剖是全新的,这一步可能需要几个小时完善(最好分布在2-3次)。胶原酶处理后,一些喜欢到下一个删除的中胚层,脊索,和体节,其次由表皮,从而导致在分离的神经管,而另一些喜欢从表皮除去,然后从神经管中分离的其它组织。建议尝试这两种方法来确定最适合每个研究人员。另外,注意不要放太多的压力的神经管在其隔离。它更好以除去从神经管的其他部分的组织,神经管,而不是删除从其他部分的组织,为了减少对管的张力,并防止它从粉碎过早。最后,如果太粘附于神经管周围组织,然后将外植体背面插入胶原酶溶液为几个多分钟。这将使得从周围的组织,特别是表皮,更容易分离的神经管。胶原酶处理长度依赖于年龄较大的胚胎的胚胎阶段,需要更长的治疗,最多至45分钟或更多的28阶段的胚胎。
除了培养神经管外植体,神经管也可以是分离的电镀之前,奥德r以单细胞成像。 8,15中描述的此方法的协议。这种方法的一个好处是,神经元的形态,并可以被检查,作为电池主体没有内部的外植体遮蔽,轴突长度。此外,也可以进行培养神经外植体在各种图案化的基板。例如,“条纹测定”的指导提示已被用来评估生长锥动力学的变化响应于遇到基板文化16,17的边界。条纹图案的线索准备一份详细的协议18。这可以允许细胞骨架的动态分析而的生长锥经受指导提示转向决定。
利用非洲爪蟾神经外植体培养实验有许多好处。培养这些初级神经元与其他系统相比,相对容易获得,并要求成本低。因为它们可以被培养,在室温下成像,不需要昂贵的孵化器。 爪蟾胚胎方便,并且可以得到大量的,他们的迅速发展,他们有足够大的解剖,以最小的培训。因此,本系统特别适合于教学实验室。
使用青蛙胚胎的另一个优点是,它们是适合操纵基因,mRNA或蛋白质的表达水平,这取决于特定的实验的需要。例如,使用mRNA的一个好处是,浓度和注射体积能仔细滴定来控制所得的表达水平,而注入的DNA,另一方面,允许创建的转基因胚胎,其中基因的表达可以通过以下来控制空间和时间特异性启动子( 如 19)。因此,这种神经的外植体的方法可以适用于多种情况对于理解轴突生长的过程中的行为和功能的蛋白质的感兴趣和生长锥的动态。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢鲍勃·弗里曼为培训和克氏针实验室的使用的青蛙设施,凡向量子实验室的支持。我们感谢哈佛医学院的尼康影像中心寻求帮助,在光学显微镜图1中的图像。这项工作是由以下内容:NRSA美国国立卫生研究院的奖学金和NIH K99奖学金拉尔,基础科学伙伴关系的资金( https://bsp.med.harvard.edu/ )AEF和NIH RO1 NS035909 DVV
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
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