Summary
إإكسبلنتس زراعة العصبية من تشريح
Abstract
والدافع إلى حد كبير عملية معقدة من التوجيه من قبل محور عصبي مخروط النمو، والذي هو بنية ديناميكية متحركة في الطرف الجنوبي من محور عصبي المتنامية. خلال ثمرة محور عصبي، يجب على مخروط النمو تكامل مصادر متعددة من المعلومات جديلة التوجيه لتعديل الهيكل الخلوي في لدفع النمو قدما المخروط والتنقل للعثور بدقة أهدافها محددة 1. كيف يحدث هذا التكامل على المستوى هيكل الخلية والناشئة لا تزال، وفحص البروتين وديناميات هيكل الخلية المستجيب داخل مخروط النمو يمكن أن تسمح لتوضيح هذه الآليات. الأقماع القيطم المورق النمو كبيرة بما فيه الكفاية (10-30 ميكرون في القطر) لأداء عالية الدقة التصوير الحي للديناميات هيكل الخلية (على سبيل المثال 2-4) وسهلة لعزل والتلاعب في إعداد مختبر مقارنة الفقاريات الأخرى. الضفدع هو نظام النموذج التقليدي للدراسات التنموية بيولوجيا الأعصاب، والأفكار الهامة في وقت مبكر هيئة التصنيع العسكري مخروط النموتم العثور في البداية ديناميات rotubule باستخدام هذا النظام 5-7. في هذه الطريقة 8، يتم جمع البيض والمخصبة في المختبر، مع حقن الترميز RNA الموسومة fluorescently هيكل الخلية البروتينات الانصهار أو بنيات أخرى للتلاعب التعبير الجيني، ثم تترك لتطوير لمرحلة الأنبوب العصبي. يتم عزل الأنابيب العصبية عن طريق تشريح ومثقف ثم يتم، ويتم تصوير مخاريط النمو على neurites التي تعدى. في هذه المقالة، ونحن تصف كيفية تنفيذ هذه الطريقة، والهدف منها هو القيطم المورق الثقافة مخاريط النمو اللاحقة لتحليل الصور عالية الدقة. بينما نحن نقدم مثال TIP + البروتين GFP-EB1 الانصهار، يمكن تطبيق هذه الطريقة إلى أي عدد من البروتينات لتوضيح تصرفاتهم داخل مخروط النمو.
Protocol
ملاحظة: نحن تصف الخطوات في القسمين الأول فقط في سطور، كما تم نشر البروتوكولات ممتازة مع معلومات مفصلة في مكان آخر أن التركيز بشكل خاص على الخطوات التالية (على سبيل المثال 8-12). بالإضافة إلى ذلك، تم بروتوكول عام من العمل مع الخلايا العصبية في العمود الفقري في القيطم زراعة الخلايا الحية التي تم نشرها مسبقا في مقالة مفصلة أساليب 8. ونحن نوصي بشدة مراجعة تلك المادة على أنه مكمل لهذا الفيديو، على الرغم من أننا هنا تقديم معلومات كافية لتنفيذ بنجاح وإصلاحها تشريح الأنبوب العصبي وبروتوكول الطلاء في الخطوة 3.
1. الإخصاب في المختبر من البيض القيطم
- الحصول على البيض من الضفادع الإناث التي حقنت مع gonadotropin المشيمي (400 وحدة / الضفدع) 12-18 ساعة قبل جمع البيض. جمع البيض في حل 1X مارك لقارع الأجراس التعديل (MMR) (0.1 M كلوريد الصوديوم، 2.0 ملي بوكل، 1.0 ملي MgSO 4، 2.0 مم CaCl 2و 5.0 ملي HEPES، درجة الحموضة 7.4 9).
- إخصاب البويضات في المختبر مع الخصيتين المفروم، كما هو موضح سابقا 9.
- بعد ما لا يقل عن 20 دقيقة، وإزالة الجنين هلام معطف من احتضان الأجنة في السيستين 2٪ في MMR 1X (الرقم الهيدروجيني 7،8 تقديمهم للمع هيدروكسيد الصوديوم) لمدة 3-5 دقيقة. يغسل مع MMR 0.1X (أو 0.1X MBS (بارت تم التعديل المالحة، وصفة 1X: 88 مم كلوريد الصوديوم، 1 ملم بوكل، 0.7 ملي CaCl 2، 1 ملم MgSO 4، 2.5 ملم NaHCO 3 و 5 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.8)) 3 -5 مرات، والحفاظ على الأجنة في درجة حرارة الغرفة حتى الحقن، أو إذا رغبت في ذلك، في مكان الأجنة 14-18 درجة مئوية إلى إبطاء التنمية.
2. حقن مكروي من RNA
ملاحظة: على الرغم من أننا استخدام حقن الحمض النووي الريبي هنا، وهذه التقنيات ليست مقصورة على الجيش الملكي النيبالي، ويمكن أن تستخدم أيضا DNA والبروتينات والأحماض النووية أو تعديل للتلاعب الجيني يمكن وصفها تم في السابق 12.
- قبل الرناوات، تجربة لوصفها الهياكل هيكل الخلية أو غيرها من عه كتب من القوالب DNA خطي باستخدام mMachine mMessage مجموعة (Ambion). mRNAs وتتطلب "كاب و3 'بعد 5 ذيل تذييل بعديد الأدينيلات لتعزيز الترجمة ومنع تدهور في الأجنة. PCS2 + هو متجه شائعة تستخدم لهذا الغرض، وعدة يتضمن النسخ التناظرية كاب خلال رد فعل التوليف. نحن اعادة تعليق مرنا المحولة في نوكلياز خالية DDH 2 0، بتركيز الأسهم ما بين 500 و 2،000 نانوغرام / ميكرولتر، تليها تخزين الأوامر في C. ° -80 قبل الحقن، وتمييع RNA في DDH 2 0 إلى التركيز المناسب للحقن. كما سيتم حقن كمية صغيرة فقط في الأجنة، في resuspending العازلة ليست ضرورية. تركيزنا حقن النهائي هو عادة 50-200 جزء من الغرام / NL، اعتمادا على بناء، ونحن عادة ما سوف تضخ ما يصل إلى 4 NL في الجنين، على الرغم من العديد من معامل حقن تقليديا يصل إلى 10 NL، وهو ما يقرب من 1٪ من الحجم الكلي لل جنين. يمكن أن تكون سامة RNA بجرعات عالية، والجرعة في أجناس الأجنةيتراوح من 10 خريج LLY إلى 1 نانوغرام، على الرغم من أن يتم التسامح مع ما يصل إلى 5 نانوغرام اعتمادا على جينات معينة والنقاء. ومع ذلك، لتوطين البروتين التصوير، ينبغي حقن أدنى مستوى ممكن لتجنب الإفراط في التعبير التحف. يتم استخدام الحمض النووي الريبي لEB1-GFP في هذا البروتوكول في المبلغ النهائي من 250 خريج في الجنين.
- إعداد الإبر الحقن عن طريق سحب شعري مع مجتذب إبرة 9، ليبلغ قطرها ميكرون غيض من 0.2 ~. مع مجتذب سوتر P-87، ونحن نستخدم الإعدادات التالية: الحرارة 644، سحب 125، سرعة 70، الوقت 250، ولكن هذه المعايير تختلف تبعا لآلة ويجب إعادة ضبط بعد تغيير خيوط (التي نستخدمها حاليا 2.5 ملم خيوط مربع المربع الذي هو 2.5 ملم واسعة). تحت المجهر، وكسر إبرة غيض مع ملقط في زاوية لتوليد شكل ريشة مثل. هناك طرق أخرى لكسر وملء الإبر حقن (على سبيل المثال 11،12)، ولكننا ملء الإبرة مع RNA عن طريق وضع قطرة صغيرة (0.5 - 1 ميكرولتر) إلى نهاية الخلفي منإبرة. لmicroinjecting في الأجنة، وهناك عدد من أنظمة حقن المتاحة تجاريا، وهما من أكثر كونها بيكو-حاقن (أنظمة الطبية)، وNanoject (دروموند العلمية) (انظر 11 لمزيد من المعلومات). نستخدم أنظمة الطبية PLI-100-الحاقن بيكو، والذي يستخدم غاز مضغوط لفترة محددة من الوقت رقميا من أجل تقديم كميات نانولتر متسقة. يجب معايرة حجم الحقن لكل micropipette جديدة باستخدام ميكرومتر المرحلة، وينبغي تعديل الوقت حقن لتحقيق المبلغ المطلوب من RNA حقن.
- مكان المخصبة الأجنة في 1 - إلى 4 خلايا المرحلة في طبق من البلاستيك تحتوي على 5٪ في Ficoll MMR 0.1X. عقد الجنين في مكان مع ملقط، أو وضع في منصة عقد (أ شبكة بلاستيكية، مع مم ~ شبكة 1، انضمت إلى أسفل الطبق مع البلاستيسين أو الشمع الأسنان)، وضخ حجم المطلوب في blastomeres الحيوان (راجع الخطوة 2.1 للحصول على تفاصيل بشأن حجم الضخ). توزيع في الموضع عدةations في جميع أنحاء الجنين، على الأقل حقنة واحدة في كل من blastomeres الحيوان، للحصول على توزيع موحد أكثر (على سبيل المثال، لمرحلة الجنين 4-الخلية، ونحن عادة حقن 1-2 مرات في كل قسيم أرومي، بينما في المرحلة 2-الخلية الجنين، ونحن حقن 2-4 مرات في كل قسيم أرومي). وهناك فائدة من الانتظار حتى المرحلة الخلية 2-4 هو أن عليك التأكد من أن الجنين بدأ يلتصق بشكل طبيعي. ومع ذلك، إذا كان الوقت هو جوهر المسألة، يمكنك البدء في المرحلة 1-الخلية، مع اختلاف بسيط في النتيجة النهائية غير الحاجة إلى أكثر من الأجنة يتم حقنه. ويمكن استخدام الأجنة أقدم المرحلة أيضا، وهذا مفيد جدا إذا يتم استهداف أنواع معينة من الخلايا للحقن، ولكن كما أننا نفضل عموما التعبير أكثر واسعة، ونحن في حقن الأجنة الأصغر للحد من الحاجة إلى حقن أكثر عددا.
- نقل الأجنة المحقونة إلى طبق من البلاستيك تحتوي على MMR 0.1X والسماح لهم لتطوير المرحلة حتى 20-23 13. احتضان الأجنة في 14 إلى 22 درجة مئوية تبعا جمعية مهندسي البترول المطلوبإد التنمية. (للتشريح أنابيب العصبية في اليوم التالي، استخدم ~ 22 درجة مئوية. لفي اليوم التالي، استخدام ~ 14 ° C.)
3. تشريح أنبوب العصبي وتصفيح
- قبل تنفيذ تشريح، وإعداد أطباق الثقافة 14. أولا، coverslips معطف مع حل ما يكفي من 200 ميكروغرام / مل بولي يسين في برنامج تلفزيوني عن حمام سباحة على سطح ساترة، إما ماتيك أو الأطباق ثقافة مختبر تيك، واحتضان لمدة ساعة واحدة (بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن استخدام الزجاج يجلس coverslips فضفاض في طبق بتري، لوضع في وقت لاحق على شرائح زجاجية للتصوير وكيمياء سيتولوجية مناعية). نضح ويغسل مع وجود فائض من PBS 3 مرات، والسماح الجافة. ثم معطف مع أطباق 10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني laminin (التي نستخدمها عادة 500 ميكرولتر في ساترة، وهو ما يكفي لسباحة على السطح) لمدة ساعة في 37 درجة. نضح laminin حل ويغسل 3 مرات مع وجود فائض من PBS، والحرص على عدم السماح laminin المغلفة السطوح تصبح عرضة إلى واجهة الهواء. Replacه PBS مع وسائل الإعلام والثقافة (50٪ رينغر، 49٪ L-15 وسائل الإعلام، 1٪ مصل بقري جنيني، بالإضافة إلى 50 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتوميسين والجنتاميسين، ودرجة الحموضة 7.4 تعقيم فلتر). (وسائل الإعلام رينغر، 115 مم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 10 درجة الحموضة ملي Hepes 7.4، 0.5 مم EDTA). بينما لدينا بروتوكول يستخدم هذه الوسائط، ينبغي الإشارة إلى أن هذا هو وسائل الإعلام التخصيب المشترك لكبار السن الثقافات القيطم العقدة الشبكية، حيث الخلايا العصبية قد خفضت الطاقة محفوظة. والشباب الثقافات الحبل الشوكي البقاء والنمو لأكثر من 24 ساعة في وسائل الإعلام قارعو الأجراس نقية دون عوامل النمو إضافية، وهذا هو في الواقع واحدة من فوائد استخدام هذا النظام. اختياري: إضافة NT3 وBDNF (لتركيزات الأخير من كل 25 نانوغرام / ميكرولتر) إلى وسائل الإعلام لزيادة الثقافة ثمرة محور عصبي.
- بسبب التباين في التعبير عن مرنا حقن، قد يحمل الأجنة عبارة عن فسيفساء من مضان. قبل أداء التشريح والأجنة كشف عن وجود مضان، لتحديد تلك الأجنة التي إكسبRESS البروتين الانصهار الفلورسنت في الأنبوب العصبي. وضع الأجنة في مرحلة الفلورسنت 20-23 في طبق الاغاروز المغلفة بلاستيكية مملوءة سائل الإعلام شتاينبرغ في (58 ملم كلوريد الصوديوم، 0.67 ملي بوكل، 0.44 ملي كا (NO 3) 2، 1.3 ملي MgSO 4، 4.6 ملم تريس، ودرجة الحموضة إلى 7.8 ثم تعقيمها) 5. لجعل الطبق الاغاروز المغلفة، أسفل معطف من طبق من البلاستيك مع ذاب الاغاروز 1٪ في معدل وفيات الأمهات وتتصلب 0.1X عسكر طيبة. هذا يوفر سطح ناعم بحيث لا يحدث ضرر للملقط غرامة الإبر التنغستن واستخدمت خلال الخطوات اللاحقة تشريح. تشريح الأجنة بعد المرحلة 23 هو ممكن، ولكن من أكثر تحديا والأنسجة تلتزم بشكل وثيق مع بعضها البعض، وبالتالي تتطلب العلاج لفترة أطول مع كولاجيناز.
- تحت نطاق تشريح، وإزالة الغشاء المحي مع ملقط غرامة، وعزل ثم الجزء كامل الظهري للجنين، من خلال جعل سلسلة من الشقوق. وفي حين أن أحد ملقط الجنين عقد في مكان، استخدم الثانية إلى إجراء شق علىجانب من الجنين لفضح الداخلية جوفاء. ثم، استخدم كل من ملقط لقرصة على طول الأنسجة بين شطري الظهرية والبطنية للجنين، وقطع بذلك الجنين في نصف لعزل الجزء الظهري يحتوي على الأنبوب العصبي.
- وضع يزدرع الظهرية في أنبوب إيبندورف مع 2 ملغ / مل كولاجيناز في وسائل الإعلام شتاينبرغ ل15-20 دقيقة على محور دوار، لتخفيف الأنسجة، ومن ثم ماصة يزدرع الظهرية في طبق الاغاروز المغلفة البلاستيكية التي تحتوي على حل شتاينبرغ الطازج. بدلا من ذلك، يتم وضع يزدرع في طبق بتري تحتوي على حل كولاجيناز لمدة 15 دقيقة، حيث يمكن بعد ذلك تشريح كامل تنفيذها.
- باستخدام زوج من ملقط، تشريح بلطف الأنبوب العصبي من البشرة الظهرية والبطنية القردود. حرك ملقط غيض من بين البشرة والأنسجة الكامنة وسحب ببطء مرة أخرى في البشرة، وكشف عن الأنبوب العصبي تحت. ثم، استخدم أحد ملقط لعقد الأنسجة وآخر لشريحة غيض بينالأنبوب العصبي والقردود. وأخيرا، استخدام ملقط لإزالة و somites على جانبي الأنبوب.
- نقل الأنبوب العصبي لطبق الاغاروز المغلفة مليئة سائل الإعلام والثقافة، كما هو موضح في الخطوة 3.1.
- بعد مجموعة من الأنابيب العصبية عدة قطع منها الى قطع عديدة (حوالي 20، إذا تم عزل الأنبوب كله) باستخدام الإبر التنغستن شحذ أو ملقط، ومن ثم لوحة القطع في أطباق مليئة الثقافة المتوسطة (أعدت في الخطوة 3.1)، يتباعد وإإكسبلنتس بالتساوي في الصفوف.
- بعد الطلاء، لا تتحرك الأطباق لأن هذا من شأنه ان يعكر خلايا إرفاق. احتضان مطلي إإكسبلنتس الأنبوب العصبي حوالي 20-22 درجة C. نترك الطبق عادة من الخلايا على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. واحدة من فوائد القيطم المورق الخلايا العصبية هو أن لا حاجة إلى حاضنة خاصة لزراعة الخلايا الذي ينظم مستويات CO 2 أو درجة الحرارة. ويمكن ملاحظة نمو neurites والأقماع والتقط في درجة حرارة الغرفة 12-24 ساعة بعد الطلاء، وعلى الرغم من إمكانية تسارع نمو مع إضافة عوامل النمو. بشكل عام، سوف تعبير عن RNA أو منتج البلازميد ينتج التعبير متغير بين الخلايا، وبالتالي قد يكون هناك مجموعة من مستويات التعبير مضان بين الأقماع النمو. وقد لاحظنا RNA التعبير عن البروتينات الفلورية أن تستمر إلى ما بعد 48 ساعة بعد الطلاء، وعلى الرغم من أن هذا يعتمد على بناء معين.
4. ممثل النتائج
بعد اتباع البروتوكول، الذي لخص في الشكل 1A، وصحية، وإإكسبلنتس العصبية بشكل صحيح، تشريح ومثقف ترسل محاور عصبية عديدة أو neurites التي في كل اتجاه على laminin / بولي يسين الركيزة، كما هو موضح في الشكل 1B. ولا يمكن تصوير المخاريط النمو في نصائح من محاور عصبية من قبل أي البصريات DIC، كما رأينا في الشكل 1C، لديناميات صورة الحركة عموما، أو عالية الدقة المجهر مضان لدراسة الصغرىcalization fluorescently هيكل الخلية من البروتينات، الموسومة، على سبيل المثال، يظهر EB1-1D GFP في الشكل.
الشكل 1. ملخص بروتوكول تجريبي والنتائج المتوقعة. A) بروتوكول مخطط التدفق. انظر لمزيد من التفاصيل بشأن فيلم تشريح في اليوم 3. وينبغي خفض الأنبوب العصبي بأكمله إلى حوالي 20 قطعة متساوية الحجم وانتشرت بالتساوي في صفوف على ساترة. في هذا الكرتون، وصفت مقص لتمثيل قطع الأنسجة مع ملقط الغرامة. CG موجهة الغدد التناسلية المشيمائية B) صورة من محاور عصبية أو DIC neurites التي بدأت تخرج من يزدرع (يزدرع في أعلى الزاوية اليسرى). C) صورة التكبير العالي للمخروط النمو في غيض من محور عصبي المتنامية. D) صورة مضان المجهري من GFP-EB1 في مخروط النمو. مقياس بار 10 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القيطم المورق إإكسبلنتس العصبية ترسل neurites التي بطريقة قوية للغاية من 24 ساعة بعد الطلاء على laminin / بولي يسين الركيزة إذا كانت الظروف مناسبة. مع هذا الركيزة، والأقماع هي النمو متحركة للغاية ويمكن تحقيق أطوال تصل إلى محوار 1 ملم، وتمتد في كل الاتجاهات من الخارج يزدرع، على الرغم من أطوال النموذجية هي 100 ميكرون أو أكثر. إذا neurites التي لا تنمو خارج، وهناك عدد محدود من الأسباب لهذا أن يكون عليه الحال. أحد الاحتمالات هو أن العصبية إإكسبلنتس لم تلتزم بشكل صحيح إلى الطبق. تأكد من عدم تعطيل المرفقات عن طريق تحريك الطبق عن طريق الخطأ بعد الطلاء. أيضا، تأكد من أن أدلى الأطباق laminin وبولي يسين المغلفة بشكل صحيح مع جميع الكواشف الطازجة المعدة. وهناك احتمال آخر لعدم وجود تلك الخلية هو ثمرة الثقافة ظروف وسائل الإعلام قد لا يكون الأمثل. مضاعفة فحص الحسابات وبروتوكول لضمان أن كافة وسائل الإعلام صياغة الحلول بشكل صحيح. وأخيرا، فمن الممكن أنقد الأجنة التي تم الحصول عليها إإكسبلنتس يكون غير صحي، ولكن إذا الأجنة يمكن أن تتطور إلى مرحلة الأنبوب العصبي، وهذا هو أقل احتمالا أن تكون هذه القضية. ومع ذلك، فمن الأفضل للحفاظ على بعض الأجنة كلها سليمة المستزرعة في MMR 0.1X مع تشريح للتأكد من أن التطوير المستمر يحدث.
الخطوة الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو تشريح الأنبوب العصبي. بالمقارنة مع العديد نموذج الجنين النظام الجزئي تشريح، وهذا هو تقنية بسيطة نسبيا والقيطم المورق الأجنة هي واحدة من أكبر الكائنات الحية وأكثر تسامحا من لتشريح. ومع ذلك، إذا المجرب هو جديد تماما لأداء تشريح الجنينية، وهذا قد يستغرق عدة ساعات خطوة لاتقان (نشر أفضل من جلسات على مدى 2-3). بعد العلاج كولاجيناز، البعض يفضل إزالة المقبل الأديم المتوسط، القردود، وsomites، تليها البشرة، مما أدى إلى أنبوب العصبي المعزولة، في حين يفضل البعض الاخر أن تبدأ مع إزالة البشرة ثمفصل الأنسجة الأخرى من الأنبوب العصبي. فمن المستحسن لمحاولة كل من الأساليب التي تعمل لتحديد أفضل لكل باحث. أيضا، كن حذرا أن لا تضع الكثير من الضغط على الأنبوب العصبي خلال عزلتها. فمن الأفضل لإزالة الأنسجة الأخرى من الأنبوب العصبي، بدلا من إزالة الأنبوب العصبي من الأنسجة الأخرى، من أجل تخفيف حدة التوتر على أنبوب ومنعها من تفتيت قبل الأوان. وأخيرا، إذا الأنسجة المحيطة بها هي ملتصقة جدا من الأنبوب العصبي، ثم ضع الجزء الخلفي يزدرع في حل كولاجيناز لعدة دقائق. وهذا سيجعل فصل الأنبوب العصبي من الأنسجة المحيطة بها، وخاصة البشرة، أسهل بكثير. مدة العلاج تعتمد على كولاجيناز مرحلة من مراحل الجنين، وأقدم أجنة تتطلب علاجات أطول، تصل إلى 45 دقيقة أو أكثر لمرحلة 28 الأجنة.
بالإضافة إلى زراعة إإكسبلنتس الأنبوب العصبي، ويمكن أيضا أن تكون الأنابيب العصبية فصلها قبل الطلاء، في أورديR لخلايا صورة واحدة. ويرد وصف لهذه الطريقة البروتوكولات في 15 و 8. وهناك فائدة من هذا الأسلوب هو أن الخلايا العصبية مورفولوجيا ويمكن فحص طول محوار، كما لا تحجب جسم الخلية داخل يزدرع. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن إإكسبلنتس العصبية مثقف على مختلف ركائز منقوشة. على سبيل المثال، تم استخدام التوجيه "فحص الشريط" جديلة لتقييم التغيرات في ديناميات النمو في مخروط استجابة لمواجهة الحدود الركيزة في الثقافة 16 و 17. وقد وصفت بروتوكول مفصلة لإعداد مخطط أنماط من العظة 18. وهذا يمكن أن تسمح لتحليل ديناميات هيكل الخلية في حين أن مخروط النمو يخضع لقرارات التوجيه التوجيه جديلة.
هناك عدد من الفوائد لاستخدام المورق القيطم للتجارب زراعة يزدرع العصبية. بالمقارنة مع أنظمة أخرى، زراعة هذه الخلايا العصبية الأولية هي سهلة نسبيا للحصول على وتتطلب تكلفة منخفضة. كما أنها يمكن زرعها وتصويرها في درجة حرارة الغرفة،ليس مطلوبا من حاضنات مكلفة. أجنة القيطم يمكن الحصول عليها بسهولة ويمكن الحصول على كميات كبيرة، وأنها تتطور بسرعة، وكانت كبيرة بما يكفي لتشريح مع قدر ضئيل من التدريب. وهكذا، هي مناسبة خاصة هذا النظام للمختبرات التدريس.
ميزة أخرى لاستخدام الأجنة الضفدع هو أنها قابلة للتلاعب من مستويات التعبير الجيني، مرنا، أو البروتين، اعتمادا على احتياجات تجربة معينة. على سبيل المثال، الفائدة من استخدام مرنا هو أنه يمكن تركيز وحجم حقن معاير بدقة للتحكم في مستوى التعبير الناتج، في حين حقن الحمض النووي، من ناحية أخرى، يسمح لخلق الأجنة المعدلة وراثيا التي يمكن التحكم التعبير الجيني من قبل محددة المروج المكانية الزمانية أو (على سبيل المثال 19). وبالتالي، يمكن تطبيق هذه الطريقة لحالات العصبية يزدرع متعددة لفهم السلوك وظيفة من البروتينات ذات الفائدة من خلال ثمرة-المحواروديناميات النمو مخروط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر بوب فريمان للتدريب ومختبر كيرشنر لاستخدام المرفق الضفدع، وأعضاء المختبر Vactor فان حصول على الدعم. نشكر مركز التصوير نيكون في كلية هارفارد الطبية للحصول على المساعدة مع المجهر الضوئي للصور في الشكل 1. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال ما يلي: NRSA NIH الزمالة والزمالة NIH K99 إلى LAL، العلوم الأساسية الشراكة تمويل ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) لAEF، والمعاهد الوطنية للصحة لRO1 NS035909 DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
