Summary
Культивирование нейронных эксплантов от расчлененного
Abstract
Сложный процесс руководства аксонов в значительной степени обусловлено ростом конус, который является динамическим подвижные структуры на кончике растущего аксона. Во время аксона результат, рост конуса должна включать различные источники информации руководства кия, чтобы модулировать ее цитоскелета того, чтобы продвинуть вперед конуса роста и точно перемещаться, чтобы найти его конкретных целей 1. Как эта интеграция происходит на уровне цитоскелета только формируется, и изучение цитоскелета, белки и эффектор динамику в пределах конуса роста может позволить выяснение этих механизмов. Xenopus конусов Хепориз роста достаточно большие (10-30 мкм в диаметре) для выполнения высокой разрешение изображений живых динамики цитоскелета (например, 2-4) и легко изолировать и манипулировать в лабораторных условиях по сравнению с другими позвоночными. Лягушка является классическим модельной системой для развития исследований нейробиологии, и важно раннее понимание рост микрофон конусаrotubule динамика изначально были найдены с помощью этой системы 5-7. В этом методе 8, яйца собирают и оплодотворенных в пробирке, вводили РНК, кодирующей флуоресцентно отмеченных белки цитоскелета слияния или другими конструкциями манипулировать экспрессии генов, а затем позволили разработать на стадии нервной трубки. Нейронные трубы изолированы путем рассечения, а затем культивируют, и рост шишек на перерастает нейриты загружаются. В этой статье мы расскажем, как выполнять этот метод, цель которой заключается в культуре Xenopus Хепориз конусы роста для последующих изображений с высоким разрешением анализ. Хотя мы и предоставляем пример + TIP гибридного белка EB1-GFP, этот метод может быть применен к любому количеству белков выяснения их поведения в конус роста.
Protocol
Примечание: Мы описываем действия, описанные в первых двух разделах только в краткой, так как отлично протоколы с подробной информацией были опубликованы в другом месте, что более конкретно об этих мерах (например, 8-12). Кроме того, общий протокол работы с Xenopus нейронов спинного мозга в живой культуре клеток был ранее опубликован в подробной статье методы 8. Мы настоятельно рекомендуем ознакомиться с этой статьей в качестве дополнения к этому видео, хотя и здесь мы предоставили достаточно информации для успешного выполнения и устранения нервного рассечение трубы и покрытия протокола в шаге 3.
1. Экстракорпорального оплодотворения из яйца Xenopus
- Получить яйца от самки лягушки, которые вводили хорионический гонадотропин (400 единиц / лягушки) 12-18 часа до сбора яиц. Сбор яиц в измененных Ringer 1X Марка раствора (MMR) (0,1 М NaCl, 2,0 мМ KCl, 1,0 мМ MgSO 4, 2,0 мМ CaCl 2, 5,0 мм HEPES, рН 7,4, 9).
- Оплодотворить яйца в пробирке с мясным яички, как описано выше 9.
- После по меньшей мере 20 минут, снимите пальто эмбриона желе путем инкубации эмбрионов в 2% цистеина в 1X MMR (доводят до рН 7,8 с помощью NaOH) в течение 3-5 мин. Промыть 0,1 X MMR (или 0,1 X MBS (модифицированный Saline Барта, 1X рецепт: 88 мм NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl 2, 1 мМ MgSO 4, 2,5 мМ NaHCO 3, 5 мМ HEPES, рН 7,8)) 3 -5 раз, и держать эмбрионы при комнатной температуре до инъекции, или, по желанию, место эмбрионов на 14-18 ° С, чтобы замедлить развитие.
2. Микроинъекция РНК
Примечание: в то время как мы используем инъекции РНК здесь, эти методы не ограничиваются РНК и ДНК, белков или модифицированных нуклеиновых кислот для генной манипуляции также могут быть использованы и были описаны ранее 12.
- До эксперимента, РНК для маркировки цитоскелета или других структур арэлектронной транскрибируется с линеаризованной ДНК с использованием шаблонов mMessage mMachine комплект (Ambion). мРНК требуют 5 'шапку и 3' полиаденилирования хвост, чтобы содействовать переводу и предотвращения деградации в эмбрионах. PCS2 + является широко используемым вектором для этой цели, и транскрипцию комплект входит крышка аналоговый во время реакции синтеза. Мы вновь приостановить транскрипции мРНК в нуклеазы DDH 2 0, на фондовом концентрации от 500 до 2000 нг / мкл, а затем быстрое хранения при температуре -80 ° C. Перед инъекцией, разбавленные РНК в DDH 2 0 до соответствующей концентрации для инъекций. Как только небольшой объем будет введен в эмбрионах, ресуспендирования в буфере не является необходимым. Наша конечная концентрация инъекции, как правило, 50-200 пг / п, в зависимости от конструкции, и мы обычно будет вводить до 4-п в зародыше, хотя во многих лабораториях традиционно вводят до 10 NL, что составляет примерно 1% от общего объема эмбриона. РНК могут быть токсичны в больших дозах, а доза в зародыше родовLLY колеблется от 10 мкг до 1 нг, хотя до 5 нг может быть терпимо в зависимости от конкретного гена и чистоты. Тем не менее, для работы с изображениями локализации белка, минимально возможном уровне должны быть введены, чтобы избежать чрезмерной экспрессии артефактов. РНК для EB1-GFP в этом протоколе используется при окончательном размере 250 пг на эмбрион.
- Подготовка иглы для инъекций, потянув капилляр с иглой съемник 9, наконечник диаметром ~ 0,2 мкм. С Саттер Р-87 Съемник, мы используем следующие настройки: тепло 644, тяга 125, скорость 70, время 250, но эти параметры различаются в зависимости от машины и должны быть заново отрегулировать после замены нити (мы в настоящее время используется 2,5 мм квадратная коробка нити, что составляет 2,5 мм). Под микроскопом, сломать кончик иглы с помощью пинцета под углом, чтобы создать перо-образную форму. Есть и другие методы для взлома и заполнения иглы для инъекций (например, 11,12), но мы заполняем иглу с РНК, создав небольшую каплю (0,5 - 1 мкл) к заднему концуиглу. Для microinjecting в эмбрионы, существует целый ряд коммерчески доступных систем впрыска, два наиболее распространенными из которых являются Pico-инжектор (Medical Systems), а Nanoject (Drummond Научный) (см. 11 для получения дополнительной информации). Мы используем PLI-100 Medical Systems Pico-форсунка, которая использует сжатый газ для цифровой установить период времени для того, чтобы доставить соответствует объемам nanoliter. Объем впрыска должен быть откалиброван для каждого нового микропипетки помощью микрометра, и время впрыска должны быть скорректированы для достижения желаемого количества вводили РНК.
- Место оплодотворенных эмбрионов на 1 - до 4-клеточной стадии в пластиковую чашку, содержащую 5% Ficoll в 0,1 X MMR. Холдинг эмбриона в месте с пинцетом или размещение в проведении платформа (пластиковые сетки, с ~ 1 мм сетки, присоединилась к нижней части блюда с пластилином или зубной воск), ввести желаемую громкость в животных бластомеров (см. шаг 2,1 Подробнее о инъекций томов). Распространение в несколько особъема всей эмбрион, по крайней мере, одной инъекции в каждое из животных бластомеров, чтобы получить более равномерное распределение (например, для 4-клеточной стадии эмбриона, мы обычно вводят 1-2 раз в каждую бластомеров, а в 2-клеточной стадии эмбриона, мы вводим 2-4 раз в каждую бластомеров). Благо ждать, пока 2-4 клеточной стадии является то, что вы обеспечиваете эмбрион начал расщеплять нормально. Однако, если время имеет существенное значение, вы можете начать в 1-клеточной стадии, с небольшой разницей в конечном результате, кроме нескольких эмбрионов нуждаются в инъекции. Старые эмбрионов на стадии могут быть использованы, а также, и это особенно полезно, если специфические типы клеток предназначены для инъекции, но, как мы обычно предпочитают более широкое выражение, мы вводим в младших эмбрионов уменьшить потребность в более многочисленных инъекций.
- Передача введенных эмбрионов в пластиковых блюдо, содержащее 0,1 X MMR и дать им возможность развиваться до стадии 20-23 13. Инкубируйте эмбрионов на 14 до 22 ° C в зависимости от желаемого SPEред развития. (Для рассечения нейронных трубы на следующий день, используйте ~ 22 ° C. Для послезавтра, использовать ~ 14 ° C)
3. Нейронные Dissection труб и покрытия
- Перед проведением вскрытия, подготовки блюд культуры 14. Во-первых, пальто покровные с достаточно решения 200 мкг / мл поли-лизина в PBS в бассейне на поверхности покровного стекла, либо Маттек или Lab-Tek блюд культуры и инкубировать в течение одного часа (в качестве альтернативы, можно использовать стеклянные покровные сидя насыпью в чашку Петри для последующего размещения на стеклах для работы с изображениями и иммуноцитохимия). Аспирируйте и мыть с избытком PBS 3 раза, и дайте высохнуть. Тогда пальто блюд с 10 мкг / мл ламинина в PBS (мы обычно используем 500 мкл на покровное, достаточно, чтобы бассейн на поверхности) в течение одного часа при температуре 37 градусов. Аспирируйте ламинин раствор и промыть 3 раза с избытком PBS, стараясь не допустить, чтобы ламинина покрытие поверхности стали подвергаться воздух. ЗаменяяPBS с электронной культуре средств массовой информации (50% Рингера, 49% L-15 средств массовой информации, 1% эмбриональной телячьей сыворотки, плюс 50 мкг / мл пенициллина / стрептомицина и гентамицина, рН 7,4 и фильтр стерилизованное). (Media Рингера, 115 мм NaCl, 2,5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ Hepes рН 7,4, 0,5 мМ EDTA). В то время как наш протокол использует средства массовой информации, следует отметить, что это обогащенный СМИ общие для старшего Xenopus сетчатки культур ганглий, где нейроны снизили энергию защищены. Молодые спинного культур шнур будет выживать и расти более чем на 24 часа в СМИ чистой Ringers без дополнительных факторов роста, и это действительно одно из преимуществ использования этой системы. Дополнительно: Добавить NT3 и BDNF (до конечной концентрации 25 нг / мкл) в культуральной среде, чтобы увеличить аксона вырост.
- В связи с изменчивостью выражения вводят мРНК, эмбрионы могут проявлять мозаика флуоресценции. Перед проведением вскрытий, экран эмбрионов на наличие флуоресценции, для выявления тех эмбрионов, которые EXPССГ флуоресцентного белка синтеза в нервной трубки. Место флуоресцентных эмбрионов на стадии 20-23 в агарозном покрытые пластиковой блюдо заполнены СМИ Штейнберг (58 мМ NaCl, 0,67 мМ KCl, 0,44 мМ Ca (NO 3) 2, 1,3 мМ MgSO 4, 4,6 мМ Трис, рН до 7,8, то автоклавного) 5. Для того, чтобы агарозном покрытием блюдо, пальто нижнюю часть пластиковой блюдо с расплавленным 1% агарозном в 0,1 X MMR, и пусть затвердевать. Это обеспечивает мягкую поверхность, так что повреждение не приходит в голову тонкой щипцы и вольфрамовой иглы, используемые во время последующих шагов рассечение. Вскрытие эмбрионов за этап 23 возможно, но это более сложный, как тканях придерживаться более тесно друг к другу и, следовательно, требуют более длительного лечения с коллагеназы.
- В рассекает сферу, удалить желточной мембраны с тонким пинцетом, а затем выделить весь спинной части эмбриона, сделав серию разрезов. Пока один щипцы удерживать эмбрион на месте, используйте второй, чтобы сделать разрез настороне эмбриона, чтобы открыть внутреннюю полость. Затем, с помощью щипцов и ущипнуть по ткани между спинной и брюшной половины эмбрионов, тем самым сокращая эмбриона в два раза, чтобы изолировать спинная часть, содержащую нервной трубки.
- Поместите спинного эксплантов в трубку Eppendorf с 2 мг / мл коллагеназы в средствах массовой информации Штейнберга в течение 15-20 мин на ротатор, чтобы ослабить ткани, а затем пипеткой спинного эксплантов в пластиковый агарозном покрытием блюдо с решением свежие Стейнберга. Кроме того, эксплантов может быть помещен в чашку Петри, содержащую коллагеназы решение в течение 15 мин, где весь рассечение могли бы быть выполнены.
- Используя пару щипцов, осторожно рассекают нервной трубки от спинного эпидермиса и вентральной хорды. Вставьте кончик пинцетом между эпидермисом и основной ткани и медленно вытяните назад эпидермиса, выявление нервной трубки под ним. Затем воспользуйтесь одним щипцы для хранения тканей и другое, чтобы скользить между кончикомнервной трубки и хорды. Наконец, используйте щипцы для удаления сомитов по обе стороны от трубы.
- Передача нервной трубки в агарозном покрытием блюдо наполнен культурой массовой информации, как описано в пункте 3.1.
- После сбора нескольких нейронных трубки, порежьте их на многочисленные кусочки (примерно 20, если вся труба изолирована), используя заостренный вольфрамовый иглы или пинцета, а затем пластины штук в культуре блюда заполнены средой (подготовлен в шаге 3,1), разводя эксплантов равномерно в строках.
- После покрытия, не двигаться блюд, потому что это нарушит присоединения клеток. Выдержите покрытие нейронных эксплантов трубки около 20-22 ° C. Мы обычно покидают блюдо из клетки на скамейке при комнатной температуре в течение ночи. Одним из преимуществ Xenopus Хепориз нейронов является то, что специальный инкубатор для культивирования клеток, регулирующий CO 2 уровня или температуры не требуется. Невриты и роста конусов можно наблюдать и отображаемого при комнатной температуре 12-24 Ч после посева, хотя результат может быть ускорена с добавлением факторов роста. В общем, выражение РНК или плазмиды продукта приведет к переменной выражение между клетками, и, следовательно, может быть целый ряд флуоресценции между уровнем экспрессии роста конусов. Мы наблюдали экспрессии РНК флуоресцентных белков сохраняются свыше 48 ч после посева, хотя это зависит от конкретной конструкции.
4. Представитель Результаты
После выполнения протокола, которые представлены на рисунке 1а, здоровые, правильно-расчлененные и культивировали нейронных эксплантов будет посылать многочисленные аксоны или нейритов в каждом направлении на ламинин / поли-лизин подложки, как показано на рисунке 1b. Конусов роста на концах аксонов может быть отображена либо DIC оптика, как показано на рисунке 1C, чтобы изображение общую динамику подвижности, или высокое разрешение флуоресцентной микроскопии для изучения лоcalization флуоресцентно-меченый белки цитоскелета, например, EB1-GFP показано на рисунке 1D.
Рисунок 1. Сводка экспериментальных протоколов и ожидаемые результаты. A) Протокол блок-схемы. Смотрите фильм для подробной информации о рассечение на 3 день. Вся нервная трубка должна быть поделена на примерно 20 одинаковых по размеру частей и распределены равномерно в строках на покровное. В этом мультфильме, ножницы изображены представляют резки ткани с тонкими щипцами. CG хорионический гонадотропин B) DIC изображение аксонов или невриты, растущие из эксплантов (эксплантов в верхнем левом углу). C) Высшее увеличения изображения конуса роста на верхушку растущего аксона. D) флуоресценции изображений микроскопии EB1-GFP в конус роста. Шкала бар 10 мкм. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus Хепориз нейронных эксплантов отправить нейритов в очень надежным способом, через 24 часа после покрытия на ламинин / поли-лизин подложку, если условия являются приемлемыми. При этом подложка, конусы роста очень подвижны и могут достичь аксона длиной до 1 мм, расширения во всех направлениях наружу от эксплантов, хотя типичные длины 100 мкм и более. Если нейриты не растут, Есть ограниченное количество причин, чтобы это было так. Одна возможность заключается в том, что нейронная эксплантов не правильно придерживаться блюдо. Убедитесь в том, чтобы не нарушить вложения случайно движущихся блюдо после посева. Также убедитесь, что ламинин-и поли-лизином блюда были сделаны правильно все свежеприготовленные реагентов. Еще одна возможность для отсутствия результатом является то, что культура клеток средствах массовой информации условий не может быть оптимальным. Дважды проверьте протокол и расчеты, чтобы все средства массовой информации решения были правильно сформулированы. Наконец, не исключено, чтоэмбрионы, из которых эксплантов были получены может быть нездоровым, хотя, если эмбрионы могут развиться до стадии нервной трубки, это вряд ли будет проблемой. Тем не менее, лучше всего, чтобы сохранить некоторые целом нетронутыми эмбрионы культивировали в 0,1 X MMR вместе с вскрытий, чтобы убедиться, что дальнейшее развитие не происходит.
Наиболее критичным этапом этого протокола является нейронной рассечение трубы. По сравнению со многими эмбриона модель системы микро-вскрытий, это относительно простая техника и Xenopus Хепориз эмбрионов является одним из крупнейших и наиболее прощать организмов для рассечения. Однако, если экспериментатор является совершенно новым для выполнения эмбриональных вскрытия, этот шаг может занять несколько часов, чтобы усовершенствовать (лучше разложить в течение 2-3 сеансов). После коллагеназы лечения, некоторые предпочитают следующем удалить мезодерма, хорда, и сомитов, а затем эпидермиса, в результате чего в изолированной нервной трубки, в то время как другие предпочитают начинать с удаления эпидермиса, а затемразделение другие ткани из нервной трубки. Рекомендуется попробовать оба способа, чтобы определить, что работает лучше для каждого исследователя. Кроме того, будьте осторожны, чтобы не положить слишком много нагрузки на нервной трубки во время ее изоляции. Лучше, чтобы удалить другие ткани из нервной трубки, а не удалять нервной трубки из других тканей, в целях снижения напряженности на трубу и предотвратить ее фрагментации преждевременно. Наконец, если окружающие ткани, слишком приверженцем нервной трубки, затем поместите обратно в эксплантов раствором коллагеназы в течение нескольких минут. Это позволит сделать разделение нервной трубки от окружающих тканей, особенно эпидермиса, гораздо проще. Длина коллагеназы лечения зависит от стадии эмбриона, а старший эмбрионы требуют более длительного лечения, до 45 минут или более для этапа 28 эмбрионов.
В дополнение к культивирования эксплантов нейронных трубки, нейронные трубы также могут быть отделены до покрытия, в Ордег к изображению отдельных клеток. Протоколы для этого метода, описанного в 8, 15. Преимущество этого метода в том, что нейронные морфологии и нейритов длина может быть рассмотрен, так как клетка тела не закрывались внутри эксплантов. Кроме того, нейронные эксплантов также можно культивировать на различных узорной поверхности. Например, руководство кия "полоса анализа" используется для оценки изменений в динамике роста конуса в ответ на подложке встречая границу в 16 культуре, 17. Подробный протокол для подготовки полосатых моделей реплики были описаны 18. Это может позволить для анализа динамики цитоскелета, в то время как рост конуса проходит руководством решения ключевых руля.
Есть ряд преимуществ в использовании Xenopus Хепориз для нейронных эксперименты культивирования эксплантов. По сравнению с другими системами, культивирование этих первичных нейронов относительно легко получить и требуют низкой стоимости. Как они могут быть культурным и отображаемого при комнатной температуре,дорогие инкубаторы не требуется. Xenopus эмбрионы были легко доступны и могут быть получены в больших количествах, они развиваются быстро, и они достаточно большие, чтобы рассекать с минимальным уровнем подготовки. Таким образом, эта система особенно подходит для учебных лабораторий.
Еще одним преимуществом использования эмбриона лягушки в том, что они поддаются манипуляциям уровне генов, мРНК, или экспрессии белка, в зависимости от потребностей конкретного эксперимента. Например, выгода от использования мРНК является то, что концентрация и объем впрыска может быть тщательно титровать контролировать полученное выражение уровня, при введении ДНК, с другой стороны, позволяет для создания трансгенных эмбрионов, в которых экспрессия гена можно управлять с помощью пространственных или временных промотора (например, 19). Таким образом, этот метод нейронных эксплантов могут быть применены к нескольким ситуации для понимания поведения и функции белков интересов, во время вырост аксонаи динамика роста конуса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Боба Фримена для обучения и Kirschner лабораторию для использования лягушка-центр и члены лаборатории Ван Vactor за поддержку. Мы благодарим Nikon Imaging Центр Медицинской школы Гарварда за помощью световой микроскопии для изображения на рисунке 1. Эта работа финансировалась в следующей редакции: АЯРБ NIH общение и NIH K99 общение с LAL, фундаментальной науки партнерства финансирования ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) для AEF, и NIH RO1 NS035909 для DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
