Summary
Odling neurala explantat från dissekeras
Abstract
Den komplexa processen att axonet vägledning till stor del driven av tillväxt konen, vilket är den dynamiska rörliga strukturen på spetsen av den växande axonet. Under axonet utväxt, måste tillväxten konen integrera flera källor för vägledning kö information modulera sin cytoskelettet för att driva tillväxten konen framåt och exakt navigera för att hitta de särskilda målen 1. Hur denna integration sker på cytoskelett nivån fortfarande fram, och granskning av cytoskelett protein och effektor dynamiken inom tillväxt konen kan tillåta att klarlägga dessa mekanismer. Xenopus laevis tillväxt koner är tillräckligt stora (10-30 mikrometer i diameter) för att utföra hög upplösning levande avbildning av cytoskelettala dynamik (t.ex. 2-4) och är lätta att isolera och manipulera i ett labb miljö jämfört med andra ryggradsdjur. Grodan är en klassisk modell för utvecklings neurobiologi studier och viktiga tidiga insikter tillväxt konen mikrofonrotubule dynamik ursprungligen hittas med hjälp av detta system 5-7. I denna metod 8, ägg uppsamlas och befruktas in vitro, injicerades med RNA som kodar fluorescerande märkta cytoskelettala fusionsproteiner eller andra konstruktioner för att manipulera genuttryck, och fick sedan utvecklas till neuralröret stadiet. Neurala rör isoleras genom dissektion och sedan odlas och tillväxt kottar på var större än neuriter avbildas. I den här artikeln beskriver vi hur du utför denna metod vars mål är att kultur Xenopus laevis tillväxt koner för efterföljande högupplöst bildanalys. Medan vi ger exempel + TIPS fusionsprotein EB1-GFP, kan denna metod tillämpas på ett antal proteiner för att belysa deras beteenden inom tillväxt konen.
Protocol
Obs: Vi beskriver stegen i de två första avsnitten bara i korthet, som utmärkta protokoll med detaljerad information har publicerats på annat håll som fokuserar mer specifikt på dessa steg (t.ex. 8-12). Dessutom har det allmänna protokollet av att arbeta med Xenopus spinala neuron i levande cellkultur tidigare publicerats i en detaljerad metoder artikel 8. Vi rekommenderar starkt över denna artikel som ett komplement till den här videon, men här vi ge tillräckligt med information för att framgångsrikt genomföra och felsöka neuralrörsdefekter dissekering och plätering protokoll i steg 3.
1. In vitro fertilisering av Xenopus ägg
- Erhålla ägg från hongrodor som injicerades med koriongonadotropin (400 enheter / frog) 12-18 h före insamling av ägg. Samla ägg i 1X Marcs Modifierad Ringers lösning (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM CaClj 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,4 9).
- Befrukta ägg in vitro med malet testiklar, såsom beskrivits tidigare 9.
- Efter minst 20 minuter, ta bort embryot gelé kappa genom att inkubera embryon i 2% cystein i 1X MMR (bringades till pH 7,8 med NaOH) under 3-5 minuter. Tvätta med 0,1 x MMR (eller 0,1 x MBS (Modified Barths Saline, 1X recept: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCla 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCOs 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 gånger, och hålla embryon vid rumstemperatur tills injektioner, eller om så önskas, placera embryon vid 14-18 ° C för att bromsa utvecklingen.
2. Mikroinjektion av RNA
Observera: Även om vi använder RNA-injektion här dessa tekniker är inte begränsade till RNA och DNA, proteiner eller modifierade nukleinsyror för genmanipulation kan också användas och har beskrivits tidigare 12.
- Före experiment, RNA för märkning cytoskelettala eller andra strukturer are transkriberat från linjäriserade DNA-mallar med hjälp av mMessage mMachine kitet (Ambion). mRNA kräver en 5 'cap och en 3' polyadenylerings svans för att främja translation och förhindra nedbrytning i embryon. pCS2 + är en vanligt förekommande vektor för detta ändamål, och transkriptionen kit innehåller ett lock-analog under syntesreaktionen. Vi återsuspendera transkriberade mRNA i nukleasfritt DDH 2 0 vid ett lager koncentration mellan 500 och 2.000 ng / pl, följt av snabb lagring vid -80 ° C. Före injektion, utspädd RNA i DDH 2 0 till den lämpliga koncentrationen för injektion. Eftersom endast en liten volym kommer att injiceras i embryon, återsuspendering i buffert inte är nödvändig. Vår slutlig injektion koncentration är typiskt 50-200 pg / nl, beroende på konstruktionen, och vi vanligtvis kommer att injicera upp till 4 nl per embryo, fastän många laboratorier traditionellt injicera upp till 10 nl, vilket är cirka 1% av den totala volymen av ett embryo. RNA kan vara toxiska vid höga doser, och dosen per embryo släktenlly varierar från 10 pg till 1 ng, även om upp till 5 ng kan tolereras beroende på den särskilda genen och renhet. Men för avbildning proteinlokalisering bör lägsta möjliga nivå injiceras för att undvika över-uttryck artefakter. RNA för EB1-GFP i detta protokoll används i slutliga belopp 250 pg per embryo.
- Förbered injektionsnålar genom att dra kapillär med en nål utdragare 9, till en spets diameter på ~ 0,2 um. Med en Sutter P-87 avdragare använder vi följande inställningar: värme 644, pull 125, hastighet 70, tid 250, men dessa parametrar varierar beroende på maskin och måste åter justeras efter byte av glödtråden (vi använder för närvarande en 2,5 mm rutan glödtråd som är 2,5 mm bred). Under ett mikroskop, bryta nålspetsen med pincett i en vinkel för att alstra en gåspenna-liknande form. Det finns andra metoder för att bryta och fyllning injektionsnålar (t.ex. 11,12), men vi fyller nålen med RNA genom att placera en liten droppe (0,5 - 1 | il) till den bakre änden avnål. För microinjecting in embryon, det finns ett antal kommersiellt tillgängliga insprutningssystem, två av de vanligaste är Pico-injektorn (Medical Systems) och Nanoject (Drummond Scientific) (se 11 för mer information). Vi använder Medical Systems PLI-100 Pico-injektorn som använder komprimerad gas för ett digitalt viss tid för att leverera konsekventa metod i nanoliter volymer. Injektionsvolym måste kalibreras för varje ny mikropipett med en stegmikrometer, och injektion tid bör justeras för att åstadkomma önskad mängd av injicerade RNA.
- Placera befruktade embryon vid 1 - till 4-cellstadiet till en plastskål innehållande 5% Ficoll i 0,1 x MMR. Håll embryot på plats med tång, eller placering i en anläggning plattform (en plast nät, med en ~ 1 mm rutnät, anslutit sig till botten av skålen med modellera eller dentalvax), injicera önskad volym i djur blastomerer (se steg 2,1 för detaljer om injektionsvolymer). Fördela i flera locheten i hela embryot, till åtminstone en injektion i varje djur blastomerer, erhålla mer likformig fördelning (t ex för en 4-cellstadiet embryo, vi vanligtvis injicera 1-2 gånger i varje blastomer, medan i en 2-cellstadiet embryo, injicera vi 2-4 gånger i varje blastomer). En fördel med att vänta tills 2-4 cellstadiet är att du se till att embryot har börjat att klyva normalt. Men om tiden är knapp, kan du börja på 1-cellen skede, med liten skillnad i slutresultatet än fler embryon som behöver injiceras. Äldre steg embryon kan också användas, och detta är särskilt användbart om specifika celltyper är riktade för injektion, men som vi generellt föredrar bredare uttryck, vi injicerar i yngre embryon för att minska behovet av mer talrika injektioner.
- Överför injicerade embryon till en plastskål med 0,1 X MMR och låta dem utvecklas till steg 20-23 13. Inkubera embryon vid 14 till 22 ° C beroende på önskad speEd av utveckling. (För dissekera neurala rör följande dag, använd ~ 22 ° C. För dagen efter, använd ~ 14 ° C)
3. Neuralrörsdefekter dissekering och plätering
- Innan utföra dissektioner, förbereda odlingsskålarna 14. Först päls täckglas med tillräckligt lösning av 200 ng / ml poly-lysin i PBS till poolen över ytan av täckglaset, antingen Mattek eller Lab-Tek rätter kultur, och inkubera i en timme (alternativt kan man använda täckglas sitter löst i en petriskål, för senare placering på objektglas för avbildning och immuncytokemi). Aspirera och tvätta med ett överskott av PBS 3 gånger, och låt torka. Sedan belägga rätter med 10 pg / ml laminin i PBS (vi använder vanligtvis 500 | il per täckglas, tillräckligt för att poolen över ytan) under en timme vid 37 grader. Aspirera laminin lösning och tvätta 3 gånger med ett överskott av PBS, var noga med att inte låta laminin-belagda ytor blir utsatta för luft-gränssnittet. Ersäte PBS med odlingsmedium (50% Ringers, 49% L-15 medium, 1% fetalt bovint serum, plus 50 | ig / ml penicillin / streptomycin och gentamycin, pH 7,4 och filtersteriliserades). (Ringers media, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Medan vår protokoll använder detta media, bör det noteras att detta är ett anrikat medium gemensamma för äldre Xenopus retinal ganglion kulturer, där neuroner har minskat energi reserverat. Unga ryggmärgen kulturer kommer att överleva och växa mer än 24 timmar i rena Ringers media utan ytterligare tillväxtfaktorer, och detta är verkligen en av fördelarna med att använda detta system. Tillval: add NT3 och BDNF (till slutkoncentrationer av 25 ng / ul vardera) till odlingsmedia för att öka Axon utväxt.
- På grund av variationen i uttrycket av injicerade mRNA kan embryon uppvisa en mosaik av fluorescens. Innan du utför dissektioner, skärm embryon för förekomst av fluorescens, att identifiera de embryon som expryck det fluorescerande fusionsproteinet i neuralröret. Placera fluorescerande embryon i steg 20-23 i en agaros-belagd plastskål fylld med Steinbergs medium (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM Tris, pH till 7,8 och sedan autoklaverat) 5. För att göra agaros-belagda maträtt, päls botten av plast skålen med smält 1% agaros i 0,1 X MMR och låt stelna. Detta ger en mjuk yta så att skador inte uppstår på de fina pincett och nålar volfram används under de efterföljande dissekering steg. Dissektion av embryon bortom steg 23 är möjligt, men det är mer utmanande eftersom vävnaderna följa närmare till varandra och därmed kräver längre behandling med kollagenas.
- Enligt en dissektionsmikroskop, avlägsna vitellinmembranet med fin pincett, och sedan isolera hela den dorsala delen av embryot, genom att göra en serie av snitt. Medan en pincett håller embryot på plats, använda den andra för att göra ett snitt påsida av embryot för att exponera den ihåliga inre. Använd sedan båda pincett för att nypa längs vävnaden mellan de dorsala och ventrala halvor embryot, därigenom skära embryot i halv att isolera den dorsala delen innehåller neuralröret.
- Placera den dorsala explantatet i ett Eppendorf-rör med 2 mg / ml kollagenas i Steinberg media i 15-20 min på en rotator, för att lossa vävnader, och sedan pipettera dorsala explantat i en plast agaros-belagda skålen med färsk Steinbergs lösning. Alternativt, kan explantatet placeras i en petriskål innehållande kollagenas lösningen under 15 min, där hela dissektion skulle sedan utföras.
- Med hjälp av en pincett försiktigt dissekera neuralröret från det dorsala epidermis och ventrala notokorden. Skjut spetsen av tången mellan överhuden och underliggande vävnad och sakta dra tillbaka epidermis, avslöjar neuralröret under. Använd sedan en pincett för att hålla vävnaden och en annan att skjuta spetsen mellanneuralröret och notokord. Slutligen använder pincett för att avlägsna somiter på vardera sidan av röret.
- Överför neuralröret till en agaros-belagd skål fylld med odlingsmedium, såsom beskrivs i steg 3,1.
- Efter samling av flera neurala rör, skär dem i många bitar (cirka 20, om hela röret isoleras) med vässade volfram nålar eller pincett, och sedan plattan bitarna i odlingsskålarna fyllda med medium (framställd i steg 3,1), utspridning explantaten jämnt i rader.
- Efter plätering, inte flytta disken eftersom det skulle störa de förenade cellerna. Inkubera pläterade neuralrörsdefekter explantat ca 20-22 ° C. Vi lämnar typiskt skål med celler på bänken vid rumstemperatur över natten. En av fördelarna med Xenopus laevis neuroner är att en speciell inkubator för cellodling som reglerar CO 2 nivåer eller temperatur inte behövs. Neuriter och kottar tillväxt kan observeras och avbildas i rumstemperatur 12-24 Timmar efter plätering, fastän utväxt kan accelereras genom tillsats av tillväxtfaktorer. I allmänhet, kommer uttryck av en RNA-eller plasmid produkt resultera i varierande uttryck mellan celler, och sålunda kan det finnas ett antal fluorescens expressionsnivåer mellan tillväxt koner. Vi har observerat RNA uttryck av fluorescerande proteiner som kvarstår längre än 48 timmar efter plätering, men detta beror på den speciella konstruktionen.
4. Representativa resultat
Efter att ha följt protokollet, som sammanfattas i Figur 1A kommer friska, korrekt-dissekerade och odlade neurala explantat skicka ut många axoner eller neuriter i varje riktning på laminin / poly-lysin substrat, som visas i figur 1B. De tillväxten kottar på spetsarna på axoner kan avbildas antingen DIC optik, som ses i figur 1C, till bild övergripande motilitet dynamik eller hög upplösning fluorescensmikroskopi att undersöka localization av fluorescent-märkta cytoskelettproteiner, exempelvis EB1-GFP visas i Fig. 1D.
Figur 1. Sammanställning av experimentell protokoll och förväntat utfall. A) Protokoll flödesschema. Se film för detaljer kring dissektion dag 3. Hela neuralrörsdefekter ska skäras i ca 20 lika stora bitar och sprida ut jämnt i rader på täckglaset. I denna tecknad film, är sax avbildas att representera skära vävnaden med fin pincett. CG koriongonadotropin B) DIC bild av axoner eller neuriter växer ur explantation (explantat vid övre vänstra hörnet). C) Högre förstoring bild av tillväxt kon vid spetsen av en växande axon. D) Fluorescensmikroskopi bild av EB1-GFP i tillväxt konen. Skala bar 10 um. Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis neurala explantat skicka ut neuriter i ett mycket robust sätt genom 24 timmar efter plätering på laminin / poly-lysin substrat om förhållandena är lämpliga. Med detta substrat, tillväxt koner är mycket rörliga och kan uppnå axon längder upp till 1 mm, som sträcker sig i alla riktningar utåt från explantatet, fastän typiska längder är 100 um eller mer. Om neuriter inte växer ut, det finns ett begränsat antal skäl till detta vara fallet. En möjlighet är att de neurala explantaten inte ordentligt följer skålen. Se till att inte störa bilagor av misstag flytta skålen efter plätering. Kontrollera också att laminin-och poly-lysin-belagda rätter gjordes på rätt sätt med alla färska förberedda reagens. En annan möjlighet för bristande utväxt är att cellodlingsmedia villkor får inte vara optimala. Dubbelkolla protokoll och beräkningar för att säkerställa att alla medielösningar korrekt har formulerats. Slutligen är det möjligt attembryon från vilka explantaten erhölls kan vara ohälsosamt, även om embryon kan utvecklas till neuralröret skede är det mindre sannolikt att vara frågan. Det är dock bäst att hålla några hela intakta embryon odlade i 0,1 X MMR tillsammans med dissektioner för att säkerställa att fortsatt utveckling sker.
Den mest kritiska steget i detta protokoll är neuralrörsdefekter dissektion. Jämfört med många modellsystem embryo mikro-dissektioner, är detta en relativt enkel teknik och Xenopus laevis embryon är en av de största och mest förlåtande av organismer för att dissekera. Men om försöksledaren är helt ny att utföra embryonala dissektioner kan detta steg ta flera timmar att fullända (bäst utspridda över 2-3 sessioner). Efter kollagenas behandlingen, vissa föredrar att nästa avlägsna mesoderm, notokord, och somiter, följt av epidermis, vilket resulterar i den isolerade neurala röret, medan andra föredrar att börja med epidermis avlägsnande och därefterseparering av de andra vävnader från neuralröret. Det rekommenderas att försöka båda metoderna för att avgöra vilka som fungerar bäst för varje forskare. Också vara noga med att inte lägga alltför stor påfrestning på neuralröret under dess isolering. Det är bättre att ta bort andra vävnader från neuralröret, snarare än bort neuralröret från andra vävnader, i syfte att minska spänningarna på röret och hindra den från att fragmentera förtid. Slutligen, om omgivande vävnader är för anhängare till den neuralrörsdefekter, placera sedan explantatet tillbaka till kollagenaslösning under flera minuter. Detta kommer att göra separationen av neuralröret från de omgivande vävnaderna, särskilt epidermis, mycket lättare. Längden på kollagenas behandling beror på scenen av embryot, som äldre embryon kräver längre behandling upp till 45 minuter eller mer för steg 28 embryon.
Förutom odling neuralrörsdefekter explantaten kan neurala rör också dissocieras före plätering, i Order att avbilda enskilda celler. Protokoll för denna metod beskrivs i 8, 15. En fördel med denna metod är att neuronal morfologi och neurit längd kan undersökas, eftersom cellkroppen inte skyms inuti explantatet. Dessutom kan neurala explantat också odlas på olika mönstrade substrat. Till exempel har den vägledning cue "rand-analys" använts för att bedöma förändringar i dynamiken tillväxt kon som svar på möta substrat gränser i kultur 16, 17. Ett detaljerat protokoll för beredning randiga mönster av signaler har beskrivits 18. Detta kan möjliggöra analys av dynamiken cytoskelettala medan tillväxten konen undergår vägledning beslut om cue styrning.
Det finns ett antal fördelar med att använda Xenopus laevis för neurala experiment explantation odling. Jämfört med andra system, odling dessa primära neuroner är relativt enkla att erhålla och kräver låg kostnad. Eftersom de kan odlas och avbildas vid rumstemperatur,dyra inkubatorer behövs inte. är lättillgängliga Xenopus embryon och kan erhållas i stora mängder, utvecklar de snabbt, och de är stora nog att dissekera med minimal utbildning. Sålunda är detta system särskilt lämpat för undervisning laboratorier.
En annan fördel med att använda groda embryon är att de är mottagliga för manipulationer av gen, mRNA eller protein expressionsnivåer, beroende på behoven hos ett särskilt experiment. Till exempel är en fördel med att använda mRNA som koncentrationen och injektionsvolymen noggrant kan titreras för att styra den resulterande uttrycket, medan injicera DNA å andra sidan tillåter för skapandet av transgena embryon som genuttryck kan styras av rumsliga eller tidsmässiga promotor (t.ex. 19). Således kan denna neurala explantat metod tillämpas på flera situationer för att förstå beteendet och funktion av proteiner av intresse under Axon utväxtoch tillväxt kon dynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Bob Freeman för utbildning och Kirschner labbet för användning av grodan anläggningen och medlemmar av Van Vactor labbet för support. Vi tackar Nikon Imaging Center vid Harvard Medical School för att få hjälp med ljusmikroskop för bilderna i figur 1. Detta arbete har finansierats av följande: NRSA NIH gemenskap och NIH K99 gemenskap till LAL, Basic Science Partnership finansiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) till AEF, och NIH RO1 NS035909 till DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
