Summary
हम Imaris तंत्रिका विज्ञान, ImarisXT और MATLAB एक अपरिभाषित आकार के तीन आयामी एकल कक्षों के confocal प्रतिदीप्ति से लिया morphology में बदलाव को मापने का इस्तेमाल एक सॉफ्टवेयर प्लेटफार्म विकसित किया है. इस उपन्यास दृष्टिकोण सेल आकार में रिसेप्टर सक्रियण के बाद बदलाव यों इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए दवाओं की खोज के लिए एक संभव अतिरिक्त उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
Protocol
1. एकल कक्ष प्ररूपी परिवर्तन के तीन आयामी morphometric विश्लेषण
- मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK293) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे hemagglutinin (एचए) टैग corticotropin रिसेप्टर 2 कारक (सीआरएफ R2), जारी एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) 4 पहले से वर्णित है, 5.
- कोशिकाओं अनुपचारित छोड़ दिया गया (कोई इलाज, NT), सीआरएफ-R2 अंतर्जात ligand, corticotropin को रिहा कारक, सीआरएफ (1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट), या चयनात्मक प्रतिपक्षी सीआरएफ R2, 30 विरोधी sauvagine साथ pretreated के साथ प्रेरित (के रूप में -30, 1 सुक्ष्ममापी, 30) मिनट agonist उपचार के लिए पहले.
- कोशिकाओं को फिर से तय किया गया permeabilized और विरोधी हा के साथ इलाज किया. सीआरएफ-R2 Alexa 594 एनएम संयुग्म (1 आईजीजी) विरोधी माउस एंटीबॉडी का उपयोग visualized था. DAPI नाभिक mitotic मंच कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- Experimenter आत्मीयता सीमा, प्रयोगात्मक शर्तों के बाद छवियों का अधिग्रहण और विश्लेषण किया गया है जब तक नहीं जानते थे.
- हम छवि का अधिग्रहण कियानिश्चित HEK293 योजना APOCHROMAT 63x/1.4 तेल डीआईसी उद्देश्य और Zeiss LSM 510 मेटा confocal खुर्दबीन एक सुसंगत एकीकृत दो photon लेजर एक Verdi V5 लेजर और एक 900-F लेजर प्रणाली मीरा के शामिल प्रणाली से जुड़ा का उपयोग कोशिकाओं से.
- डाटा अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं multispectral Sectioning, 488 एनएम और 790 एनएम (~ 350 एनएम 2ph पूर्व) और z विभाजन (0.5 सुक्ष्ममापी वेतन वृद्धि) परमाणु झिल्ली से बाहरी कोशिकी रिसेप्टर डेटा शामिल दोनों compartmentalized थे extremities.
- प्रतिदीप्ति डेटा 1 Imaris, जो दृश्य और 3 डी माइक्रोस्कोपी डेटासेट के विभाजन की अनुमति देता का उपयोग संसाधित किया गया था, और एक 3 डी घन voxels से बना मॉडल morphometric विश्लेषण के लिए बनाया गया था.
फिर, Imaris XT मॉड्यूल MATLAB कंप्यूटर प्रोग्राम की भाषा के साथ इंटरफ़ेस Imaris का उपयोग किया गया था जगह GPCR एक्सटेंशन के निर्देशांक निर्धारित.
सेलुलर परिवर्तनशीलता खाते में ले, हम प्राप्त की और विश्लेषण प्रतिदीप्ति छवियों तक22 कोशिकाओं से: कोई उपचार (NT) (एन 7 =), agonist (सीआरएफ) उपचार (एन 8 =) और प्रतिपक्षी के साथ पूर्व उपचार (एएस-30) agonist उपचार (एन 7 =) पहले (2 चित्रा) .- ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) एक सेल है कि सक्रिय mitotic चरण में नहीं है और अन्य कोशिकाओं को बंद करने के लिए नहीं शामिल होना चाहिए. इस तरीके में, विश्लेषण शामिल होंगे केवल एक नाभिक और रिसेप्टर एक्सटेंशन के साथ कोशिकाओं अन्य कोशिकाओं की निकटता से परेशान नहीं कर रहे हैं.
- सेलुलर 3D संरचना 1 multispectral Imaris (v.7.1.1) का उपयोग कर प्रतिदीप्ति डेटा से पुनर्निर्मित किया गया.
- Imaris द्वारा डिजाइन एल्गोरिथ्म के बाद, पहली सतह प्रतिपादन परमाणु झिल्ली का प्रतिनिधित्व करने के लिए उपयोग किया गया था. Imaris अगर ROI में एक से अधिक नाभिक का निर्धारण करेगा.
- फिर स्पॉट निर्माण एल्गोरिथ्म सीआरएफ - R2 विस्तार का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया था. स्पॉट का पता लगाने का उपयोग किया गया था क्योंकि यह पृष्ठभूमि शोर और की अनियमित तीव्रता के लिए क्षतिपूर्तिअनाकार के आकार की कोशिकाओं के जटिल नेटवर्क.
- सीआरएफ-R2 प्रतिदीप्ति पता लगाने की प्रत्येक इकाई के शामिल किए जाने को अधिकतम करने के लिए, 'स्पॉट व्यास 0.2 सुक्ष्ममापी, जो छवि के भीतर सबसे छोटी इकाई एक गाऊसी फिल्टर का उपयोग करने वाले एक मापा तीव्रता के रूप में विशिष्ट जानकारी एक्सट्रपलेशन करने के लिए स्थापित किया गया था. स्पॉट फ़िल्टरिंग स्पॉट स्वचालित निर्माण की प्रक्रिया में शामिल किया गया था. सॉफ्टवेयर, तथापि, उपयोगकर्ता के लिए फिल्टर का उपयोग करने के लिए मानकों को परिभाषित करने के लिए लचीलापन देता है.
- डेटा truncation से बचने के लिए, डेटा सेट (अहस्ताक्षरित) 8 - बिट नियत बिन्दु से 32 बिट दशमलव में परिवर्तित कर दिया गया.
- voxel तीव्रता डेटा निर्देशांक Imaris XT MATLAB के साथ interfaced मॉड्यूल और प्रत्येक स्थान की सटीक स्थानिक स्थान का उपयोग कर एक दूरी एक संदर्भ बिंदु (3 चित्रा) के रूप में परमाणु झिल्ली का उपयोग परिवर्तन करने के द्वारा निर्धारित किया गया था डेटा हाजिर विमर्श किया गया.
- परिणामी डेटा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है के लिए ग्राफिकल प्रारूप में प्रस्तुतtatistical विश्लेषण. समूहों के बीच तुलना एनोवा दो तरह और Bonferroni posttest का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. डेटा ± एसडी मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. अंतर * पी <.05 में महत्वपूर्ण माना जाता है. गणना GraphPad 5.02 चश्मे (चित्रा 4) के साथ किए गए थे.
2. प्रतिनिधि परिणाम
हमारे दृष्टिकोण की शक्ति को प्रदर्शित करने के लिए, हम सेलुलर परिवर्तन मात्रा निर्धारित है कि जी प्रोटीन युग्मित (GPCRs) रिसेप्टर्स और corticotropin को रिहा कारक ट्रांसफ़ेक्ट HEK293 कोशिकाओं में अंतर्जात ligand सीआरएफ के साथ रिसेप्टर 2 (सीआरएफ R2) की बातचीत से परिणाम.
हम बताते हैं कि सीआरएफ-R2 रिसेप्टर्स प्लाज्मा और कोशिकाओं की झिल्ली (चित्रा 2A और मूवी 1) के परिमित क्षेत्रों से झिल्ली परियोजना में स्थित हैं. 2D पारंपरिक विश्लेषण का उपयोग करना है, यह संभव है कि कोशिकी सीआरएफ-R2 रिसेप्टर्स की इस सबसेट पता लगाने के लिए अगर हम केवल रिसेप्टर आसंजन पो का विश्लेषणकांच पर ints को शामिल किया गया है. फलस्वरूप हम किसी भी अन्य z खड़ी multispectral डेटा (5 चित्रा) से प्राप्त जानकारी खो देते हैं.
जब कोशिकाओं सीआरएफ के साथ व्यवहार कर रहे हैं, कोशिकी रिसेप्टर्स बहुत कम कर रहे हैं प्लाज्मा झिल्ली से स्पॉट की दूरी में कमी के रूप में दिखाया गया है. उन्होंने यह भी असतत स्थानों की एक संख्या (चित्रा 2B और मूवी 2) में मुख्य रूप से परिमित स्थानों से वितरित.
रिसेप्टर झिल्ली वितरण पर सीआरएफ के प्रभाव सीआरएफ-R2 विशिष्ट प्रतिपक्षी, 30 antisavagine (AS-30) के साथ pretreatment से रोका जाता है और हम पाते हैं कि सीआरएफ-R2 एक्सटेंशन (चित्रा 2C और मूवी 3) नहीं बदल सकता हूँ.
स्पॉट के बाहर वितरण, 5 सुक्ष्ममापी स्पेक्ट्रम रंग कोडित अंतराल में साजिश रची है, परमाणु झिल्ली से voxels की दूरी कल्पना का उपयोग. कोई इलाज और प्रतिपक्षी pretreatment (AS-30, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) agonist उपचार (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) से पहले GPCR संकुचन (एन एस) में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखा. Agonist (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) के साथ कोशिकाओं के उपचार उत्तरोत्तर सीआरएफ-R2 युक्त voxels की संख्या को कम कर देता है जब कोई उपचार, 0-5 (एन एस) सुक्ष्ममापी, 6-15 (सुक्ष्ममापी की तुलना में पी ** < 0.01) और> 15 (*** पी सुक्ष्ममापी <.005), या के रूप में 30 उपचार, 0-10 (एन एस) सुक्ष्ममापी, 11-15 (सुक्ष्ममापी की तुलना ** p <0.01) और 15 (सुक्ष्ममापी *** p <0.005) (चित्रा 4).
चित्रा 1. वर्तमान में उपलब्ध तकनीक और उनके प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण करने के लिए सीमा का आरेख. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
(1 आईजीजी) माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना, DAPI करने के नाभिक कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. छवियों लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग (CLS) के साथ हासिल किया गया. स्केल बार 5 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3. हा सीआरएफ-R2 के साथ HEK293 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के 3 डी मॉडल CLS Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों से खंगाला. नाभिक और स्पॉट निर्माण GPCR छोटे vesicles को परिवर्तित एक्सटेंशन का वर्णन के भूतल प्रतिपादन. प्रतिदीप्ति डेटा 1 Imaris जो दृश्य और 3 डी माइक्रोस्कोपी डेटा सेट के विभाजन की अनुमति देता का उपयोग संसाधित थे. फिर, Imaris XT MATLAB साथ इंटरफ़ेस Imaris करने के लिए उपयोग किया गया था. voxel तीव्रता में विमर्श किया गयाहाजिर निर्देशांक. स्पेक्ट्रम कोडित रंग (0-5 सुक्ष्ममापी नीले, हरे, 6-10 सुक्ष्ममापी, पीले 11-15 सुक्ष्ममापी और लाल> 15 सुक्ष्ममापी) स्पॉट दूरी फार्म परमाणु झिल्ली का प्रतिनिधित्व करते हैं. 5 सुक्ष्ममापी पैमाने पर.
चित्रा 4 स्पॉट के बाहर वितरण की ग्राफिक प्रतिनिधित्व 5 सुक्ष्ममापी अंतराल में कोडित स्पेक्ट्रम रंग में साजिश रची है. परमाणु झिल्ली से voxels की दूरी कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. कोई और agonist उपचार से पहले एक (AS-30, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) प्रतिपक्षी (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) के साथ इलाज pretreatment GPCR संकुचन (एन एस) में कोई महत्वपूर्ण अंतर दिखा. Agonist (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) के साथ कोशिकाओं के उपचार उत्तरोत्तर सीआरएफ-R2 युक्त voxels की संख्या की दूरी को कम कर देता है जब कोई इलाज के लिए 0-5 (एनएस) सुक्ष्ममापी, 6-15 सुक्ष्ममापी (पी ** की तुलना <0.01) और> 15 (*** पी <0.005) सुक्ष्ममापी, या के रूप में 30 उपचार 0-10 सुक्ष्ममापी (एन एस), 11-15 सुक्ष्ममापी (** पी <0.01 और)> 15 सुक्ष्ममापी (*** 0.005 <पी).
चित्रा 5 HEK 293 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं हा सीआरएफ R2 के साथ 2 डी morphometric विश्लेषण की सीमा. कोशिकाओं के खंड के मध्य विमान (कांच coverslip ऊपर 3 4μm) नाभिक के केंद्र दिखा विरोधी हा का उपयोग DAPI और हा सीआरएफ-R2 के साथ कल्पना की जांच और Alexa 488nm संयुग्मित विरोधी माउस (आईजीजी 1) माध्यमिक का उपयोग visualized एंटीबॉडी और CLS साथ अधिग्रहण (ए) कोई उपचार (NT) और (बी) agonist (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) के बीच कोई अंतर नहीं पता चलता है, जबकि रिसेप्टर आसंजन अंक नाटकीय रूप से अलग हैं.
मूवी 1 आज़ादी HEK का मोड "पार" में 3D मॉडल घूर्णन हा सीआरएफ R2, कोई उपचार नहीं है, के साथ 293 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं रिसेप्टर प्रोटीन के बीच सेलुलर phenotype मतभेद का मूल्यांकन. स्केल बार में 5 से 20 सुक्ष्ममापी./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "लक्ष्य ="> _blank "फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
मूवी 2 आज़ादी HEK की "पार" मोड में 3D मॉडल घूर्णन हा सीआरएफ-R2, agonist उपचार के साथ 293 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, सीआरएफ (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) रिसेप्टर प्रोटीन के बीच सेलुलर phenotype मतभेद का मूल्यांकन करने के लिए. 5 से 20 सुक्ष्ममापी स्केल बार फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
मूवी 3 आज़ादी HEK का मोड "पार" में 3 डी घूर्णन हा सीआरएफ R2, agonist उपचार से पहले एक प्रतिपक्षी (AS-30, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट) के साथ pretreatment (सीआरएफ, 1 सुक्ष्ममापी, 30 मिनट के साथ 293 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं ) रिसेप्टर प्रोटीन के बीच सेलुलर phenotype मतभेद का मूल्यांकन करने के लिए. 5 से 20 सुक्ष्ममापी स्केल बार फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
हम पता चला है कि सीआरएफ उपचार आकारिकी और सीआरएफ-R2 के स्थान में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन प्रेरित किया. चयनात्मक प्रतिपक्षी उपचार से हिचकते सीआरएफ-R2 में परिवर्तन किया गया था. हम पता चला है कि रिसेप्टर संशोधनों का पता चला है और नहीं मापा नहीं जा सकता थे मानक 2D multispectral तकनीक का उपयोग. morphometric विश्लेषण के लिए जैविक मापदंडों की जटिलता को शामिल करने के लिए जटिल 3 डी छवियों का अध्ययन करने की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण है. हम असंगत प्रतिदीप्ति नेटवर्क घटकों के साथ एक पूर्व निर्धारित आकार के बिना कोशिकाओं की 3D माप बनाने के लिए सक्षम थे. उपयोगकर्ता परिवर्तनीय स्वचालित विधियों की हमारी कमरे हमें अपने वातावरण में व्यक्तिगत अनाकार के आकार की कोशिकाओं में आणविक गतिशीलता यों क्रम में सेल गतिशीलता के बारे में जानकारी निकालने के लिए सक्षम बनाता है. इस उपकरण के लिए सेलुलर रास्ते और inhibitors की उपस्थिति में सेलुलर आकारिकी परिवर्तन पर एक औषधीय परिसर के प्रभाव के बारे में भविष्यवाणी करने के लिए और सेल अस्तित्व के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए मदद कर सकते हैं.
हमारे 3D मात्रा का ठहराव विधि का लाभ यह है कि यह जीव विज्ञान तंत्र में व्यापक विशेषज्ञता के साथ शोधकर्ताओं की अनुमति देता है, लेकिन कंप्यूटर कोड के साथ परिचित, कम्प्यूटर अनुप्रयोगों के साथ इंटरफ़ेस माइक्रोस्कोपी तकनीक नहीं है. हम एकल कोशिका माप के क्रम में जानकारी है कि 6 कोशिकाओं की आबादी को दर्शाता है प्रकट करने के लिए बनाया है. एकल सेल माप हमें एक जटिल आकार अन्य कोशिकाओं के साथ निकटता से बेफिक्र सेल के एक विश्लेषण के साथ प्रदान करता है. इस विधि सेल आकार में परिवर्तन और रासायनिक 7 stimualtion, 8 के बाद झिल्ली बाध्य प्रोटीन के स्थान की जांच में वैज्ञानिकों की सहायता करेगा. एक सेल का विश्लेषण सेलुलर भीतरी कोर के डिब्बों से कोशिकी extremities करने के लिए डेटा को शामिल करना चाहिए. अधिकतम डेटा शामिल किए जाने कि एक 2d छवि से प्राप्त किया जा सकता है एक सेल के मध्य विमान भर में है, लेकिन, नाभिक और प्लाज्मा झिल्ली की बाह्यतम स्थान अलग z-विमानों पर तैनात कर रहे हैं, 2 डी दृश्य truncatesछवि. के रूप में नाभिक सेलुलर आसंजन अंक है, जो कांच coverslip पर स्थित हैं के ऊपर 3 और 4 के बीच सुक्ष्ममापी स्थित है, डेटा की एक विस्तारित राशि खो रहे हैं. इस रिसेप्टर स्थानिक पुनर्गठन केवल 3 डी छवियों में देखा जा सकता है, और विश्लेषण के बिना मात्रा निर्धारित किया जा करने में सक्षम नहीं है. इस उपकरण में एक उपन्यास के लिए कल्पना और उपाय सेलुलर परिवर्तन है कि पारंपरिक 2d विश्लेषणात्मक तकनीकों का उपयोग नहीं पता चला रहे हैं, जानकारी है कि एक पूरे के रूप में सेलुलर प्रणाली के बजाय 2 डी डेटा द्वारा खंडित पते उपलब्ध कराने के दृष्टिकोण प्रदान करता है. एकल कक्षों के साथ मापने, अन्य वर्णित 9 प्रौद्योगिकियों के साथ, यह दृष्टिकोण हमें सेलुलर गतिशीलता की जटिलता और सेलुलर plasticity के आधार की जांच करने के लिए अनुमति देता है.
इस विधि Imaris तक ही सीमित नहीं है और किसी भी डेटा दृश्य कंप्यूटिंग भाषा सॉफ्टवेयर के साथ interfaced सॉफ्टवेयर लागू किया जा सकता है. व्यवस्था करने के लिए भविष्य में सुधार morphometric 3D कोशिकाओं के विश्लेषण रहने से लिया शामिल होंगेकोशिकाओं रासायनिक निर्धारण या रासायनिक धुंधला हो जाना बिना अपनी प्राकृतिक अवस्था में पूरे सेल की परीक्षा की अनुमति है. जीवित कोशिकाओं की छवियों को प्राप्त करने के लिए भी कहनेवाला परिवर्तनशीलता को खत्म करने के बाद से हम समय पर एक ही कक्ष में प्ररूपी माप यों तो कर सकते हैं.
हम हमारे मंच प्रौद्योगिकी विश्वास है, इसके अनिर्दिष्ट के आकार की कोशिकाओं की संरचना को मापने की क्षमता के साथ, अन्य वैज्ञानिकों मात्रा का ठहराव इमेजिंग तकनीक में एक अंतर को भरने के लिए मदद मिलेगी. इस उपन्यास दृष्टिकोण कई एकल कक्ष प्ररूपी परिवर्तन के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू है, इस सेल आधारित परख अन्य एकल कोशिका 10 रूपरेखा, दवाओं की खोज की प्रक्रिया के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में,. चूंकि सेल आकारिकी पहले से ही छोटे अणु inhibitors की पहचान 11, इस मंच के रूप में विकसित करने के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग में उपयोग किया गया है, हम इस विधि एकल कक्षों कि एक ही pharmacologi को प्रभावित से एक खुराक - प्रतिक्रिया वक्र का निर्धारण करने के लिए उपयोगी होने की उम्मीद हैकैलोरी लेकिन कार्रवाई के विभिन्न तंत्र के साथ लक्ष्य.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम Imaris, Imaris XT और Matlab के इस्तेमाल के लिए जैव इमेजिंग विकास केंद्र (BIDC) कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को धन्यवाद. हम तकनीकी सहायता के लिए और हेनरी, लालकृष्ण Floren, पांडुलिपि का संपादन करने के लिए उनके योगदान के लिए एल Daitch वी. Kharazia धन्यवाद. : 1R21DA029966-01 और NIH फास्ट ट्रैक एसईबी फार्मेसी, UCSF स्कूल MLSMR संग्रह स्क्रीन पुरस्कार (यह काम शराब और मादक द्रव्यों के सेवन पर एसईबी, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के माध्यम से UCSF कैलिफोर्निया मेडिकल रिसर्च के राज्य से धन के द्वारा समर्थित किया गया डीन कार्यालय और क्लीनिकल फार्मेसी) और स्कूल ऑफ मेडिसिन CLHK (नैदानिक भेषजगुण और प्रायोगिक चिकित्सा).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
CRF | Sigma | C2917 | |
Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
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