Summary
Vi utvecklade en mjukvaruplattform som använder Imaris neurovetenskap, ImarisXT och MATLAB för att mäta förändringar i morfologi ett odefinierat form tas från tredimensionell konfokal fluorescens av enstaka celler. Denna nya metod kan användas för att kvantifiera förändringar i cellernas form efter receptoraktivering och därför representerar en möjlig ytterligare verktyg för läkemedelsutveckling.
Abstract
De vanligaste programvara analysverktyg tillgängliga för mätning av fluorescens bilder är för tvådimensionella (2D) data som är beroende av manuella inställningar för inkludering och exkludering av datapunkter och datorstödd mönsterigenkänning för att stödja tolkningen och slutsatserna av analysen. Det har blivit allt viktigare att kunna mäta fluorescensbilder konstruerade från tredimensionella (3D) datamängder för att kunna fånga komplexiteten i cellulära dynamik och förstå grunden för cellulära plasticitet i biologiska system. Sofistikerade mikroskopi instrument har gjort det möjligt att visualisering av 3D fluorescens bilder genom förvärv av multispektrala fluorescens bilder och kraftfulla analytiska programvara som rekonstruerar bilderna från konfokala stackar som sedan ger en 3D-representation av de insamlade 2D-bilder. Advanced Design-baserade Stereology metoder har utvecklats av tillnärmningen och antaganden av OriginaL modellbaserad Stereology 1 även i komplexa vävnadssnitt 2. Trots dessa vetenskapliga framsteg inom mikroskopi, kvarstår ett behov av en automatiserad analytisk metod som till fullo utnyttjar de inneboende 3D-data för att möjliggöra analys och kvantifiering av komplexa förändringar i cellmorfologi, protein lokalisering och receptor människohandel.
Aktuella tekniker som är tillgängliga för att kvantifiera fluorescensbilder inkluderar Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) och Image J (NIH) som ger manuell analys. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nordirland) programvara ger funktionen MeasurementPro som gör den manuella skapandet av mätpunkter som kan placeras i en volym bild eller dras på en serie av 2D skivor för att skapa en 3D-objekt. Denna metod är användbar för enda klick punkt mätningar för att mäta en linje avståndet mellan två objekt eller för att skapa en polygon som omsluter ett område av intresse, men det är svårt att tillämpa komplex mobiltelenätet strukturer. Filament Tracer (Andor) medger automatisk detektering av 3D neuronala trådliknande har dock denna modul har utvecklats för att mäta definierade strukturer som nervceller, som består av dendriter, axoner och ryggar (trädliknande struktur). Denna modul genialt har använts för att göra morfologiska mätningar till icke-neuronala celler 3, men utdata ger information av en förlängd mobiltelefonnät genom att använda en programvara som är beroende av en definierad cellform snarare än en amorf formad cellulär modell. För att övervinna problemet att analysera amorf-formade celler och göra programvaran mer lämplig för en biologisk applikation, utvecklade Imaris Imaris Cell. Detta var ett vetenskapligt projekt med Eidgenössische Technische Hochschule, som har utvecklats för att beräkna förhållandet mellan celler och organeller. Medan mjukvaran möjliggör detektering av biologiska begränsningar, genom att tvinga en kärna per celloch använder cellmembran till segmentet celler, kan det inte användas för att analysera fluorescensdata som inte fortlöpande eftersom idealt det bygger cellytan utan tomrum. Såvitt vi vet, för närvarande inget användaren modifierbar automatiserad metod som ger morfometrisk information från 3D fluorescensbilder har utvecklats som uppnår cellulär geografisk information i en odefinierad form (figur 1).
Vi har utvecklat en analytisk plattform med Imaris modulen kärnan programvara och Imaris XT gränssnitt till MATLAB (Mat Works, Inc.). Dessa verktyg tillåter 3D-mätning av celler utan en fördefinierad form och med inkonsekventa fluorescens nätverkskomponenter. Dessutom kommer denna metod att forskare som har utökat kompetens inom biologiska system, men inte förtrogenhet med datortillämpningar, att utföra kvantifiering av morfologiska förändringar i celler dynamik.
Protocol
1. Tredimensionell Morfometrisk analys av Encelliga fenotypiska förändringar
- Humana embryonala njur-(HEK293)-celler transfekterades med hemagglutinin (HA)-märkta kortikotropinfrisättande faktor-receptor-2 (CRF-R2), beskrev en G-proteinkopplad receptor (GPCR) såsom tidigare 4, 5.
- Cellerna lämnades obehandlade (ingen behandling, NT), stimulerades med CRF-R2 endogen ligand, kortikotropinfrisättande faktor, CRF (1 pM, 30 min), eller förbehandlade med en selektiv CRF-R2-antagonist, anti-Sauvagine 30 (AS -30, 1 pM, 30 min) före agonistbehandling.
- Cellerna fixerades sedan, permeabiliserades och behandlades med anti-HA. CRF-R2 visualiserades med Alexa 594 nm konjugat-anti-mus (IgG 1) antikropp. DAPI användes för att visualisera scenen kärnorna mitotiska.
- För att begränsa försöksledaren subjektivitet, var experimentella förhållanden inte kända förrän efter bilderna förvärvades och analyserades.
- Vi förvärvade bilds från fixerade HEK293-celler med användning av en plan-apochromat 63x/1.4 olja DIC mål och Zeiss LSM 510 META konfokal-mikroskop anslutet till en Coherent integrerad tvåfotons lasersystem innefattande en Verdi-V5 laser och en Mira 900-F-lasersystem.
- Under datainsamling processen cellerna uppdelade både multispektral sektionering, 488 nm och 790 nm (~ 350 nm 2PH Ex.) Och z-uppdelning (0,5 pm steg) för att inkludera data från nukleära membranet till yttre extracellulära receptorn extremiteter.
- De fluorescensdata först bearbetas med hjälp Imaris, som gör det möjligt visualisering och segmentering av 3D mikroskopi datamängder, och en 3D-modell som består av kubiska voxlar skapades för morfometrisk analys.
Sedan blev Imaris XT-modul används för att gränssnittet Imaris med MATLAB datorprogram språk för att bestämma platsen koordinater GPCR förlängningar.
För att ta hänsyn cellulär variationer fick vi och analyseras fluorescens bilder taksv från 22 celler: ingen behandling (NT) (n = 7), agonist (CRF) behandling (n = 8) och förbehandling med antagonisten (AS-30) före agonistbehandling (n = 7) (Figur 2) .- Regionen av intresse (ROI) bör inkludera en cell som inte är i aktiv mitotiska stadiet och inte nära andra celler. På detta sätt kommer analysen innefatta celler med en enda kärna och förlängningarna receptor inte störs av närheten av andra celler.
- Det cellulära 3D-strukturen först rekonstrueras från multispektrala fluorescens data med hjälp av Imaris (v.7.1.1).
- Efter algoritmen designad av Imaris, var först ytrendering används för att representera den nukleära membranet. Imaris kommer att avgöra om det finns mer än en kärna i ROI.
- Sedan fläckar skapande algoritm användes för att lokalisera CRF-R2 förlängning. Fläckar upptäckt användes eftersom det kompenserar för bakgrundsljud och oregelbundna intensitetkomplext nätverk av amorft formade celler.
- För att maximera införandet av varje enhet av fluorescens detektion av CRF-R2, var fläckarna "diameter satt till 0,2 um, vilket är den minsta enheten i bilden för att extrapolera tydlig information i form av en uppmätt intensitet med en Gauss-filter. Spot filtrering införlivades i fläckar automatiskt skapande processen. Programvaran ger dock användaren flexibilitet att använda filter för att definiera parametrarna.
- För att undvika att data trunkering var datamängden konverteras från 8-bitars (unsigned) fast punkt, till 32-bitars decimal.
- De voxel intensiteter data utbyts att upptäcka koordinater data med Imaris XT-modul gränssnitt med MATLAB och den exakta rumsliga placeringen av varje fläck bestämdes genom att utföra en sträcka omvandling med det nukleära membranet som en referenspunkt (Figur 3).
- De resulterande data kan kvantifieras och presenteras i grafisk form för statistical analys. Jämförelser mellan grupperna utfördes med hjälp av två-vägs ANOVA och Bonferroni posttest. Data presenteras som medelvärde ± SD. Skillnader anses signifikanta vid * p <0,05. Beräkningar gjordes med GraphPad Prism 5,02 (Figur 4).
2. Representativa resultat
För att demonstrera effekten av vår strategi, kvantifierade vi de cellulära förändringar som resulterar från interaktionen av G-proteinkopplade receptorer (GPCR) och kortikotropinfrisättande faktor-receptor-2 (CRF-R2) med dess endogena ligand CRF i transfekterade HEK293-celler.
Vi visar att CRF-R2-receptorer är belägna i plasmamembranet och skjuter ut från ändliga områden av membranet av cellerna (Figur 2A och Film 1). Med konventionell 2D analys är det möjligt att detektera denna undergrupp av extracellulära CRF-R2-receptorer om vi analyserar po-receptorn vidhäftningenInts på glaset täcker. Därför förlorar vi all annan information från z staplade-multispektrala data (Figur 5).
När cellerna behandlas med CRF, de extracellulära receptorer kraftigt reducerad, vilket visas genom minskningen i avstånd av fläckarna från plasmamembranet. De är också omfördelas från primärt finita ställen i ett antal diskreta platser (figur 2B och Film 2).
Effekten av CRF på receptormembranet fördelning förhindras genom förbehandling med CRF-R2 specifik antagonist, antisavagine 30 (AS-30) och vi finner att CRF-R2 förlängningar inte ändrar (Figur 2C och Movie 3).
Den distala fördelning av fläckar, ritas i 5 pm kodade spektrum-färg intervall används för att visualisera avståndet mellan voxlar från det nukleära membranet. Ingen behandling och antagonist pretreatment (AS-30, 1 pM, 30 min) före agonistbehandling (CRF, 1 pM, 30 min) visar ingen signifikant (NS) skillnad i GPCR-kontraktion. Behandling av cellerna med agonisten (CRF, 1 pM, 30 min) minskar progressivt antalet CRF-R2-haltiga voxlar jämfört med ingen behandling, 0-5 um (ns), 6-15 ^ m (** p < 0,01) och> 15 pm (*** p <0,005), eller jämfört med AS-30 behandling, 0-10 um (ns), 11-15 um (** p <0,01) och> 15 pm (*** p <0,005) (Figur 4).
Figur 1. Diagram över de nuvarande tillgängliga teknik och deras begränsning för att analysera fluorescensbilder. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. 3D-modell av HEK293 transfekterade celler med HA-CRF-R2 rekonstrueras från CLS bilder med hjälp av Imaris programvara. Yta rendering av kärnan och fläckar skapande beskriver GPCR förlängningar omvandlas till små blåsor. De fluorescensdata först behandlas med Imaris som tillåter visualisering och segmentering av 3D mikroskopi datamängd. Sedan blev Imaris XT används för att gränssnittet Imaris med MATLAB. De voxel intensiteter byttes inplats koordinater. Fläckarna spektrum-kodad färg (blå 0-5 pm, grön, 6-10 pm, gul 11-15 um och röda> 15 pm) representerar avstånd formuläret nukleära membranet. Skala 5 um.
Figur 4. Grafisk representation av distala fördelning av punkter ritas i spektrum-färgkodade i 5 pm intervaller används för att visualisera avståndet av voxlar från det nukleära membranet. Ingen behandling och förbehandling med en antagonist (AS-30, 1 pM, 30 min) före agonistbehandling (CRF, 1 pM, 30 min) visar ingen signifikant (NS) skillnad i GPCR-kontraktion. Behandling av cellerna med agonist (CRF, 1 pM, 30 min) minskar progressivt avståndet av antalet CRF-R2-haltiga voxlar jämfört med ingen behandling 0-5 fim (ns), 6-15 ^ m (** p <0,01) och> 15 m (*** p <0,005), eller AS-30 behandling 0-10 nm (NS), 11-15 im (** p <0,01) och> 15 pm (*** p <0,005).
Figur 5. Begränsning av 2D morfometrisk analys av HEK 293-celler transfekterade med HA-CRF-R2. Mittplanet sektionen av celler (3-4μm ovanför täckglas) visar centrum kärnorna visualiseras med DAPI och HA-CRF-R2 sonderades med användning av anti-HA och visualiserades med användning av Alexa 488 nm-konjugerat anti-mus (IgG 1) sekundär antikropp och förvärvade med CLS visar ingen skillnad mellan (A) ingen behandling (NT) och (B)-agonist (CRF, 1 M, 30 min), medan receptor vidhäftning punkter dramatiskt annorlunda.
Film 1. Fritt roterande 3D-modell i "Överträffa" läge för HEK 293 transfekterade celler med HA-CRF-R2, ingen behandling, för att utvärdera cellulär fenotyp skillnader mellan receptorproteiner. Skalstock 5 till 20 | im./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "target =" _blank "> Klicka här för att se filmen.
Film 2. Fritt roterande 3D-modell i "Överträffa" läge av HEK 293-celler transfekterade med HA-CRF-R2, agonister, till CRF (CRF, 1 pM, 30 min) utvärdera cellulära fenotyp skillnader mellan receptorproteiner. Skala bar 5 till 20 nm. Klicka här för att se filmen.
Film 3. Fritt roterande 3D i "Överträffa" läge av HEK 293-celler transfekterade med HA-CRF-R2, förbehandling med en antagonist (AS-30, 1 pM, 30 min) före agonistbehandling CRF (, 1 ^ M, 30 min ) för att utvärdera cellulära fenotyp skillnader mellan receptorproteiner. Skala bar 5 till 20 nm. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi visade att CRF behandling inducerade en signifikant förändring i morfologi och lokalisering av CRF-R2. Förändringen i CRF-R2 inhiberades genom selektiv antagonist behandling. Vi visade att receptor ändringar inte upptäcktes och kan inte mätas med de vanliga 2D multispektrala tekniker. Förmågan att studera komplexa 3D-bilder är avgörande att införliva komplicerade biologiska parametrar för morfometrisk analys. Vi skulle kunna göra 3D mätningar av celler utan en fördefinierad form med inkonsekventa fluorescens nätverkskomponenter. Vår svit av användaren modifierbara automatiserade metoder gör att vi kan kvantifiera molekylära dynamiken i individuella amorfa-formade celler i deras miljö för att extrahera information om cell dynamik. Detta verktyg kan hjälpa till att göra förutsägelser om effekterna av en farmakologisk förening på cellulära vägar och cellulär morfologi förändring i närvaro av inhibitorer och informera om cellöverlevnad.
Fördelen med vår 3D kvantifiering metod är att den tillåter forskare med omfattande expertis inom biologi mekanismer, men inte känner till datorprogram, tekniker gränssnitt mikroskopi med datorprogram. Vi gjorde encelliga mätningar för att avslöja information som återspeglar en population av celler 6. Encelliga mätning ger oss en analys av en komplex formad cell oberörd av närhet med andra celler. Denna metod kommer att hjälpa forskare i att undersöka förändringar i cellernas form och placeringen av membranbundna proteiner efter kemisk stimualtion 7, 8. Analysen av en cell bör innehålla data från de cellulära inre kärnan fack till dess extracellulära extremiteter. Den maximala uppgifter inkludering som kan erhållas från en 2D-bild är över mittplanet av en cell, men är kärnan och den yttersta platsen för plasmamembranet placerad på olika z-plan; 2D visualisering trunkerarbild. Eftersom kärnan är belägen mellan 3 och 4 pm ovanför de cellulära adhesions punkter, som är belägna på täckglas, är en utökad mängd data förloras. Denna receptor rumsliga omorganisation kan endast ses i 3D-bilder, och kan inte kvantifieras utan analysen. Detta verktyg ger en ny metod för att visualisera och mäta cellförändringar som inte upptäcks med traditionella 2D analytiska tekniker och ge information som behandlar cellulära systemet som helhet i stället för splittrad av 2D-data. Detta sätt att mäta enskilda celler tillsammans med andra beskrivna tekniker 9, tillåter oss att undersöka komplexiteten av cellulära dynamik och grunden för cellulära plasticitet.
Denna metod är inte begränsad till Imaris och kan tillämpas på alla uppgifter visualiseringsprogram gränssnitt med datorer språk programvara. Framtida förbättringar av systemet kommer att omfatta morfometrisk analys av 3D celler tas från levandeceller att möjliggöra undersökning av hela cellen i sitt naturliga tillstånd utan kemisk fixering eller kemisk färgning. Förvärva bilder av levande celler kommer också att eliminera intercellulära variabilitet, eftersom vi kan kvantifiera fenotypiska mätningar i samma cell över tiden.
Vi tror att vår plattform teknik med dess potential att mäta strukturer ospecificerade formade-celler, hjälper andra forskare att fylla en lucka i tekniker kvantifiering avbildning. Denna nya metod är tillämplig på karakterisering av ett flertal encelliga fenotypiska förändringar, vilket gör denna cell-baserad analys, som andra encelliga profilering 10, ytterligare ett verktyg för testning av läkemedel. Eftersom cellmorfologi har redan använts i high-throughput screening för att identifiera små molekylinhibitorer 11, eftersom denna plattform utvecklas, förväntar vi denna metod att vara användbara för bestämning av en dos-responskurva från enstaka celler som påverkar samma farmakologisktcal mål men med olika verkningsmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar biologisk avbildning Development Center (BIDC) University of California, San Francisco för användning av Imaris, Imaris XT och Matlab. Vi tackar V. Kharazia för tekniskt bistånd och på Henry, LK Floren, L. Daitch för deras bidrag till redigering av manuskriptet. Detta arbete stöddes av medel från staten Kalifornien medicinsk forskning på alkohol och missbruk genom UCSF till SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 och NIH Fast Track utmärkelse att screena MLSMR samlingen till SEB, UCSF School of Pharmacy ( Dean kansli och klinisk farmaci) och School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) i CLHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
