Summary
我们开发了一个软件平台，利用神经科学，ImarisXT和MATLAB Imaris未定义形状的三维共聚焦荧光的单细胞形态的变化来衡量。这种新方法可以用来量化受体激活后，细胞形状的变化，因此，为药物发现代表一个可能的额外的工具。
Abstract
最常见的软件分析工具，可用于测量荧光图像的二维（2D）数据的纳入和排除的数据点，和计算机辅助模式识别的分析结果的解释和支持，依靠手动设置。它已成为日益重要的是能够测量从三维（3D）数据集构成的荧光图像，以便能够捕捉的复杂性的细胞动力学和理解的基础上的细胞在生物系统内的可塑性。多光谱荧光图像和强大的分析软件重建的共聚焦图像的堆栈，然后收集到的二维图像的三维表示，通过收购，允许复杂的显微镜工具的可视化三维荧光图像。先进的设计为基础的体视学方法已经由近似和假设的origina基于L型体视学1，即使在复杂的组织切片2。在显微镜尽管有这些科学的进步，仍需要一个自动化的分析方法，充分利用了固有的三维数据，以便分析和定量分析的复杂变化细胞形态，蛋白定位和受体贩运。
目前的技术可量化的荧光图像变形元（分子器件，桑尼维尔，CA）和图像J（NIH）提供人工分析。 Imaris（安道尔技术，贝尔法斯特，北爱尔兰）软件提供了的功能MeasurementPro，可以手动创建的测量点可以被放置在一个体积图像或一系列二维切片创建一个三维对象上绘制。此单击单点测量，测量的线的两个对象之间的距离，或创建一个多边形包围的感兴趣区域的方法是有用的，但它是难以适用于并发症前蜂窝网络结构。灯丝示踪（安道尔）允许自动长丝般然而，此模块已经发展到测量定义的结构，如神经元，该神经元树突，轴突和棘（类似树的结构）是由神经元的三维检测。此模块已巧妙地利用，使形态测量非神经元细胞3，然而，输出数据的一个扩展的蜂窝网络提供的信息，通过使用定义的细胞的形状，而不是作为非晶形的细胞模型依赖于一个软件，。为了克服这个问题的分析非晶形细胞，使软件更适合的生物应用，，Imaris开发Imaris细胞。这是一个科学项目与EidgenössischeTECHNISCHE Hochschule的，已经发展到细胞和细胞之间的关系计算。虽然该软件可以检测的生物制约，迫使每一个核细胞使用到段细胞的细胞膜上，它可以不被用来分析的荧光数据是不连续的，因为理想地建立细胞表面无空隙空间。据我们所知，目前还没有用户可修改的形态测量信息的自动化解决方案，可提供三维荧光图像已被开发，可实现细胞的空间信息未定义的形状（ 图1）。
我们已经开发了一个分析平台采用的Imaris核心软件模块和Imaris XT连接到MATLAB（垫厂，公司）。这些工具允许细胞的三维测量的，没有一个预定义的形状，和不一致的荧光的网络组件。此外，这种方法将允许研究人员已扩大在生物系统的专业知识，但不熟悉计算机应用，细胞动力学的形态变化进行量化。
Protocol
1。三维形态分析单细胞的表型变化
- 转染的人类胚胎肾（HEK293）细胞与血凝素（HA）的标签的促肾上腺皮质激素释放因子受体-2（CRF-R 2），G蛋白偶联受体（GPCR），前面描述的4，5。
- 被留下细胞未经处理的（无处理，NT），CRF-R2的内源性配体，促肾上腺皮质激素释放因子，慢性肾功能衰竭（1μM，30分钟），或预处理CRF-R2的选择性拮抗剂，抗-SAUVAGINE 30（AS刺激-30，1μM，30分钟）激动剂治疗之前。
- 然后将细胞固定，透化和用抗-HA。 CRF-R2采用Alexa的594 nm的共轭反鼠抗体（IgG抗体）。 DAPI用于可视化的细胞核的有丝分裂阶段。
- 要限制实验者主观性，直到后的图像进行采集和分析的实验条件下，不知道。
- 我们获取的图像从固定的HEK293细胞使用计划“复消色差透镜63x/1.4油DIC的目标和连接到相干集成双光子激光系统包括一个威尔第-V5激光和米拉900-F激光系统蔡司LSM 510 META共聚焦显微镜。
- 在数据采集过程中，将细胞条块由多光谱切片，488纳米和790纳米（〜350 nm的2PH实施例）和z-分区（0.5μm的增量），以包括数据从核膜的外细胞外受体四肢。
- 的荧光数据的第一被处理使用Imaris，它允许三维显微镜的可视化和分割数据集，和立方体素组成一个三维模型创建的形态学分析。
然后，Imaris XT模块接口Imaris利用MATLAB计算机程序语言，以确定该点的坐标的G蛋白偶联受体扩展。
要考虑到帐户细胞变异，我们得到的荧光图像分析德EN 22细胞：没有治疗（NT）组（n = 7），激动剂（CRF）治疗组（n = 8）和预处理拮抗剂（AS-30）之前激动剂治疗组（n = 7）（ 图2） 。- 感兴趣区域（ROI）应该包括一个电池，它是不活跃的有丝分裂阶段，而不是到其他细胞。以这种方式，分析将包括只有一个核和受体扩展的细胞与未扰动由相邻的其他细胞。
- 细胞的三维结构重建多光谱荧光数据，用Imaris（v.7.1.1）。
- 继Imaris设计的算法，第一表面渲染被用来代表核膜。 imaris将确定是否有多于一种的原子核中的ROI。
- 然后点创建算法，利用定位CRF-R2扩展的。利用点检测，因为它可以补偿背景噪声和不规则的强度非晶形细胞的复杂网络。
- 为了最大限度地提高列入CRF-R 2的每个单元的荧光检测，斑点的直径被设定为0.2微米，这是最小的单元，在图像内的不同的信息的形式使用的高斯滤波器的测量强度推断。现货过滤成立于点自动创建过程。 ，但是，该软件使用户可以灵活使用过滤器来定义的参数。
- 为了避免数据被截断，数据集被转换8位（无符号）固定点，32位小数。
- 体素的强度数据被交换，以发现使用Imaris XT模块用MATLAB接口和每个点的确切的空间位置的坐标数据，被确定作为一个参考点（ 图3）执行的距离变换使用核膜。
- 由此产生的数据可以量化，并以图形格式为statistical分析。组间比较采用双向方差分析和Bonferroni后测。数据以平均值±标准差。 * P <0.05，差异被认为是显着的。 GraphPad棱镜5.02（ 图4）进行了计算。
2。代表性的成果
为了证明我们的方法的功率，我们量化的细胞变化，从G蛋白偶联型受体（GPCR），促肾上腺皮质激素释放因子受体2（CRF-R 2），而其内源性配体在转染的HEK293细胞的慢性肾功能衰竭的相互作用的结果。
我们表明，CRF-R2受体位于从有限区域的膜的细胞（ 图2A和电影1）在质膜和项目。使用传统的二维分析，也能够检测到这个子集外的CRF-R2受体只有当我们分析受体粘附婆int型的玻璃覆盖。因此，我们失去任何其他的信息来自Z-堆叠的多光谱数据（ 图5）。
治疗慢性肾功能衰竭，当细胞的胞外受体被大大降低，如所示的斑点从质膜的距离的减少。他们也从主要有限的位置重新分配到一个数量的离散的位置（ 图2B和电影2）。
CRF受体膜分布的影响，防止预处理与CRF-R2的特定受体拮抗剂，antisavagine 30（AS-30），我们发现，CRF-R2扩展的不改变（ 图2C和电影3）。
斑点的前端分布，绘制在5微米的频谱颜色编码的时间间隔，利用可视化的体素之间的距离从核膜。无治疗和拮抗剂pretreatmENT（AS-30，1μM，30分钟）前（CRF受体激动剂治疗，1μM，30分钟），差异没有显着性差异（NS）在G蛋白偶联受体收缩。逐步激动剂（CRF，1μM，30分钟）处理的细胞与CRF-R 2含的体素的数量减少时相比，没有治疗，为6-15微米（0-5微米（纳秒），** P < 0.01）和>15μm的（*** P <0.005），或相比，AS-30的治疗，为11-15微米（0-10微米（纳秒），** P <0.01）和>15μm的（*** P <0.005）（ 图4）。
图1。目前可用的技术和荧光图像分析的限制。图点击此处查看大图 。
动画1。自由旋转的3D模型中的“超越”模式的HEK 293 HA-CRF-R2，没有治疗，转染细胞受体蛋白的细胞表型之间的差异进行评估。为5〜20微米的比例尺。/ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi“目标=”_blank“>点击这里观看电影。 电影2，可自由旋转的3D模型中的“超越”模式的HEK 293转染的细胞与HA-CRF-R2，激动剂治疗，慢性肾功能衰竭（CRF，1μM，30分钟），以评估受体蛋白质的细胞表型差异。比例尺为5至20微米。 点击这里观看电影。 电影3自由旋转的3D中的“超越”模式的HEK 293转染的细胞与HA-CRF-R2，激动剂治疗的拮抗剂（AS-30，1μM，30分钟）前的预处理（CRF，1μM，30分钟），以评估受体蛋白质的细胞表型差异。比例尺为5至20微米。 点击这里观看电影。 
图3 HA-CRF-R2 HEK293转染细胞的三维模型重建CLS使用Imaris软件。表面绘制的核心和描述转换成小泡的G蛋白偶联受体的扩展点创建。荧光数据处理的Imaris这使得3D显微镜数据集的可视化和细分化。然后，利用Imaris XT与MATLAB接口Imaris。兑换成体素强度点的坐标。斑点的频谱的编码的颜色（蓝色0-5微米，绿色，6-10微米，黄色11-15微米和红色> 15微米）代表的距离表格核膜。规模500微米。 
图4绘制的图形表示的前端的斑点分布在5微米的间隔的频谱颜色编码是利用从核膜的体素进行可视化的距离。拮抗剂（AS-30，1μM，30分钟）（CRF受体激动剂治疗前，1μM，30分钟）没有处理和预处理差异没有显着性差异（NS）在G蛋白偶联受体收缩。激动剂（CRF，1μM，30分钟）处理的细胞与逐步降低CRF-R 2含的体素的数目相比没有治疗0-5微米（ns）， 其中6-15微米（** P的距离<0.01），> 15微米（*** P <0.005）;或AS-30治疗0-10微米（NS），11-15微米（** P <0.01）和15微米（*** P <0.005）。 
图5。HEK 293转染细胞的HA-CRF-R2的的二维形态分析的限制。中平面部分的细胞（3-4μm的上方的玻璃盖玻片），示出了中心的细胞核用DAPI和HA-CRF-R2可视化探测使用抗-HA和可视化使用Alexa的488nm波长的共轭抗小鼠（IgG抗体1）二次抗体和收购CLS（A）不治疗（NT）和（B）的激动剂（慢性肾功能衰竭，1μM，30分钟）没有什么区别，而的受体粘合点是显着不同的。
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Discussion
我们发现，慢性肾功能衰竭治疗引起的形态和位置的CRF-R2的一个显着的变化。被抑制的选择性拮抗剂治疗CRF-R2的变化。我们表明，受体修改未检测到不能被测量，使用标准的2D多光谱技术。将复杂的生物参数形态分析研究复杂3D图像的能力是至关重要的。我们没有预先定义的形状不一致的荧光网络组件，能够使细胞的三维测量。我们的套件，用户可修改的自动化的方法，使我们能够量化的分子动力学模拟在他们的环境中的个人非晶形细胞，以提取细胞动力学的信息。这个工具可以帮助的药理活性的化合物对细胞途径和细胞形态的变化抑制剂的存在的影响作出预测，并提供有关细胞的存活。
我们的三维定量方法的优点是，它使研究人员在生物学机制具有丰富的专业知识，但不熟悉计算机代码，界面的显微技术与计算机应用。单细胞测定，以揭示的信息，反映了人口的细胞6。单细胞测量，为我们提供了一个分析泰然自若地接近与其他细胞的形状复杂的细胞。此方法将有助于科学家调查在细胞形状的变化和化学stimualtion 7，8后的膜结合蛋白的位置。一个细胞的分析应包括从蜂窝内芯车厢的其胞外四肢的数据。从2D图像，可以得到的最大的数据列入对面是一个单元格的中平面的，但是，细胞核与质膜的最外层的位置被定位在不同的z平面; 2D可视化截断图像。作为位于上述3和4之间的微米的细胞粘附点的玻璃盖玻片上，分别位于细胞核，一个扩展的数据量的丢失。本空间重组受体只能看到3D图像，并且不能未经分析进行定量。此工具提供了新的方法来可视化和测量细胞的变化，没有检测到使用传统的二维分析技术，提供信息，解决了蜂窝系统作为一个整体，而不是分散的2D数据。这种方法测量单细胞聚集在一起，与其他描述技术9，让我们调查的复杂性，细胞动力学和细胞可塑性的基础。
这个方法并不局限于Imaris，并可以应用到任何数据的可视化软件与计算语言软件接口。未来的改进系统将包括从生活的三维细胞形态分析细胞化学固定或化学染色的整个细胞在自然状态下，没有允许检查。获取活细胞图像也将消除细胞间的变化，因为我们可以在同一个细胞随着时间的推移量化表型的测量。
我们相信，我们的平台技术，其潜在的衡量未指定状细胞的结构，将帮助其他科学家在定量成像技术填补了一项空白。这种新方法是适用于许多单细胞的表型变化的表征，这种细胞为基础的检测，其他单细胞分析10，额外的工具，在药物发现过程。由于细胞的形态已经被应用在高通量筛选确定的小分子抑制剂11日 ，随着这个平台的发展，我们希望这种方法是有用的确定剂量反应曲线，影响相同pharmacologi的单细胞CAL目标，但不同的作用机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢生物成像技术发展中心（BIDC）美国加州大学，旧金山Imaris，Imaris XT和Matlab使用。我们提供的技术援助和亨利，LK弗洛伦所作出的贡献的手稿的编辑，L. Daitch感谢Kharazia五。这项工作是由从加利福尼亚州医学研究的加州大学旧金山分校的酒精和药物滥用通过SEB，美国国立卫生研究院的资助：1R21DA029966-01和美国国立卫生研究院快速轨道奖励，到筛选的MLSMR，收集到SEB，加州大学旧金山分校药学院（院长办公室和临床药学）和医学院（临床药理学和实验疗法）CLHK。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
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