Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Et analyseværktøj, der kvantificerer cellemorfologi Ændringer fra Tredimensionelle fluorescensbilleder

Published: August 31, 2012 doi: 10.3791/4233

Summary

Vi udviklede en software platform, der anvender Imaris Neuroscience, ImarisXT og MATLAB til at måle ændringerne i morfologi af en udefineret form, taget fra tredimensionel konfokal fluorescens af enkeltceller. Denne hidtil ukendte fremgangsmåde kan anvendes til at kvantificere ændringer i celleform efter receptoraktivering og derfor repræsenterer en mulig yderligere værktøj til opdagelse af lægemidler.

Abstract

De mest almindelige software analyseværktøjer til rådighed til måling af fluorescens billeder er for to-dimensionelle (2D) data, der er afhængige af manuelle indstillinger for inklusion og eksklusion af datapunkter, og computerstøttet mønstergenkendelse til at understøtte fortolkningen og resultater af analysen. Det er blevet stadig vigtigere at kunne måle fluorescensbilleder opbygget af tredimensionale (3D) datasæt, for at kunne opfange de komplekse cellulære dynamik og forstå grundlaget for cellulære plasticitet i biologiske systemer. Sofistikerede mikroskopi instrumenter har gjort det muligt at visualisering af 3D fluorescensbilleder gennem erhvervelsen af ​​multispektrale fluorescens billeder og kraftfuld analytisk software, der rekonstruerer billederne fra konfokale stakke, der så giver en 3D-repræsentation af de indsamlede 2D-billeder. Avancerede design-baserede stereologi metoder har udviklet sig fra den tilnærmelse og antagelser af original modelbaseret stereologi 1 selv i komplekse vævssektioner 2. På trods af disse videnskabelige fremskridt inden for mikroskopi, er fortsat et behov for en automatiseret analytisk metode, der fuldt ud udnytter de iboende 3D-data for at muliggøre analyse og kvantificering af de komplekse ændringer i cellemorfologi, protein lokalisering og receptor menneskehandel.

Nuværende teknikker til rådighed til at kvantificere fluorescensbilleder inkluderer Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), og Image J (NIH), som giver manuel analyse. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nordirland) software giver funktionen MeasurementPro, som giver den manuelle skabelse af målepunkter, der kan placeres i et volumen billede eller trukket på en række 2D skiver til at skabe et 3D-objekt. Denne metode er nyttig for enkelt-klik punktmålinger at måle en linie afstand mellem to objekter eller at oprette en polygon, som omslutter et område af interesse, men det er vanskeligt at anvende på complex mobilnetværk strukturer. Filament Tracer (Andor) muliggør automatisk registrering af 3D neuronal filamentlignende dog har dette modul er udviklet til måling af definerede strukturer, såsom neuroner, som består af dendritter, axoner og rygsøjle (trælignende struktur). Dette modul er sindrigt anvendt til at udføre morfologiske målinger til ikke-neuronale celler 3, dog udlæsningsdataene giver oplysninger om en udvidet mobilnetværk ved hjælp af en software, der afhænger af en defineret celleform snarere end en amorf-formet cellulær model. For at overvinde problemet med at analysere amorfe-formede celler og gør softwaren mere egnet til en biologisk applikation, Imaris udviklet Imaris Cell. Dette var et videnskabeligt projekt med Eidgenoessische Technische Hochschule, der er udviklet til at beregne forholdet mellem celler og organeller. Mens software muliggør påvisning af biologiske begrænsninger, ved at tvinge en kerne per celleog anvendelse af cellemembraner at segmentere celler, kan det ikke anvendes til at analysere fluorescensdata, der ikke er kontinuerlig eftersom ideelt set det bygger celleoverfladen uden hulrum. Til vores viden, ingen bruger-modificerbare automatiseret metode, der giver morfometrisk oplysninger fra 3D fluorescensbilleder på nuværende tidspunkt er blevet udviklet, som opnår cellulær geografisk information af en udefineret form (figur 1).

Vi har udviklet en analytisk platform ved hjælp af Imaris kernesoftware modul og Imaris XT grænseflader til MATLAB (Mat Works, Inc.). Disse værktøjer giver 3D måling af celler uden en forud fastsat form og med inkonsekvente fluorescens netværkskomponenter. Endvidere vil denne metode give forskere, der har udvidet ekspertise i biologiske systemer, men ikke kendskab til edb-applikationer, til at udføre kvantificering af morfologiske ændringer i celle dynamik.

Protocol

1. Tredimensionale Morfometrisk analyse af enkeltcelle-fænotypiske ændringer

  1. Human embryonisk nyre (HEK293) celler blev transficeret med hemagglutinin (HA)-tagget corticotropinfrigivende faktor-receptor-2 (CRF-R2), en G-proteinkoblet receptor (GPCR) som beskrevet tidligere 4, 5.
  2. Cellerne forblev ubehandlede (ingen behandling, NT), stimuleret med CRF-R2 endogen ligand, corticotropinfrigivende faktor, CRF (1 uM, 30 min), eller forbehandlet med en selektiv CRF-R2 antagonist, anti-Sauvagin 30 (AS -30, 1 uM, 30 minutter) inden agonistterapi.
  3. Cellerne blev derefter fikseret, permeabiliseret og behandlet med anti-HA. CRF-R2 blev visualiseret under anvendelse Alexa 594 nm konjugat anti-mus (IgG 1) antistof. DAPI blev anvendt til at visualisere kernerne mitotiske fase.
  4. For at begrænse eksperimentatoren subjektivitet blev de eksperimentelle betingelser ikke kendt før efter billederne blev erhvervet og analyseret.
  5. Vi erhvervede billedes fra faste HEK293-celler under anvendelse af en plan-apochromat 63x/1.4 olie DIC objektiv og Zeiss LSM 510 META konfokalt mikroskop forbundet til en sammenhængende, integreret to-foton laser system bestående af en Verdi-V5 laser og en Mira 900-F lasersystem.
  6. Under dataopsamling processen blev cellerne opdelte både ved multispektral sektionering, 488 nm og 790 nm (~ 350 nm 2PH Ex.) Og z-opdeling (0,5 pm trin) for at medtage data fra kernemembranen til den ydre ekstracellulære receptor ekstremiteter.
  7. De fluorescensdata blev først behandles ved hjælp Imaris, som tillader visualisering og segmentering af 3D mikroskopi datasæt, og en 3D-model bestående af kubiske voxels blev skabt for morfometrisk analyse.
    Derefter blev Imaris XT modul anvendes til grænseflade Imaris med MATLAB computerprogrammet sprog at bestemme det sted koordinater for GPCR extensions.
    At tage hensyn til cellulær variabilitet, vi indhentet og analyseret fluorescens billeder taken fra 22-celler: ingen behandling (NT) (n = 7), agonist (CRF) behandling (n = 8) og forbehandling med antagonist (AS-30) inden agonistterapi (n = 7) (fig. 2) .
    1. Regionen of Interest (ROI) bør omfatte en celle, der ikke er i aktiv mitotisk scenen og ikke tæt på andre celler. På denne måde vil analysen omfatter celler med kun en kerne og receptoren forlængelser ikke forstyrres af afstanden til andre celler.
    2. Den cellulære 3D-struktur blev først rekonstrueret fra multispektrale fluorescensdata hjælp Imaris (v.7.1.1).
    3. Efter algoritme designet af Imaris, blev først overfladegengivelse anvendes til at repræsentere kernemembranen. Imaris vil afgøre, om der er mere end én kerne i ROI.
    4. Så spots-creation algoritme blev anvendt til at lokalisere den CRF-R2 forlængelse. Spots detektion blev udnyttet, fordi den kompenserer for baggrundsstøj og uregelmæssig intensitetkomplekst netværk af amorf-formede celler.
    5. At maksimere optagelsen af ​​hver enhed af fluorescensdetektion af CRF-R2, blev de spots 'diameter indstillet til 0,2 um, som er den mindste enhed i billedet for at ekstrapolere forskellig information i form af et målte intensitet med et gaussisk filter. Spot filtrering blev stiftet i spots automatiseret skabelsesprocessen. The software imidlertid giver brugeren mulighed for at bruge filtre til at definere parametrene.
    6. For at undgå data trunkering blev datasættet konverteret fra 8-bit (unsigned) fast punkt, til 32-bit decimal.
    7. De voxel intensiteter blev udvekslet at spotte koordinater data ved hjælp af Imaris XT module interface med MATLAB og den nøjagtige rumlige placering af hver plet blev bestemt ved at udføre en afstand transformation under anvendelse af kernemembranen som reference (fig. 3).
  8. De resulterende data kan kvantificeres og præsenteres i grafisk format, sTATISTISK analyse. Sammenligninger mellem grupperne blev udført ved hjælp af to-vejs ANOVA og Bonferroni posttest. Data er præsenteret som middelværdi ± SD. Forskelle anses for signifikante ved * p <0,05. Beregninger blev foretaget med GraphPad Prism 5,02 (figur 4).

2. Repræsentative resultater

For at demonstrere kraften i vores fremgangsmåde, at vi kvantificeret de cellulære ændringer, som resulterer fra interaktionen af ​​G-proteinkoblede receptorer (GPCR'er) og corticotropinfrigivende faktor-receptor-2 (CRF-R2) med sin endogene ligand CRF i transficerede HEK293-celler.

Vi viser, at CRF-R2 receptorer er lokaliseret i plasmamembranen og rager frem fra endelige områder af membranen af celler (figur 2A og Movie 1). Anvendelse af konventionel 2D analyse er det muligt at detektere denne delmængde af ekstracellulære CRF-R2-receptorer, hvis vi analyserer receptor adhæsion point'er på glasset dækker. Derfor taber vi andre oplysninger stammer fra z-stablede multispektrale data (figur 5).

Når celler behandles med CRF, er de ekstracellulære receptorer stærkt reduceret, som vist ved faldet i afstanden af ​​pletterne fra plasmamembranen. De er også omfordeles fra primært begrænsede steder i et antal diskrete steder (fig. 2B og Movie 2).

Virkningen af CRF på receptor membran fordeling forhindres ved forbehandling med den CRF-R2 specifik antagonist, antisavagine 30 (AS-30) og vi finder, at CRF-R2 forlængelser ikke ændrer (figur 2C og Movie 3).

Den distale fordeling af pletter, afbildet i 5 um-spektrum-farvekodede intervaller, anvendes til at visualisere afstanden mellem voxels fra kernemembranen. Ingen behandling og antagonist pretreatment (AS-30, 1 uM, 30 minutter) før agonistterapi (CRF, 1 uM, 30 minutter) viser ingen signifikant (NS) forskel i GPCR kontraktion. Behandling af cellerne med agonisten (CRF, 1 uM, 30 minutter) progressivt reducerer antallet af CRF-R2-holdige voxels i sammenligning med ingen behandling, 0-5 um (ns), 6-15 um (** p < 0,01) og> 15 um (*** p <0,005) eller i forhold til AS-30 behandling, 0-10 um (ns), 11-15 um (** p <0,01) og> 15 um (*** p <0,005) (fig. 4).

Figur 1
Figur 1. Diagram af de nuværende tilgængelige teknik og deres begrænsning til at analysere fluorescensbilleder. Klik her for at se større figur .

Figur 2
1) sekundært antistof, DAPI blev anvendt til at visualisere cellekerner. Billederne blev erhvervet med konfokal laser scanning (CLS) mikroskop. Scale bar 5 um.

Figur 3
Figur 3. 3D-model af HEK293 transficerede celler med HA-CRF-R2 rekonstrueret fra CLS billeder med Imaris software. Overfladegengivelse af kernen og spots skabelse beskriver GPCR extensions konverteret til små blærer. De fluorescensdata blev først behandles ved hjælp Imaris der tillader visualisering og segmentering af 3D mikroskopi datasæt. Derefter blev Imaris XT anvendt til grænseflade Imaris med MATLAB. De voxel intensiteter blev udvekslet istedet koordinater. Pletterne spektrum-kodet farve (blå 0-5 um, grøn, 6-10 um, gul 11-15 um og røde> 15 um) at repræsentere afstand form kernemembranen. Scale 5 um.

Figur 4
Fig. 4. Grafisk gengivelse af den distale fordeling af pletter afbildet i spektret-farvekodet i 5 um intervaller anvendes til at visualisere afstanden mellem voxels fra kernemembranen. Ingen behandling og forbehandling med en antagonist (AS-30, 1 uM, 30 minutter) før agonistterapi (CRF, 1 uM, 30 minutter) viser ingen signifikant (NS) forskel i GPCR kontraktion. Behandling af cellerne med agonist (CRF, 1 uM, 30 minutter) progressivt reducerer afstanden af antallet af CRF-R2-holdige voxels i sammenligning med ingen behandling 0-5 um (ns), 6-15 um (** p <0,01) og> 15 um (*** p <0,005), eller AS-30 behandling 0-10 um (ns), 11-15 um (** p <0,01) og> 15 um (*** p <0,005).

Figur 5
Figur 5. Begrænsning af 2D morfometrisk analyse af HEK 293-celler med HA-CRF-R2. Midterplanet del af cellerne (3-4μm over dækglas) angiver midten af kernerne visualiseret med DAPI og HA-CRF-R2 probet med anti-HA og visualiseret ved hjælp Alexa 488 nm konjugeret anti-mus (IgG 1) sekundær antistof og erhvervet hos CLS viser ingen forskel mellem (A) ingen behandling (NT) og (B) agonist (CRF, 1 uM, 30 minutter), mens receptor berøringspunkter er dramatisk anderledes.

Movie 1. Frit roterende 3D-model i "overgå" tilstand af HEK 293-celler med HA-CRF-R2, ingen behandling, at vurdere cellefænotype forskelle receptorproteiner. Scale bar 5-20 um./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "target =" _blank "> Klik her for at se film.

Movie 2. Frit roterende 3D-model i "overgå" tilstand af HEK 293-celler med HA-CRF-R2, agonister, til CRF (CRF, 1 uM, 30 min) at evaluere cellefænotype forskelle receptorproteiner. Scale bar 5 til 20 um. Klik her for at se film.

Film 3. Frit roterende 3D ​​i "overgå" tilstand af HEK 293-celler med HA-CRF-R2, forbehandling med en antagonist (AS-30, 1 uM, 30 minutter) før agonistterapi (CRF, 1 uM, 30 min ) for at evaluere cellefænotype forskelle receptorproteiner. Scale bar 5 til 20 um. Klik her for at se film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi viste, at CRF behandling inducerede en signifikant ændring i morfologi og placering af CRF-R2. Ændringen i CRF-R2 blev inhiberet ved selektiv antagonist behandling. Vi viste, at receptor ændringer ikke blev opdaget og ikke kan måles ved hjælp af de almindelige 2D multispektrale teknikker. Evnen til at undersøge komplekse 3D-billeder er kritisk at inkorporere de komplekse biologiske parametre for morfometrisk analyse. Vi var i stand til at gøre 3D målinger af celler uden en foruddefineret form med uoverensstemmende fluorescens netværkskomponenter. Vores suite af bruger-modificerbare automatiserede metoder gør os i stand til at kvantificere molekyldynamik i individuelle amorf-formede celler i deres miljø for at trække oplysninger om celle dynamik. Dette værktøj kan hjælpe til at gøre forudsigelser om virkningerne af en farmakologisk forbindelse på cellulære veje og cellemorfologi prisændringer i nærvær af inhibitorer og give oplysninger om celleoverlevelse.

Fordelen ved vores 3D kvantificering metode er, at det giver forskerne med omfattende ekspertise inden for biologi mekanismer, men ikke er fortrolige med edb-kode, til grænseflade mikroskopi teknikker med edb-applikationer. Vi gjorde encellede målinger for at afsløre information, der afspejler en population af celler 6. Single-cell måling giver os en analyse af et komplekst formet celle uanfægtet af nærhed med andre celler. Denne metode vil hjælpe forskerne med hensyn til efterforskning ændringer i celleform og placeringen af membranbundne proteiner efter kemisk stimualtion 7, 8. Analysen af ​​en celle bør omfatte data fra de cellulære indre kerne rum til dens ekstracellulære ekstremiteter. Den maksimale data optagelse, som kan opnås fra et 2D billede på tværs af midterplanet af en celle, men er kernen og det yderste placering af plasmamembranen placeret på forskellige z-planer, 2D visualisering afkorterbillede. Som kernen ligger mellem 3 og 4 um over de cellulære adhæsions punkter, som er placeret på dækglas, er en udvidet mængde data tabt. Denne receptor rumlig reorganisering kan kun ses i 3D-billeder, og er ikke i stand til at kvantificere uden analysen. Dette værktøj giver en ny tilgang til at visualisere og måle celleforandringer, der ikke påvises ved hjælp af traditionelle 2D analytiske teknikker, som giver information, som takler det cellulære system som helhed i stedet for fragmenteret af 2D data. Denne fremgangsmåde til måling af enkelte celler sammen med andre beskrevne teknologier 9, gør det muligt at undersøge komplekse cellulære dynamik og ud fra cellulære plasticitet.

Denne metode er ikke begrænset til Imaris og kan anvendes til alle data visualisering software interfaces med computing sprog software. Fremtidige forbedringer af systemet vil omfatte morfometrisk analyse af 3D celler taget fra levendeceller til at tillade en undersøgelse af hele cellen i sin naturlige tilstand uden kemisk fiksering eller kemisk farvning. Erhvervelse billeder af levende celler vil også fjerne intercellular variabilitet, da vi kan kvantificere fænotypiske målinger i den samme celle over tid.

Vi mener, at vores platform-teknologi, med dens potentiale til at måle strukturer af uspecificerede formet-celler, vil hjælpe andre forskere til at udfylde et hul i kvantificering billeddannelse teknikker. Denne nye fremgangsmåde er anvendelig til karakterisering af talrige encellede fænotypiske ændringer, hvilket gør denne celle-baserede assay, som andre encellede profilering 10, et supplerende værktøj for drug discovery processen. Da cellemorfologi allerede er blevet anvendt i high-throughput screening til identifikation af inhibitorer med små molekyler 11, som denne platform udvikler sig, forventer vi denne metode at være nyttige til bestemmelse af en dosis-respons-kurve fra enkelte celler, der påvirker den samme farmacal målet, men med forskellige virkningsmekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi takker Biologisk Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco for brugen af ​​Imaris, Imaris XT og Matlab. Vi takker V. Kharazia til teknisk assistance og AT Henry, LK Floren, L. Daitch for deres bidrag til redigering af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af midler fra staten Californien Medical Research on Alcohol & Substance Abuse gennem UCSF til SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 og NIH Fast Track pris at screene MLSMR indsamling til SEB, UCSF School of Pharmacy ( dekanatet og Klinisk Farmaci) og School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) til CLHK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Embryonic Kidney (HEK293) American Type Culture Collection CRL-1573
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Invitrogen 11965118
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen SH30070.03
AlexaFluor-488 (IgG2b) Invitrogen A-11001
monoclonal anti-HA.11 (IgG1) Covance 16B12
DAPI Vector Laboratories H-1200
CRF Sigma C2917
Antisauvagine-30 (AS-30) Sigma A4727

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
  2. Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
  3. Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
  4. Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
  5. Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
  6. Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
  7. Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
  8. Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
  9. Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
  10. Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
  11. Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).

Tags

Cellular Biology 3-dimensionelle mikroskopi kvantificering morfometriske encellede celle dynamik
Et analyseværktøj, der kvantificerer cellemorfologi Ændringer fra Tredimensionelle fluorescensbilleder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haass-Koffler, C. L., Naeemuddin,More

Haass-Koffler, C. L., Naeemuddin, M., Bartlett, S. E. An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images. J. Vis. Exp. (66), e4233, doi:10.3791/4233 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter