Summary
我々は、単一細胞の三次元共焦点蛍光から取ら未定義形状の形態の変化を測定するためにImaris神経科学、ImarisXTとMATLABを利用したソフトウェアプラットフォームを開発しました。この新しいアプローチは、受容体活性化に続く細胞形状の変化を定量化するため、創薬のための可能な追加ツールを表すために使用することができます。
Abstract
蛍光画像を測定するための最も一般的なソフトウェア分析ツールは、2次元（2D）のデータポイントの包含と除外のためのマニュアル設定に依存するデータ、分析の解釈と所見をサポートするためにコンピュータ支援パターン認識のためのものです。それは、細胞ダイナミクスの複雑さをキャプチャし、生物系内の細胞の可塑性の基礎を理解することができるようにするために、3次元（3D）データセットから構成され、蛍光像を測定することができるようにすることがますます重要になってきている。洗練された顕微鏡の楽器は、マルチスペクトル蛍光画像の取得と、収集した2D画像の3D表現を提供する共焦点スタックから画像を再構成する強力な解析ソフトウェアを介して3次元蛍光画像の可視化を許可されています。先進的なデザインをベース立体学法は、原送信の近似や仮定から進展している複雑な組織切片でも2リットルモデルベースの立体学1。顕微鏡でこれらの科学的進歩にもかかわらず、必要性が完全に細胞形態、タンパク質の局在化と受容体の輸送の複雑な変化の分析と定量化を可能にするために本質的な3Dデータを活用して自動化された分析方法のために残してあります。
蛍光画像を定量化することが可能な現在の技術は、メタモーフ（Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール）とマニュアル分析を提供する画像J（NIH）を含む。 Imaris（アンドール·テクノロジー、ベルファスト、北アイルランド）ソフトウェアは、ボリューム·イメージに入れたり、3Dオブジェクトを作成するには、2Dスライスのシリーズで描くことができる測定ポイントの手動作成を可能にする機能MeasurementProを提供します。このメソッドは、2つのオブジェクト間のラインの距離を測定したり、関心のある領域を囲むポリゴンを作成するためにシングルクリックポイント測定に便利ですが、それはCOMPLに適用することは困難である旧セルラーネットワーク構造。フィラメントトレーサー（アンドール）ただし、このモジュールはそのような樹状突起、軸索と棘（構造木のような）で構成されている神経細胞のように定義された構造を測定するために開発されたフィラメント状の3D神経を自動的に検出します。このモジュールは、巧妙に非神経細胞3への形態学的測定を行うために利用されているが、出力データではなくアモルファス状の細胞モデルというより定義されたセルの形状に依存するソフトウェアを使用して拡張セルラーネットワークの情報を提供します。アモルファス状の細胞を分析し、生物学的なアプリケーションへのソフトウェアは、より適切な意思の問題を克服するために、ImarisはImaris Cellを開発しました。これは、細胞内小器官との間の関係を計算するために開発されたEidgenössische工科音楽大学との科学的なプロジェクトだった。ソフトウェアは、セルごとに1つの原子核を強制することにより、生物学的な制約の検出を可能にしますが、およびセグメント細胞に細胞膜を使用して、それが理想的には空隙なしで細胞表面を作成するため、連続していない蛍光データを分析するために利用することはできません。我々の知る限り、現時点では3Dの蛍光画像から地形情報を提供するには、ユーザーによる変更が可能な自動化されたアプローチは、未定義の形状（ 図1）の細胞空間情報を達成することが開発されていない。
我々は、MATLAB（マットワークス株式会社）にインターフェースImarisコアソフトウェアモジュールとImaris XTを使用して分析プラットフォームを開発しました。これらのツールは、事前定義された形状とすることなく、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントを持つ細胞の三次元計測を可能にします。さらに、この方法は、コンピュータのアプリケーションに精通している生物学的システムの専門知識を拡張しますが、していない研究者は、細胞動態の形態学的変化の定量を行うことができます。
Protocol
1。シングルセル表現型変化の三次元形態計測分析
- ヒト胚腎臓（HEK293）細胞をトランスフェクションした赤血球凝集素（HA）コルチコトロピンとしてGタンパク質共役受容体（GPCR）は、以前4 5因子受容体2（CRF-R2）の説明解放タグ付き。
- 細胞は、AS（CRF-R2の内因性リガンド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、CRF（1μM、30分）、または選択CRF-R2の拮抗薬、抗ソーバジン30で前処理で刺激し、（無治療、NT）、未処理のままにした-30、1μM、アゴニスト処理前30分）。
- 次いで、細胞を固定し、透過処理し、抗HAで処理した。 CRF-R2はアレクサ594 nmの抱合抗マウス抗体（IgG 1）抗体を用いて可視化した。 DAPIを核分裂段階を可視化するために使用されていました。
- 実験者の主観性を制限するために、実験条件は、画像が取得され、分析された後まで知られていなかった。
- 我々は、画像を取得しましたプラン·アポクロマート63x/1.4油DIC目的とヴェルディ-V5レーザーとミラ900-Fのレーザーシステムで構成コヒーレント統合された二光子レーザーシステムに接続されたZeiss LSM 510 META共焦点顕微鏡を用いて固定したHEK293細胞からだ。
- データ収集プロセスの間に、細胞は両外側の細胞外受容体に核膜からのデータを含めるようにマルチスペクトルセクショニング、488 nm、および790 nmの（〜350 nmの2PH例）およびzパーティショニング（0.5μm刻み）によって区画された四肢。
- 蛍光データは初の3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションを可能Imarisを使用して処理され、立方ボクセルから成る3Dモデルは形態学的分析のために作成されました。
その後、Imaris XTモジュールは、GPCRの拡張の座標点を決定するために、MATLABのコンピュータプログラム言語とのインタフェースImarisに利用されました。
アカウントセルラーばらつきを考慮するために、我々は蛍光画像鐸を取得し、分析22細胞からEN：アゴニスト治療（n = 7）の前に無治療（NT）（n = 7）で、アゴニスト（CRF）の治療（n = 8）および拮抗薬による前治療（AS-30）（ 図2） 。- 関心領域（ROI）は、アクティブ分裂の段階ではなく、他の細胞に接近していない一つのセルを含める必要があります。このように、分析は1つの核とレセプターの拡張子を持つ細胞が他の細胞の近接によって乱されていないが含まれます。
- 細胞の3D構造は、第1 Imaris（v.7.1.1）を使ってマルチスペクトル蛍光データから再構築されました。
- Imarisによって設計されたアルゴリズムに続いて、第一面のレンダリングは核膜を表すために利用された。 ROI内の複数の核がある場合Imarisあるかどうかを判別します。
- 次にスポット作成のアルゴリズムは、CRF-R2の拡張子を検索するために利用された。それがバックグラウンドノイズとの不規則な強度を補償するため、スポットの検出を利用したアモルファス状の細胞の複雑なネットワーク。
- CRF-R2の蛍光検出の各ユニットの含有を最大化するために、スポット '直径はガウシアンフィルタを用いて測定された強度の形で明確な情報を推定する画像内の最小単位である0.2μm以下に設定した。スポットフィルタリングがスポット自動作成プロセスに組み込まれました。ソフトウェアは、しかし、ユーザにパラメータを定義するには、フィルタを使用するための柔軟性を与える。
- データの切り捨てを回避するために、データ·セットは、32ビットの小数に、8ビット（符号なし）固定点から変換された。
- ボクセル強度データは、MATLABとのインタフェースImaris XTのモジュールを使用して座標データを発見するために交換し、各スポットの正確な空間的位置は、基準点（ 図3）のように核膜を用いた距離変換を実行することによって決定された。
- 得られたデータは、sのためのグラフィカル形式で定量化し、提示することができるtatistical分析。群間の比較は、二元配置ANOVAとBonferroniの事後テストを用いて行った。データは平均±SDとして提示されます。違いは、* p <0.05で有意であると見なされている。計算は、GraphPad Prism 5.02（ 図4）を用いて行った。
2。代表的な結果
我々のアプローチの力を発揮するために、我々は細胞の変化を定量化しているGタンパク質共役受容体（GPCR）と副腎皮質刺激ホルモン放出因子、トランスフェクトしたHEK293細胞での内因性リガンドとレセプターのCRF-2（CRF-R2）の相互作用から生じる。
我々は、CRF-R2受容体は細胞（ 図2Aおよびムービー1）の膜の有限地域から原形質膜とプロジェクトに配置されていることを示している。従来の2次元解析を用いて、それは我々が受容体の接着poを分析する場合にのみ、外CRF-R2受容体のこの部分集合を検出することが可能であるガラス上のintはカバーしています。その結果、私たちは、Z-スタック型マルチスペクトルデータ（ 図5）から派生した他の情報が失われます。
形質膜からスポットまでの距離の減少によって示されるように、細胞はCRFで処理されると、細胞外受容体は大幅に削減されます。彼らはまた、主に有限の場所から離散した位置（ 図2Bと映画2）の数に再配布されます。
レセプター膜分布にCRFの効果は、CRF-R2の特異的アンタゴニスト、antisavagine 30（AS-30）を用いた前処理により防止と私たちは、CRF-R2の拡張子は（ 図2Cおよびムービー3）変更しないことを見つけることです。
スポットの遠位分布は、5μmのスペクトル色分けされた間隔でプロット核膜からボクセルの距離を視覚化するために利用される。無治療と拮抗pretreatmんENT（AS-30、1μM、30分）アゴニスト治療の前には（CRF、1μM、30分）、GPCRの収縮に有意（ns）の違いを示していない。アゴニストで細胞を処理（CRF、1μM、30分）が徐々に無治療と比較したCRF-R2の含有ボクセル、0から5ミクロン（ns）で、6月15日程度（の数を減らし**はp < 0.01）、> 15μm以下（*** P <0.005）、またはAS-30治療、0から10ミクロン（ナノ秒）、11から15ミクロン（** p <0.01）とに比べて> 15ミクロン（*** P <0.005）（ 図4）。
図1。現在利用可能な技術と蛍光画像を分析する彼らの限界の図は拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3：HA-CRF-R2を使用して、HEK293、トランスフェクトされた細胞の3次元モデルがImarisソフトウェアを使用して、CLSの画像から再構築。小胞に変換GPCRの拡張を記述する核とスポット作成の表面レンダリング。蛍光データは初の3D顕微鏡データセットの可視化とセグメンテーションを可能Imarisを用いて処理した。その後、Imaris XTは、MATLABとのインタフェースImarisに利用されました。ボクセル強度に交換しましたスポット座標。スポットスペクトル色分け（青0から5ミクロン、緑、6-10ミクロン、11から15μmの黄色と赤> 15μm）の距離形核膜を表しています。スケールは5μm。
図4スポットの遠位分布のグラフィック表現が5μm間隔でコード化されたスペクトル色にプロットは核膜からボクセルの距離を視覚化するために利用される。アゴニスト処理前の拮抗（AS-30、1μM、30分）（CRF、1μM、30分）と無治療と前処理は、GPCRの収縮に有意（ns）の違いを示していない。治療なし0から5ミクロン（ns）で、6月15日程度（**はpと比較した場合、アゴニストで細胞を処理（CRF、1μM、30分）は、徐々に数CRF-R2を含むボクセルの距離が短縮され<0.01）、> 15μm以下（*** P <0.005）、またはAS-30 0から10μmの治療（ns）で、11月15日ミクロン（** p <0.01）および> 15ミクロン（*** P <0.005）。
図5：HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の二次元形態計測分析の限界。核の中心を示す細胞の中央平面部（ガラスカバースリップ上の3-4μmで）はDAPIおよびHA-CRF-R2を用いて可視化抗-HAを使用してプローブとAlexa 488nmの結合抗マウス抗体（IgG 1）二次を用いて可視化受容体の付着点が劇的に異なっていながら、抗体とCLSで取得したが、（A）は無治療（NT）と（B）のアゴニスト（CRF、1μM、30分）の間に違いを見せていない。
映画は1。自由受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価するために、HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の"サーパス"モードでは、無治療で3Dモデルを回転させる。 5〜20μmであるからスケールバー。/ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "ターゲット=" _blank ">ムービーを見るにはここをクリックしてください。
映画は2。自由受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価するために、HA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞、アゴニスト処理、CRF（CRF、1μM、30分）の"サーパス"モードで3Dモデルを回転させる。 5〜20μmであるからスケールバー。 ムービーを見るにはここをクリックしてください。
ムービーのHA-CRF-R2とHEK 293トランスフェクトされた細胞の"サーパス"モードで3。自由に回転する3D、アゴニスト処理前の拮抗薬を用いた前処理（AS-30、1μM、30分）（CRF、1μM、30分）受容体タンパク質のうち、細胞の表現型の違いを評価する。 5〜20μmであるからスケールバー。 ムービーを見るにはここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、CRFの治療は、その形態やCRF-R2の位置に大きな変化を誘導することを示した。 CRF-R2の変化は選択的アンタゴニスト処理により抑制された。我々は、受容体の変更が検出されなかった、標準的な2Dマルチスペクトル技術を用いて測定することができないことを示した。複雑な3D映像を勉強する能力が形態学的分析のための生物学的パラメーターの複雑さを取り入れることが重要です。我々は、一貫性のない蛍光ネットワークコンポーネントとの事前に定義された形状はなく細胞の3次元測定を行うことができました。ユーザーによる変更が可能な自動化された方法の私達のスイートは、細胞動態に関する情報を抽出するために、その環境内の個々のアモルファス状の細胞内の分子動態を定量化することを可能にします。このツールは、阻害剤の存在下で細胞経路と細胞形態の変化に関する薬理化合物の効果についての予測を行い、細胞の生存に関する情報を提供するために助けることができます。
当社の3D定量法の利点は、それが広範な生物学メカニズムの専門知識が、コンピュータコードに精通していない、と研究者は、コンピュータのアプリケーションと顕微鏡技術をインタフェースすることができるということです。我々はセル6の人口を反映した情報を明らかにするために、単一セルの測定を行った。単一セルの測定は、他の細胞との近接によって動じない複雑な形をした細胞の分析を提供してくれます。この方法は、細胞形状の変化や化学stimualtion 7,8後の膜結合タンパク質の位置を検討する上で科学者を支援するでしょう。細胞の分析では、その細胞外肢に対する細胞内核の区画からのデータを含める必要があります。 2D画像から得ることができる最大のデータを含めることはセルの中央面を横切っていますが、核と細胞膜の最も外側の位置が異なるz平面上に配置され、2Dの可視化は切り捨て画像。核は3〜4μmのガラスカバースリップ上に配置されている細胞接着ポイント、上方に配置されているように、データの拡張量は失われます。この受容体は空間的な再編成が唯一の3D画像で見られ、分析せずに定量化することができませんすることができます。このツールは、2Dデータによって断片化の代わりに、全体としてのセルラーシステムに対応して情報を提供し、従来の2次元的な分析技術を用いて検出されていない細胞の変化を視覚化して測定するための新しいアプローチを提供します。その他記載された技術9と一緒に、単一細胞を測定するためのこのアプローチは、私たちは携帯ダイナミクスと細胞の可塑性の基盤の複雑さを調べることができます。
このメソッドは、Imarisに限ったことではないとコンピューティング言語のソフトウェアとのインタフェースの任意のデータ可視化ソフトウェアに適用することができます。システムへの将来の改善が生きているから取られた3次元の細胞の形態学的分析が含まれます細胞化学的固定や化学染色せずに、自然な状態でセル全体の検査を可能にする。我々は時間をかけて同じセルに表現型の測定を定量化することができるので、生きた細胞の画像を取得することも、細胞間のばらつきをなくすことができます。
我々は、他の科学者が定量イメージング技術のギャップを埋めるのに役立ちます、明記していない形の細胞の構造を測定するために、その可能性と、私たちのプラットフォーム技術を信じています。この新しいアプローチは、他の単一セルのプロファイリング10、創薬プロセスのための補助ツールとして、この細胞ベースアッセイを作り、多数の単一細胞表現型変化の特性評価に適用可能である。このプラットフォームが進化するにつれ、細胞形態がすでに、小分子阻害剤11を識別するためのハイスループットスクリーニングに利用されているので、このメソッドは同じpharmacologiに影響を与える単一細胞からの用量応答曲線を決定するために有用であることを期待calは、ターゲットが、異なる作用機序を持つ。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
我々はImaris、Imaris XTとMatlabの使用のためにカリフォルニアの生体イメージング技術開発センター（BIDC）大学サンフランシスコ校に感謝します。我々は、原稿の編集への貢献のためにLK Floren、L. Daitch、技術支援のために、ヘンリーVでKharaziaに感謝します。 1R21DA029966-01と薬局のSEBは、UCSFの学校にMLSMRコレクションをスクリーニングするためのNIHのファストトラック賞（：この作品は、SEB、国立衛生研究所（NIH）にUCSFを通じてアルコール＆薬物乱用のカリフォルニア医学研究の国家からの資金によって支えられディーンのOfficeと臨床薬学）とCLHKに医学部（臨床薬理·実験治療）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
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