Summary
우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.
Abstract
형광 이미지를 측정에 사용할 수있는 가장 일반적인 소프트웨어 분석 도구는 데이터 요소 및 분석의 해석 및 결과를 지원하는 컴퓨터 지원 패턴 인식을 포함 및 제외에 대한 수동 설정에 의존 (2D) 2 차원 데이터입니다. 그것은 세포 역학의 복잡성을 캡처 및 생물학적 시스템 내에서 세포 소성의 기초를 이해 할 수하기 위해 (3D) 입체 데이터 세트로 구성 형광 이미지를 측정 할 수 있도록 점점 더 중요 해지고있다. 정교한 현미경 악기는 multispectral 형광 이미지와 다음 수집 된 2D 이미지의 3D 표현을 제공하는 공 촛점 스택에서 이미지를 reconstructs 강력한 분석 소프트웨어의 인수를 통해 3D 형광 이미지의 시각화를 허용하고 있습니다. 고급 디자인 기반 stereology 방법은 origina의 근사와 가정에서 진행 한복잡한 조직 섹션 2 리터 모델을 기반 stereology 1. 현미경에서 이러한 과학적 진보에도 불구하고, 필요 완전히 세포 형태, 단백질 지역화와 수용체 거래의 복잡한 변화의 분석 및 정량화 할 수 있도록하기 위해 고유 3D 데이터를 이용하는 자동화 된 분석 방법으로 남아있다.
형광 이미지를 수량화 할 수 현재 기술은 메타 Morph (분자 장치, 서니 베일, CA) 및 수동 분석을 제공합니다 이미지 J (NIH)가 포함되어 있습니다. Imaris (ANDOR 기술, 벨파스트, 북 아일랜드) 소프트웨어는 볼륨 이미지에 배치하거나 3D 객체를 생성하기 위해 2D 슬라이스 일련의 발행 할 수 있습니다 측정 포인트의 수동 생성을 수있는 기능 MeasurementPro을 제공합니다. 이 방법은 두 객체 사이의 선 거리를 측정하거나 관심있는 지역을 둘러싼 다각형을 만들려면 한 번만 클릭하면 포인트 측정에 유용하지만, compl에 적용하기가 어렵습니다예 셀룰러 네트워크 구조. 필라멘트 추적기 (ANDOR)는하지만,이 모듈은 이러한 수석, axons과 쪽 (구조 나무 등)으로 구성되어 있습니다 뉴런과 같은 정의 구조를 측정하기 위해 개발 된 필라멘트과 같은 3D neuronal 자동으로 감지 할 수 있습니다. 이 모듈은 ingeniously 비 neuronal 세포 3 형태학의 측정을하기 위해 사용되어 왔습니다 그러나, 출력 데이터 오히려 비정질 모양의 휴대폰 모델 것보다 정의 된 셀 모양에 따라 소프트웨어를 사용하여 확장 셀룰러 네트워크의 정보를 제공합니다. 비정질 모양의 세포를 분석하고 생물학적 응용 프로그램 소프트웨어가 더 적합의 문제를 극복하기 위해 Imaris은 Imaris 셀을 개발했다. 이 세포와 세포 기관 사이의 관계를 계산하기 위해 개발 된 Eidgenössische Technische Hochschule과 과학 프로젝트를했습니다. 소프트웨어는 세포 당 하나의 핵을 강요하여, 생물 제약의 검출을 가능하게하는 동안그리고 세그먼트 셀에 셀 멤브레인을 사용하여, 그것은 이상적으로는 무효 공간없이 세포 표면을 구축하기 때문에 연속되지 형광 데이터를 분석하기 위해 이용 될 수 없습니다. 우리의 지식으로, 현재 3D 형광 이미지에서 morphometric 정보를 제공합니다는 사용자가 수정할 수 자동화 접근 방식은 정의되지 않은 형태 (그림 1)의 세포 공간 정보를 달성 개발되지 않았습니다.
우리는 MATLAB (매트 작품 주식회사)에 인터페이스 Imaris 핵심 소프트웨어 모듈 및 Imaris XT를 사용하여 분석 플랫폼을 개발했습니다. 이 도구는 미리 정의 된 모양없이 일관성 형광 네트워크 구성 요소와 세포의 3D 측정을 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 역학에 형태학의 변화를 정량화을 수행하는 컴퓨터 응용 프로그램에 익숙 생물 시스템에 전문 지식을 확장하지만,하지 않은 연구자가 허용됩니다.
Protocol
1. 단일 셀 Phenotypic 변경의 세 가지 차원 Morphometric 분석
- 인간 배아 신장 (HEK293) 세포와 transfected 된 적혈구 응집소 (HA) corticotropin이 같은 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)는 이전 4 5 요소 수용체-2 (CRF-R2) 설명 릴리스 태그.
- 세포는 (AS CRF-R2의 내생의 리간드, corticotropin 방출 인자, CRF (1 μM, 30 분) 또는 선택적 CRF-R2 길항제, 항 sauvagine 30과 pretreated와 자극, (NO 치료, NT) 치료 남은 -30, 1 μM, 작용제 치료 이전 30 분).
- 세포는 다음 고정 permeabilized 및 안티 HA로 치료했다. CRF-R2 알렉사 594 nm의 공액 안티 - 마우스 (IgG 1) 항체를 사용하여 시각화했다. DAPI는 핵의 mitotic 단계를 시각화하는 데 사용되었다.
- 실험을 주관를 제한하려면 실험 조건은 이미지를 획득하여 분석 하였다 전까지는 알려져 있지 않았습니다.
- 우리는 이미지를 획득베르디 - V5 레이저와 미라 900-F 레이저 시스템 구성 코 히어 런트 통합 두 광자 레이저 시스템에 연결 계획 - 고차 색지움 63x/1.4 오일 DIC 목표와 Zeiss LSM 510 META 공 촛점 현미경을 사용하여 고정 HEK293 세포에서 s입니다.
- 데이터 수집 과정에서 세포는 모두 바깥 쪽 세포 수용체에 핵 막에서 데이터를 포함하는 multispectral sectioning, 488 nm의, 그리고 790 nm의 (~ 350 nm의 2ph 예.) 및 z-분할 (0.5 μm 단위)에 의해 compartmentalized되었습니다 극단.
- 형광 데이터가 처음 3D 현미경 데이터 세트의 시각화 및 세분화 할 수 있습니다 Imaris를 사용하여 처리되었고, 입방 voxels로 구성된 3D 모델은 morphometric 분석을 위해 만들어졌습니다.
그런 다음 Imaris XT 모듈은 GPCR 확장의 좌표 위치를 결정하기 위해 MATLAB 컴퓨터 프로그램 언어 인터페이스 Imaris로 활용되었다.
계정 세포 다양성을 고려하기 위해, 우리는 형광 이미지 치 렀어를 획득하고 분석22 세포에서 전용 : 작용제 치료 (N = 7) 이전없이 처리 (NT) (N = 7), 작용제 (CRF) 처리 (N = 8) 및 길항제와 사전 처리 (AS-30) (그림 2) .- 관심 지역 (ROI)은 활성 mitotic 단계에 있지와 다른 셀에 닫지 한 셀이 포함되어야합니다. 이러한 방법으로 분석 한 핵 및 수용체 확장과 세포가 다른 세포의 가까이에 어리둥절하지 않습니다 포함됩니다.
- 셀룰러 3D 구조가 먼저 Imaris (v.7.1.1)를 사용하여 multispectral 형광 데이터를 복원되었다.
- Imaris가 설계 한 알고리즘을 따라 먼저 표면 렌더링은 핵 멤브레인을 나타 내기 위해 이용되었다. 투자 수익 (ROI)에서 하나 이상의 핵이있을 경우 Imaris를 결정합니다.
- 그런 다음 명소 - 생성 알고리즘은 CRF-R2 확장을 찾습니다 활용되었다. 가 배경 소음의 불규칙 강도에 대한 보상 때문 명소 감지를 활용 한비정질 모양의 세포의 복잡한 네트워크.
- CRF-R2의 형광 검출의 각 단위의 포함을 극대화하려면 명소 '직경은 가우스 필터를 사용하여 측정 강도의 형태로 뚜렷한 정보를 추정 할 수있는 이미지 내의 가장 작은 단위입니다 0.2 μm로 설정되었습니다. 스팟 필터링이 명소 자동 생성 과정에 통합되었습니다. 이 소프트웨어는하지만, 사용자에게 매개 변수를 정의하는 필터를 사용하여 할 수있는 유연성을 제공합니다.
- 데이터 잘림을 방지하려면 데이터 세트는 32 비트의 십진수로 8 비트 (서명) 고정 소수점에서 개조되었습니다.
- voxel 농도 데이터는 참조 점 (그림 3)과 같이 핵 멤브레인을 사용하여 거리 변환을 수행하여 결정되었습니다 Imaris XT의 MATLAB과 인터페이스 모듈과 각 지점의 정확한 공간 위치를 사용하여 좌표 데이터를 파악하기 위해 교환했다.
- 그 결과 데이터는 s에 대한 정량화 및 그래픽 형식으로 제시 될 수 있습니다tatistical 분석. 그룹 간의 비교는 양방향 ANOVA와 Bonferroni posttest를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 의미 ± SD를로 제공됩니다. 차이는 * P는 <0.05에서 중요한 것으로 간주됩니다. 계산 GraphPad의 프리즘 5.02 (그림 4)로 만들어졌다.
2. 대표 결과
접근의 힘을 보여하기 위해, 우리는 세포 변화를 정량화이 G 단백질 결합 수용체 (GPCRs)와 corticotropin 방출 인자 transfected HEK293 세포에서의 내생 리간드 CRF있는 수용체-2 (CRF-R2)의 상호 작용 따른 모든 책임은 사용자에게 있습니다.
우리는 CRF-R2 수용체는 세포 (그림 2A와 영화 1) 멤브레인의 유한 지역의 플라즈마 막 및 프로젝트에있는 것을 보여줍니다. 기존의 2D 분석 사용하면, 우리가 수용체 부착 PO를 분석하는 경우에만 세포 CRF-R2 수용체의 하위 집합을 감지 할 수 있습니다유리에 ints이 적용됩니다. 따라서 우리는 Z-스택 multispectral 데이터 (그림 5)에서 파생 된 다른 정보를 잃게됩니다.
플라즈마 막에서 장소 거리의 감소에 의해 그림과 같이 셀이 CRF로 치료하는 경우, 세포 수용체가 크게 감소하고 있습니다. 또한 분리 된 지역의 수 (그림 2B와 영화 2)에 주로 유한 위치에서 배포됩니다.
수용체 막 배포 CRF의 효과는 CRF-R2 특정 길항제, antisavagine 30 일 (AS-30) 전처리에 의해 방지하고 우리는 CRF-R2 확장 (그림 2C와 영화 3) 변경되지 않는 것을 발견합니다.
장소의 말초 배포, 5 μm 스펙트럼 컬러 코딩 간격으로 해본 핵 막에서 voxels의 거리를 시각화하기 위해 사용됩니다. 어떤 치료 및 길항제 pretreatm 없습니다다닐이 (AS-30, 1 μM, 30 분) 작용제 치료 (CRF, 1 μM, 30 분) 전에 GPCR의 수축에 중요한 (NS) 차이를 보여 없습니다. 더 치료, 0-5 μm (NS), 6-15 μm (에 비해 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분)과 세포의 치료는 점점 CRF-R2 함유 voxels의 수를 감소 ** P < 0.01) 및> 15 μm (*** P <0.005) 또는 AS-30 처리, 0-10 μm (NS), 11-15 μm (비교 ** P <0.01)와> 15 μm (*** P <0.005) (그림 4).
1 그림. 현재 사용 가능한 기술과 형광 이미지를 분석하기 위해 제한의 다이어그램. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3은. HA-CRF-R2와 HEK293 transfected 세포의 3D 모델은 Imaris 소프트웨어를 사용하여 CLS 이미지에서 복원. 작은 소포로 변환 GPCR 확장을 설명하는 핵 및 명소 생성의 표면 렌더링. 형광 데이터가 처음 3D 현미경 데이터 집합의 시각화 및 세분화 할 수 있습니다 Imaris을 사용하여 처리 하였다. 그런 다음, Imaris XT는 MATLAB과 인터페이스 Imaris로 활용되었다. voxel 농도는로 교환되었다장소 맡고있다. 명소 스펙트럼 코딩 된 색상 (파란색 0-5 μm, 녹색, 6-10 μm, 노란색 11-15 μm과 빨간색> 15 μm) 거리 형태 핵 멤브레인을 나타냅니다. 5 μm 크기를 조정.
그림 4. 장소의 말초 배포의 그래픽 표현을 5 μm 간격으로 코딩 된 스펙트럼 색에 해본는 핵 막에서 voxels의 거리를 시각화하기 위해 사용됩니다. 작용제 치료 전에 길항제 (AS-30, 1 μM, 30 분) (CRF, 1 μM, 30 분)를 가진 치료 및 전처리는 GPCR의 수축에 중요한 (NS) 차이를 보여 없습니다. 더 치료를 0-5 μm (NS), 6-15 μm을 (** P 비해 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분)과 세포의 치료는 점점 CRF-R2 함유 voxels의 수의 거리를 감소 <0.01)와> 15 μm (*** P <0.005), 또는 AS-30 치료 0-10 μm (NS), 11-15 μm (** P <0.01)와> 15 μm (*** P <0.005).
그림 5. HA-CRF-R2와 HEK 293 transfected 세포의 2D morphometric 분석의 제한. 핵의 중심을 보여주는 세포의 중간 평면 섹션 (유리 coverslip 위에 3 4μm)는 DAPI와 HA-CRF-R2와 시각화 안티 - HA를 사용 탐지 및 알렉사 488nm 복합 안티 - 마우스 (IgG 1) 차를 사용하여 시각화 수용체 부착 지점은 크게 다릅니다 동안 항체와 CLS와 함께 인수는 (A) 노 처리 (NT)와 (B) 작용제 (CRF, 1 μM, 30 분) 사이에 차이점을 보여줍니다 없습니다.
영화는 1. 자유롭게 HA-CRF-R2, 아니 치료와 293 transfected 세포는 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가하는 HEK의 "초과"모드에서 3D 모델을 회전. 5-20 μm의 크기 바./ files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "대상 ="_blank "> 영화를 보려면 여기를 클릭하십시오.
자유롭게 HA-CRF-R2, 작용제 치료로 293 transfected 세포가 HEK의 "초과"모드에서 3D 모델을 회전 영화 2., CRF (CRF, 1 μM, 30 분) 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가합니다. 5-20 μm에서 규모 바. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 3. 자유롭게 HA-CRF-R2, 작용제 치료 전에 길항제 (AS-30, 1 μM, 30 분)로 전처리 (CRF, 1 μM, 30 분으로 293 transfected 세포는 HEK의 "초과"모드에서 3D를 회전 ) 수용체 단백질 중 세포 표현형의 차이를 평가합니다. 5-20 μm에서 규모 바. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 CRF 치료가 중요한 형태의 변화와 CRF-R2의 위치를 유도 것으로 나타났다. CRF-R2의 변경 사항은 선택적 길항제 치료에 의해 저해되었다. 우리는 수용체 수정이 표준 2D multispectral 기술을 사용하여 감지되지 않은 및 측정 할 수없는 것으로 나타났다. 복잡한 3D 이미지를 연구 할 수있는 능력은 morphometric 분석을 위해 생물학적 매개 변수의 복잡성을 반영하는 것이 중요합니다. 우리는 일관성 형광 네트워크 구성 요소와 미리 정의 된 모양없이 세포의 3D 측정을 할 수있었습니다. 사용자가 수정할 자동화 된 방법 우리의 스위트 룸은 세포 역학에 대한 정보를 추출하기 위해 자신의 환경에서 개별 비정질 모양의 세포에서 분자 역학을 수량화 할 수있게. 이 도구는 셀룰러 경로와 억제제의 존재의 세포 형태의 변경에 약리 화합물의 효과에 대한 예측을하고 세포 생존에 대한 정보를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.
우리의 3D 정량화 방법의 장점은 컴퓨터 응용 프로그램 인터페이스 현미경 기술로, 컴퓨터 코드에 익숙 생물학 메커니즘의 광범위한 전문 지식과 연구를 할 수 있지만 것입니다. 우리는 셀 6의 인구를 반영 정보를 공개하기 위해 단일 셀 측정을했다. 단일 셀 측정은 다른 세포와 근접하여 교란되지 않은 복잡한 모양의 세포의 분석으로 우리를 제공합니다. 이 방법은 세포 모양의 변화와 화학 stimualtion 7, 8, 9, 10 후 막 바인딩 된 단백질의 위치를 조사에 과학자 도움이됩니다. 세포의 분석은 세포 내부의 핵심 구획에서의 세포 사지 데이터를 포함해야합니다. 2D 이미지에서 얻을 수있는 최대 데이터 포함하면 셀의 중간 비행기 건너편에 자리하지만, 핵 및 플라즈마 막의 가장 바깥 쪽 위치가 서로 다른 Z-비행기에 위치되며, 2 차원 시각화 잘라이미지. 핵은 3 사이, 4 μm 유리 coverslip에 위치한 세포 접착 점, 상단에있는 바와 같이, 데이터의 확장 금액이 손실됩니다. 이 수용체 공간 조직 개편은 3D 이미지에서 볼 수 있으며, 분석하지 않고 계량 할 수 없습니다 수 있습니다. 이 도구는 2D 데이터가 조각화 세포 전체 시스템 대신을 해결 정보를 제공, 전통적인 2D 분석 기술을 사용하여 검색되지 않습니다 세포 변경 사항을 시각화하고 측정 할 수있는 새로운 접근 방식을 제공합니다. 다른 설명 기술 9, 함께 하나의 세포를 측정하는 이러한 접근 방식은 우리가 세포 역학의 복잡성과 세포 소성의 기초를 조사 할 수 있습니다.
이 방법은 Imaris에 국한되지 않고 컴퓨팅 언어 소프트웨어와 인터페이스 데이터 시각화 소프트웨어에 적용 할 수 있습니다. 시스템에 미래 개선 생활에서 찍은 3D 세포의 morphometric 분석을 포함합니다화학 고정 또는 화학 염색법없이 자연 상태에서 전체 세포의 검사를 허용하는 세포. 우리가 시간이 지남에 따라 동일한 셀에 phenotypic 측정을 수량화 수 있기 때문에 살아있는 세포의 이미지를 취득하면, 세포 변화를 제거합니다.
우리는 다른 과학자 정량화 이미징 기술의 틈을 작성하는 데 도움이됩니다, 지정되지 않은 모양 - 세포의 구조를 측정하기위한 잠재력을 지닌, 우리의 플랫폼 기술을 믿습니다. 이 새로운 접근 방식은 다른 단일 셀 프로파일 10, 약물 발견 과정에 대한 추가 도구로,이 세포 기반 분석을 수많은 단일 셀 phenotypic 변화의 특성에 적용됩니다. 셀 형태가 이미이 플랫폼이 발전함에 따라, 작은 분자 억제제가 11를 식별하기 위해 높은 처리량 검사에 이용 되었기 때문에, 우리는이 방법이 동일한 pharmacologi에 영향을 하나의 세포에서 용량 - 반응 곡선을 결정하는 데 유용 할 것으로 예상칼 대상이지만 행동의 다른 메커니즘이 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Imaris, Imaris XT와 MATLAB의 사용에 대한 캘리포니아의 생물 이미징 개발 센터 (BIDC) 대학, 샌프란시스코 감사합니다. 우리는 기술 지원 및 헨리, LK Floren, 원고의 편집에 대한 그들의 공헌에 대한 L. Daitch AT V. Kharazia 감사드립니다. 1R21DA029966-01과 약국의 세브 UCSF 학교에 MLSMR 컬렉션을 화면으로 NIH 패스트 트랙 상 (:이 작품은 세브 국립 보건원에 UCSF을 통해 알코올 및 약물 중독에 캘리포니아 의료 연구의 주에서 자금에 의해 지원되었다 딘의 사무실 및 임상 약학)와 CLHK에 의학 대학 (임상 약리학 및 실험 치료학).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
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