Summary
Biz tek hücrelerin üç boyutlu konfokal floresans alınan tanımsız bir şekil morfolojisi değişiklikleri ölçmek için Imaris Nörobilim, ImarisXT ve MATLAB kullanan bir yazılım platformu geliştirdi. Bu yeni yaklaşım, reseptör aktivasyonunu takiben hücre şekli değişiklikleri ölçmek için kullanılır ve bu nedenle ilaç keşfi için olası ek bir araç temsil edilebilir.
Abstract
Floresans görüntüleri ölçüm için mevcut en yaygın yazılım analiz araçları veri noktaları ve analizlerin yorumlanması ve bulgularını desteklemek için bilgisayar destekli desen tanıma dahil etme ve dışlama manuel ayarlar güveniyor (2D) iki boyutlu veriler için vardır. Bu hücresel dinamikleri karmaşıklığına yakalamak ve biyolojik sistemler içinde hücre plastisite temelini anlamak mümkün olabilmesi için (3D) üç boyutlu veri setleri inşa floresans görüntüleri ölçebilmek için giderek daha önemli hale gelmiştir. Sofistike mikroskopi aletleri multispektral floresans görüntüler ve ardından toplanan 2D görüntüleri 3D temsilini sağlamak konfokal yığınlardan alınan görüntülerin yeniden yapılandırır güçlü analitik yazılım satın alma yoluyla 3D floresans görüntüler görselleştirme izin var. Gelişmiş tasarım tabanlı stereoloji yöntemleri Origina yaklaştırılması ve varsayımlardan ilerlemiştirhatta karmaşık doku kesitlerinde 2 l model tabanlı stereoloji 1. Mikroskopi bu bilimsel gelişmelere rağmen, ihtiyacı tam hücre morfolojisi, protein lokalizasyonu ve reseptör ticareti karmaşık değişimlerin analizi ve ölçümü için izin vermek için içsel 3D veri kullanan bir otomatik analitik yöntem için kalır.
Floresans görüntüleri ölçmek için kullanılabilir Mevcut teknikler Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ve manuel analiz sağlamak Image J (NIH) içerir. Imaris (Andor Teknoloji, Belfast, Kuzey İrlanda) yazılımı bir ses dosyasını yerleştirilir ya da bir 3D nesne oluşturmak için 2D dilim bir dizi üzerine çizilebilir ölçüm noktalarının manuel oluşturulması sağlayan özelliği MeasurementPro sağlar. Bu yöntem, iki nesne arasında bir çizgi mesafe ölçmek ya da ilgilenilen bölge kapsayan bir çokgen oluşturmak için tek tıklama nokta ölçümleri için yararlıdır, ama compl uygulamak zordurex hücresel ağ yapıları. Filament Tracer (Andor) Ancak, bu modül gibi dendritler, akson ve dikenler (yapı ağacı gibi) oluşmaktadır nöronlar olarak tanımlanan yapıları ölçmek için geliştirilmiştir filament benzeri 3D nöronal otomatik algılama sağlar. Bu modül, ustaca nöronal olmayan hücreler 3 morfolojik ölçümler yapmak için kullanılmıştır, ancak çıkış verileri yerine bir amorf-şekilli hücre modeli olan daha tanımlanmış hücre şekline bağlıdır bir yazılım kullanılarak genişletilmiş bir hücresel ağ üzerinden bilgi sağlar. Amorf şekilli hücrelerin analiz ve biyolojik bir uygulama yazılımı daha uygun yapma sorunu aşmak için, Imaris Imaris Hücre geliştirdi. Bu hücre ve organeller arasındaki ilişkiyi hesaplamak için geliştirilmiştir Eidgenössische Technische Hochschule, bilimsel bir proje oldu. Yazılım hücre başına bir çekirdeği zorlayarak, biyolojik sınırların tespiti sağlarkenve segment hücrelere hücre zarlarını kullanarak, ideal geçersiz boşluksuz hücre yüzey oluşturur, çünkü sürekli değildir floresans verileri analiz etmek için kullanılan olamaz. Bildiğimiz kadarıyla, şu anda 3D floresans görüntüleri morfometrik bilgi sağlayan hiçbir kullanıcı tarafından değiştirilebilir otomatik yaklaşım tanımlanmamış bir şekli (Şekil 1) hücresel mekansal bilgi ulaştığından emin geliştirilmiştir.
Biz MATLAB (Mat İşleri, Inc) da koordine Imaris çekirdek yazılım modülü ve Imaris XT kullanarak bir analitik platformu geliştirdi. Bu araçlar önceden tanımlanmış bir şekil vermeden ve tutarsız floresans ağ bileşenleri ile hücrelerin 3D ölçüm sağlar. Ayrıca, bu yöntem hücre dinamikleri morfolojik değişikliklerin ölçümü gerçekleştirmek için, bilgisayar uygulamalarına aşinalık biyolojik sistemlerde uzmanlık genişletilmiş, ancak araştırmacılar sağlayacaktır.
Protocol
1. Tek hücreli Fenotipik Değişim Üç boyutlu Morfometrik Analizi
- Insan embriyonik böbrek (HEK293) hücreleri ile transfekte edildi hemaglutinin (HA) kortikotropin olarak bir G-protein çiftli reseptör (GPCR), önceden 4 5 faktör reseptörü-2 (CRF-R2) 'da anlatılan serbest bırakılması-etiketlendi.
- Hücreler, (AS CRF-R2 endojen ligand, kortikotropin salgılatıcı faktör, CRF (1 uM, 30 dakika), ya da bir seçici CRF-antagonist R2, anti-Sauvagine 30 ile işlemden geçirilmiş ile uyarılmış (tedavi edilmemiş, NT) tedavi bırakılmıştır -30, 1 uM, agonist tedavi öncesinde 30 dakika).
- Hücreler daha sonra, sabit permeabilize ve anti-HA ile tedavi edildi. CRF-R2 Alexa 594 nm konjugatı anti-fare (IgG 1) antikoru kullanılarak görüntülendi. DAPI çekirdekler mitotik Sahneye görselleştirmek için kullanılmıştır.
- Deneyci öznellik sınırlamak için, deneysel koşullar görüntüleri elde edildi ve analiz sonrasına kadar bilinen değildi.
- Biz görüntü eldeBir Verdi-V5 lazer ve Mira 900-F lazer sisteminden oluşan bir Tutarlı entegre iki foton lazer sistemine bağlı bir Plan-apochromat 63x/1.4 petrol DIC objektif ve Zeiss LSM 510 Meta Konfokal mikroskop kullanılarak sabit HEK293 hücrelerinden s.
- Veri toplama işlemi sırasında, hücreler her iki dış hücre dışı reseptör için nükleer membran gelen verileri dahil çok spektrumlu kesit, 488 nm ve 790 nm (~ 350 nm 2PH Ör.) Ve z-bölme (0.5 um lik artışlarla) ile bölümlere edildi ekstremiteler.
- Floresans verileri ilk 3D mikroskopi dataset görselleştirme ve segmentasyon sağlar Imaris kullanılarak işlendi ve küp vokseller oluşan bir 3D modeli morfometrik analiz için oluşturuldu.
Sonra, Imaris XT modülü GPCR uzantıları koordinatları nokta belirlemek için MATLAB Bilgisayar program dili ile arayüz Imaris için kullanılmıştır.
Hesap hücresel değişkenliği içine almak için, floresans görüntüleri tak elde edilen ve analiz22 hücrelerinden tr: agonist tedavisi (n = 7) öncesinde hiçbir tedavi (NT) (n = 7), agonist (KBY) tedavisi (n = 8) ve antagonisti ile tedavi öncesi (AS-30) (Şekil 2) .- İlgi bölgesi (ROI) aktif mitoz aşamasında değildir ve diğer hücrelere yakın değil bir hücre içermelidir. Bu şekilde, analiz, sadece tek bir çekirdek ve reseptör uzantıları ile hücrelerin diğer hücrelerin yakınlık ile altüst olmayan içerecektir.
- Hücresel 3D yapısı ilk Imaris (v.7.1.1) kullanarak multispektral floresans verileri yeniden inşa edildi.
- Imaris göre tasarlanmış algoritması ardından, birinci yüzey işleme nükleer membran göstermek için kullanılmıştır. ROI içinde birden fazla çekirdek olup olmadığını Imaris belirleyecektir.
- Sonra noktalar oluşturma algoritması CRF-R2 uzantısını bulmak için kullanılmıştır. Bu arka plan gürültü ve düzensiz yoğunluğu dengeler nedeniyle Spots algılama yararlanılmıştıramorf şekilli hücrelerin karmaşık bir ağ.
- CRF-R2 floresans saptama her birim dahil üst düzeye çıkarmak için, noktalar 'çapı bir Gauss filtre kullanarak ölçülen yoğunluk şeklinde farklı bilgiler hesaplamak için görüntünün içinde en küçük birim olan 0,2 mikron için kurulmuştur. Nokta filtreleme noktalar otomatik oluşturma sürecine dahil edildi. Yazılım, ancak, kullanıcı parametreleri tanımlamak için filtreler kullanmak için gereken esnekliği sağlar.
- Veri kesilmesi önlemek için, veri kümesi 32-bit ondalık 8-bit (imzasız) sabit nokta, dönüştürülmüş.
- Voksel yoğunlukları veri bir referans noktası (Şekil 3) gibi nükleer membran kullanılan bir mesafe dönüşüm yaparak belirlendi Imaris XT MATLAB ile arabirim modülü ve her bir nokta arasında tam uzaysal konum koordinatlarını kullanarak veri nokta ile yer değiştirmiştir.
- Çıkan veriler s için ölçülebilir ve grafik biçiminde sunulabilirtatistical analizi. Gruplar arasındaki karşılaştırmalar iki yönlü ANOVA ve Bonferroni sontest kullanılarak yapıldı. Veriler ortalama ± SD olarak verilmiştir. Farklılıklar * p <0.05 anlamlı olarak kabul edilmiştir. Hesaplamalar GraphPad Prism 5.02 (Şekil 4) ile yapılmıştır.
2. Temsilcisi Sonuçlar
Bizim yaklaşımın gücünü göstermek için, hücresel değişiklikleri belirleyen, G proteinine bağlı reseptörler (GPCRs) ve kortikotropin salgılatıcı faktör transfekte HEK293 hücrelerde endojen ligand KBY'li reseptör-2 (CRF-R2) etkileşimi sonucu.
Biz, CRF reseptörlerine R2 hücreleri (Şekil 2A ve Film 1) zar sonlu bölgelerinden plazma membranı ve proje içinde yer aldığını göstermektedir. Konvansiyonel 2D analiz kullanılarak, bu reseptör yapışma po analiz sadece hücre dışı CRF reseptör-R2 bu alt tespit etmek mümkündürcamına ints kapsar. Dolayısıyla biz z-yığılmış multispektral verileri (Şekil 5) elde edilen herhangi bir diğer bilgileri kaybedersiniz.
Plazma zarından noktalar uzaklık azalması ile gösterildiği gibi hücrelerin CRF ile muamele edildiği zaman, hücre dışı reseptörler, büyük ölçüde azalır. Onlar da ayrık noktalarda bir dizi (Şekil 2B ve Movie 2) içine öncelikle sonlu yerden yeniden dağıtılır.
Reseptör zar dağıtım CRF etkisi CRF-R2 spesifik antagonist, antisavagine 30 (AS-30) ile ön tedavi ile önlenebilir ve biz CRF-R2 uzantıları (Şekil 2C ve Film 3) değişmez olduğunu bulmak.
Lekelerin distal dağılımı, 5 um spektrum renkli kodlanmış aralıklarla çizilen nükleer membran dan voksel mesafe görselleştirmek için kullanılmaktadır. Hiçbir tedavi ve antagonist pretreatment (AS-30, 1 uM, 30 dk) agonist tedavisi (CRF, 1 uM, 30 dk) önce GPCR daralma anlamlı (ns) farklılık göstermektedir. Tedavi yok, 0-5 mikron (NS), 6-15 mikron (göre agonist (CRF, 1 uM, 30 dk) ile hücrelerin tedavisi tedricen CRF-R2-içeren voksel sayısını azaltır, ** p < 0.01) ve> 15 mikron (*** p <0.005), veya AS-30 tedavisi, 0-10 mikron (ns), 11-15 mikron (karşılaştırıldığında ** p <0.01) ve> 15 mikron (*** p <0.005) (Şekil 4).
Şekil 1. Mevcut geçerli teknikleri ve floresans görüntüleri analiz etme sınırlaması Diyagramı. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. HA-KBY-R2 ile HEK293 transfekte hücreler 3 boyutlu model Imaris yazılımı kullanarak CLS görüntüleri yeniden. Küçük veziküller dönüştürülür GPCR uzantıları açıklayan nukleus ve noktalar oluşturma Yüzey işleme. Floresans verileri ilk 3D mikroskopi veri setinin görselleştirme ve segmentasyon sağlar Imaris kullanılarak işlendi. Daha sonra, Imaris XT MATLAB ile arayüz Imaris için kullanılmıştır. Voksel şiddetleri teati edildinokta koordinatları. Noktalar spektrum renk kodlu (mavi 0-5 mikron, yeşil, 6-10 mikron, sarı 11-15 mikron ve kırmızı> 15 mikron) mesafe formu nükleer membran temsil eder. 5 mikron Scale.
Şekil 4,. Lekelerin distal dağıtım grafik gösterimi, 5 um aralığı içinde kodlanmış spektrum renkli çizilen nükleer membran dan voksel mesafe görselleştirmek için kullanılmaktadır. Agonist tedavi öncesi bir antagonist (AS-30, 1 uM, 30 dk) (CRF, 1 uM, 30 dk) ile hiçbir tedavi ve tedavi öncesi GPCR daralma anlamlı (ns) farklılık göstermektedir. Hiçbir tedavi için 0-5 mikron (NS), 6-15 mikron (** p göre agonist (CRF, 1 uM, 30 dk) ile hücrelerin tedavisi tedricen CRF-R2-içeren voksel sayısı mesafesini azaltır <0.01) ve> 15 mikron (*** p <0.005); veya AS-30 tedavi 0-10 mikron (ns), 11-15 mikron (** p <0.01) ve> 15 mikron (*** p <0.005).
Şekil 5,. HA-CRF-R2 ile transfekte edilmiş HEK 293 hücreleri 2B morfometrik analizleri sınırlandırılması. Çekirdeğin merkez gösteren hücrelerin orta düzlem bölüm (cam lamel üzerinde 3-4μm) DAPI ve HA-CRF-R2 ile görselleştirilmiş anti-HA kullanılarak taranan ve Alexa 488nm bağlı anti-fare (IgG 1) orta kullanılarak görselleştirildi reseptör yapışma noktaları önemli ölçüde farklı ise antikor ve CLS ile elde edilen (A), tedavi yok (NT) ve (B) agonisti (CRF, 1 uM ve 30 dak) arasında herhangi bir fark göstermektedir.
Film 1. Serbestçe HA-CRF-R2, herhangi bir tedavi ile 293 transfekte hücreler reseptör proteinleri arasındaki hücresel fenotip farklılıkları değerlendirmek için HEK arasında "Aşan" modunda 3D modeli döner. 5 ila 20 mikron dan Ölçeği bar./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "target =" _blank "> filmi görmek için buraya tıklayın.
Serbestçe HA-CRF-R2, agonist tedavisi ile 293 transfekte hücreler HEK arasında "Aşan" modunda 3D modeli dönen Movie 2., CRF (CRF, 1 uM, 30 dk) reseptör proteinleri arasındaki hücresel fenotip farklılıkları değerlendirmek. 5 ila 20 mikron dan Ölçek çubuğu. filmi görmek için buraya tıklayın.
Film 3. Serbestçe HA-CRF-R2, agonist tedavi öncesi bir antagonist (AS-30, 1 uM, 30 dk) ile tedavi öncesi (CRF, 1 uM, 30 dk ile 293 transfekte hücreler HEK arasında "Aşan" modunda 3D döndürme ) reseptör proteinler arasındaki hücresel fenotip farklılıkları değerlendirmek. 5 ila 20 mikron dan Ölçek çubuğu. filmi görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz CRF tedavisi önemli bir morfolojik değişim ve KBY-R2 yer indüklenen göstermiştir. CRF-R2 değişiklik seçici antagonisti tedavisi ile inhibe edilmiştir. Biz reseptör değişiklikleri standart 2D multispektral teknikler kullanılarak tespit edilmemiştir ve ölçülemez olduğunu gösterdi. Karmaşık 3D görüntüler çalışmaya yeteneği morfometrik analiz için biyolojik parametrelerin karmaşıklığı dahil etmek önemlidir. Biz tutarsız floresans ağ bileşenleri ile önceden tanımlanmış bir şekil olmadan hücrelerin 3D ölçümler yapmak başardık. Kullanıcı tarafından değiştirilebilir otomatik yöntemler setimiz hücre dinamikleri hakkında bilgi ayıklamak için kendi ortamında bireysel amorf şekilli hücrelerin moleküler dinamiği ölçmek için bize sağlar. Bu araç yolakları ve inhibitörlerinin varlığında hücresel morfoloji değişiklik üzerinde farmakolojik bileşik etkileri hakkında öngörülerde bulunmak ve hücre yaşam hakkında bilgi sağlamak için yardımcı olabilir.
Bizim 3D kantifikasyon yöntemin avantajı bilgisayar uygulamaları ile arayüzü mikroskopi teknikleri, bilgisayar kodları aşina biyoloji mekanizmaları geniş kapsamlı tecrübeye sahip araştırmacıları verir, ancak olmasıdır. Biz hücreleri 6 nüfusu etkileyen bilgileri ortaya çıkarmak amacıyla tek hücreli ölçümleri yaptı. Tek hücreli ölçümü diğer hücreleri ile yakınlığı rahatsızlık duymadan karmaşık şekilli hücre analizi ile bize sunuyor. Bu yöntem, hücre şekli değişiklikleri ve kimyasal stimualtion 7, 8, sonra, zar-bağlı protein yer araştıran bilim adamları yardımcı olacaktır. Bir hücre analizi hücresel iç çekirdek lokalizasyonlardan onun ekstrasellüler ekstremitelere verileri içermelidir. 2D görüntü elde edilebilir maksimum veri dahil bir hücrenin orta düzlem üzerinde olmakla birlikte, çekirdek ve plazma zarının dış yeri farklı z düzlemler üzerinde konumlandırılmıştır; 2D görselleştirme kesergörüntü. Çekirdek 3 ve 4 arasında mikron cam lamel üzerinde bulunan hücresel yapışma noktaları, yukarıda yer aldığı için, bir veri miktarı uzun kaybolur. Bu reseptör mekansal yeniden yapılanma sadece 3D görüntüler görülen ve analiz olmadan ölçülebilir mümkün değildir olabilir. Bu araç 2D verileri tarafından parçalanmış hücresel bir bütün olarak sistemin yerine adresleri hakkında bilgi veren, geleneksel 2B analitik teknikler kullanılarak tespit edilmez hücresel değişiklikler görselleştirmek ve ölçmek için yeni bir yaklaşım sağlar. , Tanımlanan diğer teknolojiler 9 ile birlikte, tek bir hücre için ölçme Bu yaklaşım hücresel dinamik karmaşıklığı ve hücresel plastisitenin esas araştırmak için izin verir.
Bu yöntem, Imaris ile sınırlı değildir ve işlem dil yazılım ile arabirim herhangi bir veri görselleştirme yazılım için uygulanabilir. Sisteme Gelecek geliştirmeler yaşayan alınan 3D hücrelerin morfometrik analizini içerirkimyasal sabitleme veya kimyasal boyama olmadan doğal haliyle tüm hücre incelemesine izin hücreleri. Biz zamanla aynı hücrede fenotipik ölçümler ölçmek çünkü canlı hücrelerin görüntüleri alma da hücrelerarası değişkenliği ortadan kaldıracaktır.
Biz diğer bilim kantifikasyon görüntüleme teknikleri bir boşluğu doldurmak için yardımcı olacaktır, tanımlanmamış şekilli-hücre yapıları ölçmek için potansiyeli ile, bizim platform teknolojisi inanıyorum. Bu yeni yöntem başka tek hücreli bir profil 10, ilaç keşif işlemi için ek bir araç olarak, bu hücreye-dayalı tahlil yapma, çok sayıda tek hücre fenotipik değişikliklerin karakterizasyonu için de geçerlidir. Hücre morfolojisi zaten bu platformu geliştikçe, küçük molekül inhibitörleri 11 belirlenmesi için yüksek çıktılı tarama kullanılmıştır yana, biz bu yöntem aynı farmakolojik etkiler tek hücreler bir doz-yanıt eğrisinin belirlenmesi için yararlı olmasını bekliyoruzcal hedef ama farklı etki mekanizmaları ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Imaris, Imaris XT ve Matlab kullanımı için Kaliforniya Biyolojik Görüntüleme Geliştirme Merkezi (BIDC) Üniversitesi, San Francisco ederim. Biz teknik yardım ve Henry, LK Floren, yazının düzenleme katkılarından dolayı L. Daitch AT V. Kharazia ederim. 1R21DA029966-01 ve Eczacılık SEB, UCSF Okulu MLSMR koleksiyonu ekrana NIH Fast Track ödülü (: Bu çalışma SEB, Ulusal Sağlık Enstitüleri UCSF aracılığıyla Alkol ve Madde Bağımlılığı ile ilgili Kaliforniya Tıbbi Araştırma Devlet fon tarafından desteklenmiştir Dekanlık ve Klinik Eczacılık) ve CLHK Tıp Fakültesi (Klinik Farmakoloji ve Deneysel Therapeutics).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N. Molecular mechanisms of epithelial morphogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 18, 463-493 (2002).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R. Measurement of single-cell dynamics. Nature. 465, 736-745 (2010).
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
