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Biology

루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링

Published: September 27, 2012 doi: 10.3791/4234
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Memphis

Summary

Circadian 시계는 개별 세포 내 기능, 즉, 그들은 세포 자율적 있습니다. 여기, 우리는 비 침습적, 루시 페라 기반의 실시간 bioluminescence 기술을 사용하여 셀 자치 클럭 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 리포터 전지는 circadian 생물학을 공부를위한 다루기 쉬운, 기능 모델 시스템을 제공합니다.

Abstract

포유 동물에서 행동과 수면 각성주기와 간 대사 등 생리학의 여러 측면은 내생 circadian 시계 (1,2 검토)에 의해 규제됩니다. circadian 시간 유지 시스템은 동기화와 다른 1,2 추가 - SCN 및 주변 장치 클럭을 조정 suprachiasmatic 핵 (SCN)에있는 중앙 시계와 함께 계층 멀티 발진기 네트워크입니다. 개인 세포가 생성 및 circadian 리듬 3,4, 그리고 유기체 공유에서 다른 조직 유형과 매우 비슷 생화학 부정적인 피드백 메커니즘의 이러한 발진기의 유지 관리를위한 기능 단위입니다. 그러나, SCN의 neuronal 네트워크 수준과 organismal 수준의 리듬, 전신 신호를 통해 ​​상호 작용으로 인해, organismal 수준의 circadian 리듬은 세포 자율적는 5-7 일 필요는 없습니다. 생체 및 SCN explants 예 생체, C의 전위의 활동의 전통 연구에 비해예쁜 기반 세포 자율적 circadian 결함 5,8의 검색을 허용 체외 assays 인치 전략적으로, 셀 기반 모델은 phenotypic 특성화 및 기본 클럭 메커니즘 5,8-13의 급속한 발견에 대한 더 많은 실험적으로 다루기 쉬운 수 있습니다.

circadian 리듬는 동적이기 때문에, 높은 시간적 해상도 길이 측정은 시계 기능을 평가하기 위해 필요합니다. 최근에는 기자로 반딧불의 루시 페라 제를 사용하여 실시간 bioluminescence 기록은 분자 리듬의 인내와 역학의 시험을 수 있으므로, 포유 동물 14,15에 circadian 리듬을 공부를위한 공통의 기술이되었습니다. 유전자 표현의 세포 자치 circadian 리듬을 모니터링하려면 루시 페라 제 기자 과도 transfection 13,16,17 또는 안정적으로 도입 5,10,18,19를 통해 세포에 도입 할 수 있습니다. 여기 lentivirus로 인한 유전자 전달을 사용하여 안정적인 전달 프로토콜을 설명합니다. 티그는 lentiviral 벡터 시스템은 때문에 그 효율성과 기능성의 과도 transfection 및 germline 전송 등의 전통적인 방법으로 우수합니다 : 그것은 분리와 세포 (20)를 비 나누어 모두의 호스트 게놈에 효율적으로 전달하고 안정적인 통합을 할 수 있습니다. 기자 셀 라인이 설정되면, 클럭 기능의 역학은 bioluminescence 기록을 통해 검사 할 수 있습니다. 우리가 처음 P (Per2)-D 루크의 기자 라인, 다음이 및 기타 circadian 기자의 현재 데이터의 생성을 설명합니다. 이러한 assays에서 3T3 마우스 섬유 아세포와 U2OS 인간의 osteosarcoma 세포는 세포 모델로 사용됩니다. 우리는 또한 circadian 연구에서 이러한 클럭 모델을 사용하여 다양한 방법에 대해 논의합니다. 여기에 설명 된 방법은 circadian 시계의 세포와 분자 기초를 공부하는 세포 유형의 훌륭한 다양한에 적용 할 수 있으며, 다른 생물 시스템의 문제를 태클에 유용 할 수 있습니다.

Protocol

1. Lentiviral 루시 페라 제 기자의 건설

포유류의 circadian 기자 구조는 일반적으로 circadian 발기인이 루시 페라 제 유전자와 융합되는 표현 카세트가 포함되어 있습니다. 모두 결합 및 재결합 기반의 전략은 일반적으로 DNA의 복제에 사용됩니다. 예를 들어, 여기에 우리는 불안정한 루시 페라 제 (D 루크)은 마우스 Per2 발기인의 통제하에 있습니다있는 P (Per2)-D 루크 lentiviral 기자를 생성하기위한 재조합 기반의 게이트웨이 복제 방법을 설명합니다.

  1. Per2 발기인의 복제. 앞으로 입문서 (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ')와 역 프라이머 (5'를 사용하여 상류 마우스 Per2 BAC 클론 9-13에서 전사 시작 사이트의, 526 BP의 Per2 프로모터 DNA 조각을 증폭하는 PCR를 사용하여 - CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 ')와 pENTR5'-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 클론 생성하기pENTR5'-P (Per2).
  2. D 루크의 복제. D 루크가 반딧불의 루시 페라 제 유전자와 이전에 21에 설명 된대로 빠른 단백질 저하를위한 C-터미널 해충 순서가 포함되어 있습니다. pENTR / DD 루크을 생성 할 pENTR / D-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 D 루크 DNA 조각 및 복제를 증폭 PCR을 사용합니다.
  3. 기자 벡터의 건설. lentiviral 대상 벡터 pLV7 - BSD (BSD, blasticidin 저항 유전자)와 두 pENTR의 plasmids, pENTR5'-P (Per2)와 pENTR / DD 루크, 혼합, 그리고 pLV7-BSD-P를 생성하는 Clonase를 사용하여 재조합 반응을 수행 (Per2)-D 루크 기자 (그림 1). pLV7-BSD는 마못 간염 바이러스가 포스트 전사 규제 요소 (WPRE) 시퀀스 (22)가 표현 CA의 하류 즉시 삽입 된에 pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen)의 수정 버전 (우리가 실험실에서 만든)입니다 유전자 발현을 향상시킬 수 ssette.

2. Lentiviral 입자의 생산

1. 종자 293T 세포 (일 1)

  1. 10% FBS와 1X 10cm 문화 요리에 페니실린 - 스트렙토 마이신-글루타민 (PSG)와 보충 정기적 DMEM의 90-100%의 합류로 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포를 성장. (낮은 통로 번호가 빠르게 성장하는 세포는 효율적인 transfection에 중요하다.)
  2. 이전 각도에 PBS에서 0.001 % 폴리-L-라이신의 1 ML를 추가하고 20 분 동안 실온에서 배양하여 transfection, 코트 6도 문화 판의 셀을 퍼 뜨리고 있습니다. 솔루션을 기음하고 사용하기 전에 1X PBS로 한 번 씻어.
  3. 트립신과 씨앗을 0.75로 293T 세포를 해리 X 10 2 ML 정기적 DMEM으로 사전 코팅 플레이트의 각도로 6 셀. 접시 철저하게 소용돌이 각 우물에 세포의도 분포를 얻을 수 있습니다. 37 ° C 하룻밤에 보육에 세포를 성장.
카포 4 / DNA 침전 (제 2 일)를 통해 tep "> 2. 과도 transfection

  1. 일 1 번 시드의 세포를 관찰. 세포는 80-90%의 합류에 도달해야합니다.
  2. 그리고 3 포장 벡터 (1.3 μg의 개그 / 폴, 0.5 μg, lentiviral 기자 플라스미드 DNA의 2 μg을 (류 연구실 예를 들어, pLV7-P (Per2)-D 루크)를 추가하여 1.5 ML의 microcentrifuge 관 플라스미드 transfection 믹스를 준비 레브, 그리고 0.7 μg의 VSVG, Invitrogen). transfection 및 그 이후의 감염 모두 제어, 우리는 일반적으로 CMV 프로모터의 제어에 따라 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 품고 lentiviral GFP의 발현 벡터에 대한 transfection에 추가 잘 pLV156-CMV-EGFP (그림 1A)를 포함 이전과 같이 20 설명했다.
  3. 2 단계에서 플라스미드 믹스에 0.25 M CaCl 2의 100 μl를 (2.5 M 주식에서 DNase / RNase 무료 ddH 2 O로 희석) 추가하고 철저하게 섞는다. 그런 다음 배 BBS 솔루션 100 μl (50 MM은 BE를 추가S, 280 MM NaCl, 1.5 2 HPO 4, 산도 6.95) 오세영 MM 부드럽게하지만 철저하게 섞는다. 15 분 동안 실온에서 DNA 믹스를 품다.
  4. 기다리는 동안, 293T 세포에서 미디어를 대기음 2 ML 신선한 매체로 변경합니다. transfection 전에 중간 pH를 평형 적어도 10 분 동안 인큐베이터에 판을 반환합니다.
  5. 드롭하여 293T 세포 드롭 3 단계에서 transfection 믹스를 추가합니다. 소용돌이 부드럽게 플레이트와 현미경 입자 형성을 관찰합니다. 5 % ° C 야간 CO 2, 37 품다. (카포 4 / DNA의 석출물의 미세 입자 형성, 효율적인 transfection에 중요합니다.)

3. 수확 바이러스 입자 (일 3-4)

  1. 정보 16시간 후 transfection (주 3) 어떤하여 시간 세포는 100 % 합류에 도달해야 세포에서 미디어를 대기음 2 ML 신선한 정기적 DMEM으로 교체하십시오. 37 ° C 하룻밤에 품다.
  2. 일 4 일 트란에 EGFP 표정을 관찰하여 transfection 효율을 평가sfection 제어 세포 (높은 EGFP 발현과 90-100%의 Transfection 효율이 좋은 바이러스 사립의 믿을 수 예측기입니다.)
  3. 분비 전염성 바이러스 입자를 포함하는 매체를 수집합니다. 잔여 293T 세포를 제거하고 바이러스가 포함 된 표면에 뜨는를 수집하는 5 분에> 2,000 XG에 원심 분리기. 또는 매체는 0.45 μm 멤브레인 필터로 삭제 될 수 있습니다. 바이러스 입자는 감염에 사용하기위한 준비가되어 있습니다.

3. 3T3 세포의 감염

1. 종자 3T3 세포 (3 일)

12 잘 접시에 플리트 (Split)와 3T3 세포의 씨앗이 적절한 수의 (~ 12,000) 다음 날인 20-30%의 합류를 얻을 수 있습니다. 37 ° C 하룻밤에 품다.

2. 3T3 세포를 (일 4) 감염

  1. 시드 세포를 관찰. 20~30% (50 % 미만)의 합류는 감염 원하는 있습니다.
  2. 바이러스를 포함하는 수집 된 매체에 5 μg / ML의 최종 농도에 polybrene을 추가입자. pipetting으로 잘 섞는다.
  3. 3T3 세포에서 미디어를 대기음, 잘 당 위의 바이러스 혼합물의 1 ML를 추가합니다. 37 ° C 하룻밤에 품다. (Polybrene는 감염 효율을 향상하는 데 사용됩니다,하지만 절대적으로 필요하지 않습니다. 그 어떤 세포에 독성이 될 수 있으므로, 사전에 테스트를 권장합니다.)

3. 감염된 세포를 (일 5 이후)을 선택

  1. 스물 네 시간 후 감염, 감염된 세포에서 바이러스와 polybrene를 포함하는 매체를 대기음, 1X PBS로 한 번 씻고, 신선한 매체에 변경합니다. 37 복구 및 성장 ° C 하룻밤에 품다.
  2. 언제 합류하면 (보통 1-2일 이상), 37 ° C 하룻밤에 세포와 배양을 분할.
  3. 다음 날, 기음 세포 (<50 % 합류가 원하는 경우)에서 매체와 안정적를 위해 선택할 수 10 μg / ML의 Blasticidin를 포함하는 새로운 매체로 교체가 세포를 transduced. (Blasticidin이 죽일 곡선 경험적으로 특정 세포 라인에 대한 결정해야합니다.)

4. 리포터 세포 Bioluminescence 기록

1. 시드 기자 세포

Blasticidin 방지 기자 세포를 전파하고 35 mm 문화 요리에 분할. 합류 할 때까지 37 ° C에서 알을 품다. 우리는 보통 circadian phenotyping 각 조건에서 각각 기자 셀 라인 ≥ 3 요리를 준비합니다.

2. 동기화 및 기록 매체로 변경

  1. 합류 기자 세포에서 미디어를 대기음, PBS로 한 번 씻고, 그리고 DMEM 10 μM forskolin (또는 200 nm의 dexamethasone)을 포함하는으로 대체합니다. 세포를 동기화 1 시간 37 ° C에서 알을 품다. (또는 셀은 온도 사이클 23 또는 혈청 충격 (24)에 의해 동기화 할 수 있습니다.)
  2. 기다리는 동안 기록을 준비다음과 같이 3T3 세포에 대한 ING 매체 : FBS, 1X 펜 / 패 혈성 / Gln, 1 μM forskolin, 1 MM luciferin, 25 MM HEPES, pH를 7.4 10 %를 포함 1X DMEM (HyClone). 세럼과 forskolin 농도는 경험적으로 결정될 수있다. 매우 희미한 세포를 들어, 페놀 붉은 무료 매체를 사용할 수 있습니다.
  3. forskolin 치료의 끝에서, 미디어를 기음과 갓 만든 기록 매체를 교체하십시오.

3. 기자 세포의 Bioluminescence 기록

  1. 중간 변경 후, 증발을 방지하기 위해 진공 그리스와 장소에서 40mm 멸균 coverslips 및 인감과 문화 요리를 다룹니다.
  2. H 2 O 나 CO 2가 36 ° C에서 보육 세트 내부에 보관되어 LumiCycle의 luminometer,에 요리를로드합니다.
  3. 실시간 bioluminescence 녹화를 시작합니다. 우리는 보통 두 번째 주에 대한 중간 변화와 연속 녹화 (Savelyev 외를 참조하십시오. 자세한 내용은) 25 다음 1 주일 동안 리듬을 기록합니다. (96 - 우리의 기록을 위해붙인다 접시, 시너지 SL2는 녹음 장치로 사용되었다가, 세부 사항에 대한 토론 1.1을 참조).

5. 데이터 분석 및 프리젠 테이션

리포터 전지는 circadian 시계 기능에 phenotypic 효과를 결정하는 중요한 고해상도 정량 발광 녹음을 용이하게합니다. 상 기간 길이, 리듬 진폭과 감쇠 속도 등의 circadian 매개 변수를 얻으려면, 우리는 bioluminescence 데이터에게 5,14를 분석 할 수있는 LumiCycle 분석 프로그램 (Actimetrics)을 사용합니다. 간단히, 원시 데이터는 기준선 먼저 장착되어 있습니다, 그리고 기본-빼는 데이터는 매개 변수가 결정되는에서 사인 웨이브에 장착되어 있습니다. 영구적 인 리듬,> 90 % 이내 달성의 신 -의 - 피팅을 보여 샘플하십시오. 중간 변경시 높은 과도 bioluminescence로 인해, 우리는 보통 분석에서 데이터의 첫 번째 사이클을 제외 할 수 있습니다.

데이터 프리젠 테이션 위해, 우리는 일반적으로 TI에 대한 원시 데이터 (bioluminescence, 카운트 / 초)를 타게나 (일). 필요한 경우 기본 - 공제 데이터는 진폭 및 위상을 비교 해본 할 수 있습니다.

6. 대표 결과

1. 단계 별 circadian 기자

circadian 시계는 생화학 부정적인 피드백 메커니즘 하나에 기반을두고 있습니다. 핵심 피드백 루프는 리듬 유전자 발현을 (아침 단계, 예를 들어, 레브-erb α 포함) 생산 circadian E / E' 박스 증강 요소에 따라 행동 전사 activators BMAL1와 시계, 그리고 repressors 인용과 CRYs로 구성되어 있습니다. 핵심 루프는 적어도 두 개의 다른 circadian CIS 요소, DBP/E4BP4 바인딩 요소 조절과 통합 (D-상자를, 일 단계, 예를 들어, Per3 용), 밤 단계에 있으며, ROR / 레브-ERB 바인딩 요소 (RRE 예를 들어, Bmal1) 17. 여러 circadian 요소의 조합 규제 소설 중간 단계를 생성 할 수 있습니다. 예를 들어, Cry1 transcrip기는 별개의 Cry1 저녁 시간 단계 13 상승을주는 세 가지 circadian 요소 (Cry1 유전자의 첫 번째 인트론의 발기인 및 RREs에서 즉, E / E'-상자 및 D-상자 요소)에 의해 중재된다.

유전자 규정의 이러한 메커니즘을 바탕으로, 우리는 네 가지 기자 구조 생성 : P (Per2)-D 루크와 P (Cry1)를 E / E'-상자 및 규제 지역 17 D-상자 요소를 모두 포함하는-D 루크 기자, 26,27, P (Cry1) - 모든 세 가지 요소에 의해 조합 규정 (즉, E / E' 박스, D-상자, RRE) 13,17을 대표하는 인트론-D 루크, 그리고 P (Bmal1)-D 루크 규제 독점적으로 RRE 9,17,19,21으로. 우리는 기자 식의 예상 독특한 단계 (그림 2)을 생산하기 위해 3T3 세포로이 기자를 소개했다.

2. RNAi와 pharmacologically acti을 통해 유전자 최저화합물이 있어요

transfection 효율이 높은 경우, 합성 siRNA는 transiently 유전자 발현을 노크 셀로 transfected 수 있습니다. transfection이 기술적으로 어려운 경우, shRNA의 발현 벡터는 세포에 의해 생성 shRNA이 유전자 최저 (KD)에 대한 siRNA를 처리되므로, 안정적으로 lentiviral 감염을 통해 세포에 transduced 할 수 있습니다. 여기 pLL3.7 게이트웨이 발현 벡터 9 (그림 3B)를 사용하여 3T3 세포에 U2OS 세포에서 siRNA (그림 3A)과 shRNA를 사용하여 Cry1과 Cry2 유전자의 KD 효과를 제시한다. 3T3 세포뿐만 아니라, U2OS 모델은 상용화 인간의 siRNA 라이브러리 높은 처리량 검사 (예를 들어, 인간의 기원, 강력한 circadian 리듬의 검증 기능을 생성 할 수에 대한 주요 요구 사항을 충족 크게하기 때문에 또 다른 걸출한 세포의 시계 모델이되었습니다 모든 알려진 시계 유전자, 그리고 고효율 transfection 및 의무양적 발광 기록). 두 세포 유형에서 RNAi로 인한 KD은 이전 마우스 녹아웃 (KO)와 셀룰러 KD 연구 5,10,11,28과 일치 클럭 phenotypes하게되었습니다. 예를 들어, Cry1 KD 단축 기간의 길이와 리듬 지속성을 감소는 Cry2 KD는 기간을 길게 반면. 또한, 선택 작은 분자 pharmacologically 표적을 교란 단백질 기능 (그림 3C)에 사용할 수 있습니다.

그림 1
1 그림. lentivirus로 인한 유전자 전달 시스템. 이 lentiviral P (Per2)-D 루크의 기자 벡터와 CMV-EGFP의 (A) 도식 다이어그램 구성합니다. 숙주 세포의 게놈에 통합 만이 지역이 표시됩니다. 두 기자 구조에서 D 루크의 전사는 Per2 발기인 직접 통제하에 있습니다. pLV7-BSD-P (Per2)-D 루크 벡터 (재에서조합 기반의 복제), coexpressed Blasticidin 저항 유전자 (BSD)는 감염된 세포의 선택을 용이하게합니다. pLV156-P (Per2)에서-D 루크 벡터 (결합 기반 복제)은 EGFP 번역은 시각적 관찰과 감염된 세포의 분류 FACS을 허용, 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES) D 루크의 하류에 의해 중재됩니다. 또한,이 SV40 프로모터 / 터미네이터 (P / T)은 절연체 (토론 1.3 참조)로 사용됩니다. CMV-EGFP 제어 벡터에서 EGFP 표현은 강한 CMV 프로모터의 제어 아래에 있습니다. transfected하고 감염된 GFP-표현 세포의 (B) 형광 이미지. 일반적으로, 우리는 293T 세포의 과도 transfection과 이러한 셀에 GFP 표현으로 표시 우리의 관심의 세포 라인의 lentiviral 감염 모두에서 높은 효율을 얻을 수 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2 그림 2. 3T3 세포의 bioluminescence 기자의 단계 별 표현이 실험에 사용 된 lentiviral 기자 벡터가 pLV7-BSD-P (Per2)-D 루크, P (Cry1)-D 루크, P (Cry1) -. 인트론-D 루크, 와 P (Bmal1)-D 루크. 각 기자는 화살표로 표시 진동의 고유 한 위상을 전시하고 있습니다. Per2 및 아침 일 단계 밤 단계에서 Bmal1 발기인, P (Cry1)에 의한 조합 규정에 Cry1 추구하는 드라이브 피크 bioluminescence는 있지만 - 인트론은 E-상자를 품고, D-상자, RRE 요소는 최대 bioluminescence의 저녁 단계를 수여 . 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 기자 세포의 circadian bioluminescence 리듬의 유전자와 약리 섭동. (A) Cry1의 효과와 U2OS 기자 세포의 세포 리듬에 siRNAs로 Cry2 최저. LumiCycle의 luminometer는 35mm 요리 세포의 bioluminescence 기록을 위해 사용되었다. 그림이 구성된다 참조 Elsevier (2009 년)의 허가와 # 10. 3T3 기자 세포의 세포 리듬에 shRNAs의 Cry2 최저의 (B) 효과.에서 U6-shRNA 카세트를 포함하는 pLL3.7 게이트웨이 벡터는 Cry2 유전자 최저 사용되었다. shRNA2 서양 얼룩 분석 (데이터가 표시되지 않음)에 의해 결정으로 shRNA1보다 최저 효율을 갖추고 있습니다. 시너지 luminometer는 96 - 웰 플레이트에 세포의 bioluminescence 기록을 위해 사용되었다. 레코딩을위한 설정은 다음과 같습니다. 보육 온도 33 ° C, 적분 시간, 15 초, cel에 작은 분자 억제제의 간격 시간, 30 분 (C) 효과U2OS 기자 세포의 lular 리듬. Chir99021 및 Roscovitine는 각각, GSK-3와 CDK에 대한 감독 억제제입니다. ViewLux 시스템 (Chir99021 검정)과 Tecan의 luminometer (Roscovitine 검정)는 384 잘 접시에 세포의 bioluminescence 녹음을 위해 사용되었습니다. 그림은 참조 # 19 (과학 저작권 2008 국립 아카데미, USA)에서 구성된다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

1. 현재 프로토콜에 대한 수정

1.1 녹화 장치 및 처리량을 고려

때문에 그 상업적 가용성, LumiCycle (Actimetrics)는 실시간 녹화 4,5,9,19,29-31에 가장 일반적으로 사용되는 자동화 된 luminometer 장치가되었습니다. LumiCycle은 매우 높은 감도와 낮은 노이즈 14 제공 빛 감지기로 광전자 증 튜브를 (PMTs) 고용, 따라서 매우 희미 루시 페라 기반 bioluminescence의 데이터 수집에 적합하다. 기타 유사한 PMT 기반의 장치 (예를 들어, 크로노스, 아토 (주) 및 POLARstar Optima, BMG labtech 주식회사) 많은 연구 32,33에서도 사용되었습니다.

35 mm 요리를 사용하여 LumiCycle 분석은 96에 적용 할 수 있습니다 - 384 - 높은 처리량 검사 (HTS) 실험 또는 1152 - 잘 플레이트 형식은. 1 : HTS 분석 개발은 주로 다음과 같은 두 가지 측면에 초점을 맞추고) 더 나은 기자 밝아 루시 페라 제 및 / 또는 그 이상의 기자 표현 (아래 참조) 셀 및 2) 멀티 잘 접시를 수용 매우 민감한 기록 장치. 우리와 다른 사람들은 이러한 시너지 SL2 (BioTek), 무한 M200 (Tecan) 19, TopCount (PerkinElmer) 28, 그리고 구상 (Perkin 엘머) 34 등 여러 microplate 리더를 사용했습니다. 우리 연구실에서 LumiCycle 및 시너지 장치 모두 온도 조절과 빛 - 꼭 보육에 배치됩니다. 자원이 허용하는 경우 또는, 기록 단위는 온도 조절 방에 배치 할 수 있습니다. HTS를 들어, 통합 / 노출 시간과 시간 지점 사이의 간격과 같은 중요한 설정은 해당 기자 및 녹화 장치 경험적으로 결정해야합니다.

LumiCycle 분석은 단일 셀 해상도에서 공간 정보를 제공하지 않습니다. 야마구치 외. 35 웨일스어 외. 4,5는 INT에서 실시간 bioluminescence 이미징을 개척단일 셀 해상도를 달성하기 매우 민감한, 낮은 노이즈 CCD 카메라 15 특별히 고안된 현미경을 egrating. 최근에는 더 민감 이미징 시스템 LV200 (올림푸스)과 CCD와 다색 필터에게 36,37을 곱한 ultrasensitive 냉각 및 백 조명 전자와 CellGraph (AB3000-B, 아토)를 포함하여 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이미징는 예보다 정교한 HTS 실험, GNF 자동화 된 로봇 시스템 (GNF 시스템)와 결합 ViewLux CCD 영상 (Perkin-엘머)에 사용되었습니다. 이 시스템은 클럭 기능 10,12,19 영향을 미치는 새로운 유전자와 작은 분자에 대한 대규모 스크린을 사용하도록 설정했습니다.

1.2 루시 페라 제 기자

Luciferases 먼저 식물과 시아 노에서 1990 년대 초 circadian 유전자 표현의 실시간 발광 녹음에 사용되었으며, 일반적으로 2000 29,35,38-40 (이후 포유류의 시스템에 사용 된LSO)는 리뷰 14,15를 참조하십시오. 루시 페라 기자는 일반적으로 훨씬 낮은 배경 41으로 인해 같은 GFP와 같은 형광 기자보다 독성 더 민감합니다. 가장 일반적으로 사용되는 발광 생물 기자는 반딧불 (Photinus pyralis) 루시 페라 제 (루크 +) 기본 루크의 코딩 영역이 최적의 전사와 번역으로 바뀌 었습니다 된 pGL3 벡터 시리즈 (Promega)에 건립.입니다 반딧불 루시 페라와 매우 안정적이고 세포 투과성 기판, D-luciferin의 조합은 장기적으로 녹음에 이상적입니다. D 루크가 루크의 수정 된 버전입니다 + 빠른 단백질 저하 할 수 있도록하기 위해 C-말단에 융합 해충 순서로. 더 향상된 버전, Luc2은 높은 정확성과 변칙 표정으로 pGL4 벡터 시리즈 (Promega)에 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리는 transiently transfected의 룩 +와 Luc2 사이의 성능에 상당한 차이를 관찰하지 않았다 3T3와 U2OS 세포 (데이터 표시되지 않습니다.) 최근 보고서에서 브라질 클릭 벌레 루시 페라 제 (E 루크)는 단일 세포 영상 42에 적합한 룩 +보다 훨씬 밝은 신호를 전시 게재되었습니다.

많은 최근의 연구는 mPER2의 장점을 데리고 :: 루크 융합이 노크 인 기자 마우스 4,5,9,19,25,29-31,43. 이 기자 시스템은 SCN을 포함한 세포 및 조직의 explants의 circadian phenotyping 수 있습니다. 이전 연구에서, 우리는 behaviorally 특징 시계 유전자 knockouts의 많은으로이 기자 마우스 선을 넘은 및 SCN, 간, 폐 explants 배양 예를 생체에 bioluminescence 리듬의 역학을 조사하고, dissociated SCN의 뉴런과 체외 4 배양 섬유 아세포에서 5,9,31. 이러한 연구는 우리가 셀 organismal 수준의 클럭 동작의 분자 세부 사항에 중요한 통찰력을 얻을 수있었습니다.

1.3 유전자 전달 방법

그들이 과도 transfection 11,13,16,17 또는 lentiviral 전달 5,9,18을 통해 다양한 세포 유형으로 도입 될 수 있으므로 e_content "> 벡터 기반의 클럭 기자가 좋은 기능성을 제공합니다. 성가신 적은 재현, transiently transfected 세포 수는 있지만 또한 안정적인 셀 행을 생성하기 위해 항생제의 지속적인 존재에서 성장한다. Lentiviral 벡터가 아직 있기 때문에 세포의 게놈뿐만 아니라 효율성과 기능성에 자신의 안정적인 통합의 선호된다. 감염된 세포가 될 수있는 위의 제시 한 pLV7 벡터 외에 항생제로 선정, 우리는 다른 벡터를 사용했습니다. 예를 들어, pLV156-P (Per2)-D 루크 벡터 P (Per2)-D 루크-IRES-EGFP 표현 카세트 EGFP 변환 내부 ribosome 항목에 의해 중재되는이 포함되어 integrat과 세포의 시각적 관찰과 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 허용하는 D 루크의 사이트 (IRES) 하류,에드 벡터 5 (그림 1) (아래 참조). 통합 사이트 효과, 제정 발기인 및 종결 (P / T)에서 기자를 보호하기 위해 절연체로 소개하거나 미끼 바로 상류 P (Per2)-D 루크의 기자 표현 카세트 (예 :의, 아래 그림 1A에 구축 할 수 있습니다 )과 같은 브라운 외. 18 류 외에 의해보고 5.

이전 연구는 생체에 및 / 또는 예 생체 44-48 두 조직 별 유전자 섭동의 탐구를위한 토대를 설립했다. 예를 들어, 바이러스 입자는 SCN 슬라이스 준비 다음 SCN 지역에 주입 할 수 있습니다. 예를 생체 분석에 이어 생체에서이에 대한 대안으로, SCN 슬라이스가 높은 titer 바이러스와 배양 한 다음, 첫 번째와 교양 예를 생체 해부 할 수 있습니다. 그러나, 상대적으로 두꺼운 조직 슬라이스의 낮은 감염 효율로 인해,매우 일관성 전 생체 프로토콜 개발 될 남아있다.

셀 라인과 녹음 조건의 1.4 선택

3T3 마우스 섬유 아세포 16,17, U2OS 인간 osteosarcoma 세포 10,11,19,28, 및 마우스 섬유 아세포 마우스 9,13에서 파생 : 대부분 우리가 시계 메커니즘의 생화학 및 세포 생물학에 대해 알고 무엇의 세 세포 모델을 기반으로합니다 34. lentiviral 벡터 시스템은 포유류의 세포를 나누어 비 나누어 모두의 호스트 게놈에 효율적으로 전달하고 안정적​​인 통합을 허용, 따라서 과도 transfection에서와 같은 특정 세포 유형으로 제한되지 않습니다. 휴대폰과 생리적 반응의 다양한 범위의 규정에 circadian 시계의 역할을 감안할 때, 앞으로 연구가 확실히 마우스에서 파생하거나 상업적으로 이용 가능한 세포 라인 또는 기본 세포, 세포 유형의 다양한으로 연장됩니다. 이러한 세포 자치 클럭 연구 조직 - ubiqu를 발견 도움이 될 것입니다circadian 시계의 itous뿐만 아니라, 조직 별, 속성.

이 기자 세포를 생성하는 것은 (예를 들면, 다양한 벡터 및 발기인 종류) 다른 기자의 경험적 테스트를 필요로하고, 때로는 더 최적화 할 수 있습니다 점을 지적 가치가있다. 모든 세포 유형의 세포 자율적 리듬을 갖추고 있습니다. 세포 건강과 세포 리듬의 지속성, 기록 매체의 최적화를 개선하려면 자주 필요합니다. 다음과 같은 예를 들어, 3T3 기록 매체의 대안으로, U2OS 전지에 사용되는 기록 매체는 다음과 같습니다 1X DMEM (Invitrogen), 2 % B-27, 1 μM forskolin, 1 MM luciferin, 14.5 MM NaHCO3, 10 MM HEPES (산도 7.2). 1 ㎜ luciferin는 일반적으로 충분하지만, 최종 농도 (0.1-1 MM)은 각 셀 / 기자 유형에 대해 결정될 수있다. Forskolin가 필요하지 않을 수도와 그 농도는 경험적으로 각 셀 유형에 대한 결정 될 수 있습니다.

lentiviral 사립의 1.5 Transfection 효율

높은 TR293T 세포의 ansfection 효율은 좋은 바이러스 사립에 중요합니다. 주요 고려 사항은 transfection 시약의 293T 세포와 선택의 건강이 포함되어 있습니다. 293T 세포는 매우 몹시 신경을 쓰는 수 및주의 취급을 필요로 할 수 있습니다. 따라서, 세포의 성장 속도와 형태는 신중하게 모니터링해야합니다. 일관성을 위해, 혈청을 테스트 할 첫 번째와 세포를 유지하기위한 이후 사용 된 것과 같은 테스트를 배치하는 것이 좋습니다. 우리는 항상 새로운 배의 BBS와 CaCl 2 재고 솔루션을 테스트하고 높은 통로 번호 및 / 또는 느린 성장 속도가 사용할 수 없습니다 표시의 0.25 M. 셀 주위에 CaCl 2의 작업 농도를 최적화 할 수 있습니다. 293T 세포는 쉽게 transfection의 시약들과 transfectable 있습니다. 카포 4뿐만 아니라, 우리는 또한 Fugene 6 (로슈 또는 Promega) 또는 Lipofectamine-2000 (Invitrogen)로 우수한 transfection 효율을 달성했습니다. 이러한 지질 기반 transfection (lipofection) 시약은 더 비싼하지만, 카포 4보다 더 나은 transfection의 일관성을 제공합니다. 정R 대규모 lentiviral 최상의 상태로 준비합니다, 우리는 낮은 비용으로 transfection에 대한 CaPO4를 사용하는 것이 좋습니다.

clonal 세포 라인의 1.6 세대

취소 집중 원유 바이러스 입자는 상대적으로 낮은 titer (10 6 바이러스 입자 / ML)로하며,에서 기자 표현식은 세포가 낮은 transduced. 이 LumiCycle 기록 등의 대부분의 응용 프로그램에 충분하지만, 밝은 기자는 종종 필요한 덜 민감 녹음 장치를 사용하여 높은 처리량 assays에서 예를 들어 있습니다. 리포터 표현은 높은 titer 바이러스 최상의 상태로 준비를 사용하여 증가 할 수 있습니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 transfection에 대한 큰 문화 혈관 한테 그런 as15 cm 요리를 사용하고, 일 4 일 5 회 미디어를 수집하는 것이 좋습니다. 10 배 농도 (10 7 바이러스 입자 / ML)의 경우, 원심 필터 장치 (Millipore)를 사용하여 여과를 수행합니다. 이전에 설명 된대로 100x 이상의 농도 (≥ 10 8 바이러스 입자 / ML)의 경우, ultracentrifugation을 수행 5,18 같은 주요 circadian 매개 변수를 변경하지 않습니다 지적합니다. 동질적인 셀 인구가 필요하다면, clonal 셀 라인 96 - 웰 플레이트에 정렬 FACS 기반의 단일 셀에 의해 얻을 수있다. 그러나, 이러한 clonal 세포가 신중하게 검토하는 것이 중요합니다, 세포 형태는 부모 세포로부터 구별해야합니다, 그리고 시대의 길이와 진폭과 같은 클럭 속성은 감염된 세포 인구를 대표한다.

2. 셀 - 자치 리포터 시계 모델의 응용

조직 또는 동물 모델과는 달리, 셀 기반 모델은 유전과 pharmacologic 섭동 의무가 있으며, 필요시도 HTS 형식으로 사용합니다. 유전자 기능의 섭동이 이상 표현이나 RNAi로 인한 최저에 의해 달성 될 수있다. 선택적 작은 분자는 단백질 기능을 방해 할 수 있습니다. 여기 우리가 곧 Dcircadian 연구 셀 자치 클럭 모델의 일부 사용을 iscuss.

핵심 시계 메커니즘 2.1 연구

셀 - 자치 클럭 모델은 크게 기계론의 연구를 촉진하고 있습니다. Hogenesch와 동료 CRYs에 의한 피드백 억압은 시계 기능 16 및 시계 기능 (11)의 시스템 레벨 속성을 조사 할 수있는 U2OS 모델에 필요한 표시 할 3T3 모델을 사용했습니다. 레브 - erbα와 β가 중복 역할을 것을 보여주기 위해 섬유 아세포 모델 - Cry2-/ - 그 지연 피드백 억압은 클럭 기능 13이 필요합니다 보여 쥐에서 파생 된 섬유 아세포 모델, Bmal1-/ : - 우리는 Cry1-/를 고용 RRE로 인한 리듬 유전자 발현을 조절, 그 Bmal1 리듬은 매우 핵심 클럭 기능 9 필요하지 않습니다. 또한, 기자 세포의 화학 검사는 식별 및 / 또는 GS의 기능을 설명 수K-3 β (기간 단축시 어리둥절) 19, CK1σ와 ε (어리둥절했을 때 기간이 길어) 49, 그리고 CK1α 12. 아래에 설명한 바와 같이,이 모델은 추가 클럭 구성 요소의 식별을 용이하게합니다. 전략적으로,이 세포 모델은 다음 생체 검증 및 탐사에 대한 새로운 진입 점을 제공하는 기본 메커니즘의 빠른 발견에 대한 더 많은 다루기 쉬운 수 있습니다.

시계 요인 2.2 식별

핵심 피드백 루프뿐만 아니라, 시계 메커니즘은 다양한 신호 및 규제 요소를 통합합니다. 추가 클럭 구성 요소와 수식을 식별를 들어, 셀 자치 클럭 모델은 고유 lethality, pleiotropic 효과 및 돌연변이 동물 모델 50과 관련된 발달 유전자 보상으로 인해 쥐 유전자 검사를 통해 유리합니다. 기능 유전체학 appro와 함께 셀 기반 스크린,통증은 효과적으로 소설 클럭 요인 10,28의 식별을위한 화면 게놈 전체의 siRNA와 shRNA 라이브러리에 높은 처리량 기록 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 마찬가지로, 하나는 시계 기능 12,19,34,49에 미치는 영향을 연구하기 위해 다양한 작은 분자에 대한 화학적 생물학적 접근 방식과 화면을 채용 할 수 있습니다. 주요 시계 유전자와 기능이 확인되었습니다 만,이 화면 시계의 규정 또는 변조에 관련된 추가 구성 요소 또는 조절 것으로 나타났습니다. 이 수식의 대부분은 동기 또는 비동기 신호 (클럭 입력)의 신호 전달을 통합의 특정 modalities을 나타냅니다.

클럭 출력 2.3 연구

생체의 거의 모든 세포가 circadian 시계가 있지만, 체외에서 배양 세포는 반드시 명백한 circadian 리듬을 표시하지 않습니다. 이러한 맥락에서, 기자 접근 여부를 테스트 할 수있는 유용한 도구를 제공합니다시계 메커니즘은 특정 세포 유형에 존재합니다. 셀 - 자율 시계 메커니즘의 존재는 microarray 또는 RNA 시퀀싱 51,52, 전사 규제 네트워크, 프로테옴 및 metabolome에 의한 transcriptome을 포함한 이들 세포에서뿐만 아니라 생체 내 조직의 클럭 출력의 연구를 보증합니다. 이러한 연구는 게놈 전체의 RNA와 단백질 표현 패턴을 확인하므로 반드시 내생 표현을 반영하지 않는 셀 기반의 발광 기자의 assays를 보완합니다.

3. 셀 - 자치 클럭 모델의 의의

SCN 내의 다른 세포와 조직 유형에 걸쳐 circadian 기능의 조정은 정상 생리학 30의 중요한 측면이다. 중앙 SCN 및 주변 시계는 전체 circadian 조직의 모든 필수 부분입니다. SCN 직접 어둠 / 빛 사이클에 대한 생물학적 사이클이 바뀌다에 망막에서 광 입력을 받고, 그리고에 코디네이터 역할을neuronal과 호르몬을 모두 연결을 통해 주변 장치 클럭을 동기화합니다. 내부 동기화뿐만 아니라, 주변 조직과 세포 내에서 분자 시계는 궁극적으로 생리학과 행동에 명백한 circadian 리듬을 적용 전사 출력 네트워크의 수많은을 orchestrates.

따라서, 조직 및 지역 신호 모두 circadian 생리를 조절하고, 간접적으로 SCN에서 냄새가 나는데 전신 신호에 의해 규제 이러한 비교 셀 자율적 시계에 의해 직접 규제 circadian 유전자를 발굴 할 필요가있다. 주변 시계의 역할은 조직의 영향이 제거되는, 셀 자치 클럭 모델에서 공부 할 수 있습니다. 간의 경우에는 조직 별 규제 네트워크는 지역의 생리학 51,53의 리듬을 생성합니다. 체외과 생체 리듬 circadian에 비교하여, 우리는 세포 자치와 조직 큐 기반 클럭 기능을 구별 할 수있을 것입니다. 사실, recent 연구 간 유전자 발현 6,51,52에 간 클럭을위한 중요한 역할을 나타 내기 위해 시작했습니다. 다른 생리 출력을 대표하는 다양한 조직과 세포 타입 별 클럭 모델의 필드 보증 개발의 미래 연구.

시계 메커니즘의 생화학 및 세포 생물학의 이전 연구는 주로 세포 및 조직, 특히 3T3 등의 종류, U2OS, 마우스 섬유 아세포, 간 제한된 수의에 의존하고 있습니다. 대부분의 circadian 연구에 암시 적 가정 클럭은 일반적으로 7 모든 셀에 보편적으로 적용 할 수 간주됩니다 한 셀 또는 조직 유형에 따라 결정 모든 세포 및 조직 유형과 유전자 기능에 동일한 방식으로 작동한다는 것입니다. 그러나, 더 셀 자치 클럭 모델을 구축하고 특성화하여, 미래의 연구는 로컬 circadian 생물학의 근간이 조직 특정 클럭 속성을 발견 할 것으로 기대됩니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (IOS-0920417) (ACL)에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201
B-27 Invitrogen 17504-044
D-Luciferin Biosynth L-8220
Poly-L-lysine Sigma P4707
Polybrene Millipore TR-1003-G
Forskolin Sigma F6886
All other chemicals Sigma
Equipment
Tissue culture incubator 5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics

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References

  1. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
  2. Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
  3. Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
  4. Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
  5. Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
  6. Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34 (2007).
  7. Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
  8. DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
  9. Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023 (2008).
  10. Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
  11. Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52 (2009).
  12. Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559 (2010).
  13. Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
  14. Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
  15. Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
  16. Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
  17. Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
  18. Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338 (2005).
  19. Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
  20. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
  21. Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
  22. Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
  23. Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
  24. Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
  25. Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439 (2011).
  26. Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
  27. Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
  28. Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
  29. Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
  30. Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
  31. Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513 (2010).
  32. Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
  33. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136 (2006).
  34. Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
  35. Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
  36. Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
  37. Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
  38. Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
  39. Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
  40. Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
  41. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 369-385 (2011).
  42. Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011 (2010).
  43. Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28 (2009).
  44. O'Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
  45. Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
  46. Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
  47. Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
  48. Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
  49. Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
  50. Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
  51. Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442 (2009).
  52. Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
  53. Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).

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루시 페라 제 Bioluminescence 기자를 사용하여 유전자 발현의 셀 자치 Circadian 시계 리듬을 모니터링
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Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).

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