Overvågning Cell-selvstændige døgnrytmen ur Rhythms of Gene Expression Brug Luciferase bioluminescens Reporters

Summary

Døgnrytmen ure fungerer i de enkelte celler, dvs, de er celle-autonome. Her beskriver vi metoder til at generere celle-autonome ur modeller bruger ikke-invasiv, luciferase-baseret real-time bioluminescens teknologi. Reporter celler giver medgørlig, funktionelle modelsystemer til at studere døgnrytmen biologi.

Abstract

Hos pattedyr, er mange aspekter af adfærd og fysiologi, såsom søvn-vågne cyklus og lever metabolisme reguleres af endogene døgnrytmen ure (revideret ^1,2). Den circadian tidtagning systemet er en hierarkisk multi-oscillator netværk med den centrale ur placeret i suprachiasmatic kerne (SCN) at synkronisere og koordinere ekstra-SCN og perifere ure andetsteds ^1,2. Individuelle celler er de funktionelle enheder til generering og vedligeholdelse af cirkadiske rytmer ^3,4, og disse oscillatorer i forskellige vævstyper i organismen deler en bemærkelsesværdigt ens biokemisk negativ feedback-mekanisme. Men på grund af vekselvirkninger på det neurale netværk niveau i SCN og gennem rytmiske, systemiske tidskoder på organismal niveau, er døgnrytmen på organismal niveau ikke nødvendigvis celle-autonome ^5-7. Sammenlignet med traditionelle undersøgelser af lokomotorisk aktivitet in vivo og SCN eksplantater ex vivo, cell-baserede in vitro assays mulighed for opdagelsen af celle-autonome cirkadiske defekter ^5,8. Strategisk celle-baserede modeller er mere eksperimentelt medgørlig for fænotypisk karakterisering og hurtig opdagelse af grundlæggende ur mekanismer ^5,8-13.

Fordi døgnrytmer er dynamiske, er langsgående målinger med høj tidsopløsning nødvendig for at vurdere urfunktion. I de senere år har real-time bioluminescens optagelse ved hjælp ildflueluciferase som journalist blevet en fælles teknik til at studere døgnrytmen hos pattedyr ^14,15, da det giver mulighed for undersøgelse af persistens og dynamik af molekylære rytmer. At overvåge celle-selvstændige døgnrytmer for genekspression, kan luciferase reportere indføres i celler via transient transfektion ^13,16,17 eller stabil transduktion ^5,10,18,19. Her beskriver vi en stabil transduktion protokollen med lentivirus-medieret genlevering. THan lentiviral vector system er overlegen i forhold til traditionelle fremgangsmåder, såsom forbigående transfektion og kimcellelinjetransmission grund af dens effektivitet og alsidighed: den tillader effektiv levering og stabil integration i værtsgenomet af både delende og ikke-delende celler ^20. Når et reporter-cellelinien er etableret, kan dynamikken i urfunktion undersøges gennem bioluminescens optagelse. Vi først beskrive generation af P (Per2)-d Luc reporter linjer, og derefter præsentere data fra denne og andre cirkadiske journalister. I disse assays er 3T3-musefibroblaster og U2OS humane osteosarcomceller anvendes som cellulære modeller. Vi diskuterer også forskellige måder at bruge disse ur modeller i cirkadiske undersøgelser. Fremgangsmåder beskrevet her kan anvendes til en lang række celletyper til at studere cellulære og molekylære basis for døgnrytmen ure, og kan være nyttig i løse problemer i andre biologiske systemer.

Protocol

1. Konstruktion af lentiviral Luciferase Reporters

Et pattedyr cirkadiske reporterkonstruktion indeholder sædvanligvis en ekspressionskassette, hvor en cirkadisk promotor fusioneret med luciferasegenet. Både ligerings-og rekombination-baserede strategier er almindeligt anvendt til DNA kloning. Som et eksempel har vi her beskrive en rekombination baseret Gateway kloning fremgangsmåde til frembringelse af en P (Per2)-d Luc lentiviral reporter, hvor den destabiliserede luciferase (d Luc) er under kontrol af muse Per2 promotoren.

1. Kloning af Per2 promotoren. Bruge PCR til at amplificere Per2 promotor-DNA-fragment på 526 bp opstrøms for transkriptionsstartstedet fra en mus Per2 BAC klon ^9-13, ved anvendelse af en fremadrettet primer (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') og en revers primer (5'- -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), og klon i pENTR5'-TOPO-vektoren (Invitrogen) til frembringelsepENTR5'-P (Per2).
2. Kloning af d Luc. Den d Luc indeholder ildflue-luciferase-genet og en C-terminal PEST-sekvens for hurtig proteinnedbrydning som tidligere beskrevet ^21. Bruge PCR til at amplificere d Luc DNA-fragment, og klon i pENTR / D-TOPO-vektoren (Invitrogen) til frembringelse pENTR / Dd Luc.
3. Konstruktion af reportervektor. Blande de to pENTR plasmider, pENTR5'-P (Per2) og pENTR / Dd Luc, med den lentivirale destination vector pLV7-Bsd (Bsd, blasticidin-resistensgen), og udfører rekombination under anvendelse Clonase at generere en pLV7-Bsd-P (Per2)-d Luc reporter (figur 1). pLV7-Bsd er en modificeret version (fremstillet i vores laboratorium) af pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), hvor skovmurmeldyr hepatitis virus post-transkriptionelle regulatoriske element (WPRE) sekvenser ²² blev indsat umiddelbart nedstrøms for ekspressionen ca ssette at øge genekspression.

2. Fremstilling af lentivirale partikler

1. Frø 293T celler (dag 1)

1. Grow humane embryoniske nyre (HEK) 293T-celler til 90-100% konfluens i regelmæssig DMEM suppleret med 10% FBS og 1x penicillin-streptomycin-glutamin (PSG) på 10 cm dyrkningsskåle. (Hurtigt voksende celler med lav passage nummer er kritiske for effektiv transfektion.)
2. Forud for podning af cellerne for transfektion coat 6-brønds dyrkningsplader ved tilsætning af 1 ml 0,001% poly-L-lysin i PBS til hver brønd og inkuberes ved stuetemperatur i 20 min. Aspirer opløsningen og skylles en gang med 1 x PBS før brug.
3. Dissocierer 293T celler med trypsin og frø 0,75 x 10 ⁶ celler på hver brønd af de præcoatede plader med 2 ml regelmæssig DMEM. Swirl pladerne grundigt for at opnå en jævn fordeling af celler i hver brønd. Dyrke cellerne i inkubator ved 37 ° C natten over.

TEP "> 2. Transient transfektion Via Capo ₄ / DNA-fældning (dag 2)

1. Overhold de podede celler fra dag 1. Cell bør nå sammenløbet af 80-90%.
2. Fremstilling af plasmid transfektion blandes i et 1,5 ml mikrocentrifugerør ved tilsætning af 2 ug af en lentiviral reporterplasmid-DNA (f.eks pLV7-P (Per2)-d Luc, Liu lab) og de ​​3 emballage vektorer (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 pg Rev, og 0,7 ug VSVG, Invitrogen). Som en kontrol for både transfektion og efterfølgende infektion, normalt inkluderer vi en yderligere brønd i transfektion af en lentiviral GFP ekspressionsvektor, pLV156-CMV-EGFP (figur 1A), der huser et forstærket grønt fluorescerende protein (EGFP) under kontrol af CMV-promotoren som tidligere beskrevet ^20.
3. Tilsæt 100 pi af 0,25 M _CaCl2 (fortyndet med DNase / RNase-free ddH ₂ O fra 2,5 M stamopløsning) til plasmidet blanding i trin 2 og blandes. Derpå tilsættes 100 ul 2x BBS opløsning (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 6,95) og blandes forsigtigt, men grundigt. Inkubér DNA mix ved stuetemperatur i 15 min.
4. Mens vi venter, aspirere medium fra 293T celler og skifter til 2 ml frisk medium. Returnere pladen til inkubatoren i mindst 10 min til ækvilibrering mediets pH før transfektion.
5. Tilføj transfektion mix fra trin 3 til 293T celler dråbe for dråbe. Drej forsigtigt pladen rundt og observere partikeldannelse under et mikroskop. Inkuber ved _5% CO2, 37 ° C natten over. (Fine partikeldannelse af Capo ₄ / DNA-præcipitatet er kritisk for effektiv transfektion.)

3. Høst viruspartikler (dage 3-4)

1. Omkring 16 timer efter transfektion (dag 3) på hvilket tidspunkt celler bør nå op på 100% konfluens, aspirere medium fra celler og erstatte med 2 ml frisk regelmæssig DMEM. Inkuber ved 37 ° C natten over.
2. På dag 4, vurdere transfektionseffektiviteten ved at observere EGFP udtryk i transfection kontrolceller (transfektionseffektivitet på 90-100% med høj EGFP ekspression er en pålidelig indikator for en god viral prep.)
3. Opsaml medium indeholdende secernerede, infektiøse viruspartikler. Centrifuger ved> 2.000 x g i 5 minutter til fjernelse af resterende 293T-celler og opsamling af virus-indeholdende supernatant. Alternativt kan mediet fjernes med et 0,45 um membranfilter. De virale partikler er klar til brug i infektion.

3. Infektion af 3T3-celler

1. Frø 3T3-celler (dag 3)

Split-og frø passende antal (~ 12.000) af 3T3-celler på en 12-brønds plade til opnåelse af 20-30% konfluens ved næste dag. Inkuber ved 37 ° C natten over.

2. Infect 3T3-celler (dag 4)

1. Overhold podede celler. Konfluens på 20-30% (mindre end 50%) er ønskelig for infektion.
2. Tilføj polybren til en slutkoncentration på 5 ug / ml til det opsamlede medium indeholdende viralepartikler. Bland godt ved pipettering.
3. Aspirere medium fra 3T3-celler, og der tilsættes 1 ml af ovennævnte virale blanding per brønd. Inkuber ved 37 ° C natten over. (Polybrene bruges til at øge infektionseffektivitet, men er ikke absolut nødvendig. Som det kan være toksisk for nogle celler, der forudgående testning anbefales.)

3. Vælg inficerede celler (dag 5 og fremefter)

1. Fireogtyve timer efter infektion, aspireres medium indeholdende virus og polybren fra inficerede celler, vaskes en gang med 1 x PBS, og skifter til frisk medium. Inkuber ved 37 ° C natten over for genopretning og vækst.
2. Når sammenflydende (normalt 1-2 dage senere), flækkede cellerne og inkuberes ved 37 ° C natten over.
3. Den følgende dag aspireringsstilling medium fra celler (<50% konfluens ønskes) og erstattes med frisk medium indeholdende 10 ug / ml blasticidin at selektere for stabilt transducerede celler. (Blasticidin kill-kurve skal bestemmes empirisk for en bestemt cellelinie.)

4. Bioluminescens Registrering af Reporter Cells

1. Seed reporter celler

Propagate blasticidin-resistente reporter celler og delt på 35-mm dyrkningsskåle. Inkuber ved 37 ° C indtil sammenflydende. Vi plejer at forberede ≥ 3 retter til hver reporter cellelinje under hver betingelse for døgnrytmen fænotypebestemmelse.

2. Synkronisering og skift til indspilningsmediet

1. Aspirere medium fra konfluente reportergrupper celler, vaskes en gang med PBS, og erstat med DMEM indeholdende 10 pM forskolin (eller 200 nM dexamethason). Inkuber ved 37 ° C i 1 time for at synkronisere cellerne. (Alternativt kan celler synkroniseres af temperaturcykler ²³ eller serum shock ^24).
2. Mens vi venter, forberede rekordING medium til 3T3-celler som følger: 1x DMEM (HyClone) indeholdende 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM forskolin, 1 mM luciferin, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum og forskolin koncentration kan bestemmes empirisk. For meget dim celler, kan phenolrødt-frit medium anvendes.
3. Ved afslutningen af ​​forskolin behandling, aspireres medium og erstattes med frisk gjort indspilningsmediet.

3. Bioluminescens registrering af reporter-celler

1. Efter medium forandring, dyrkningsskåle dække med 40 mm sterile dækglas og segl på plads med vakuum fedt at forhindre fordampning.
2. Indlæse retter på LumiCycle luminometeret, som holdes inden i en inkubator indstillet til 36 ° C uden _{H2O eller} CO2.
3. Start realtid bioluminescens optagelse. Vi plejer at optage rytmer i 1 uge, efterfulgt af medium forandring og kontinuerlig optagelse i en anden uge (se Savelyev et al. For detaljer) ^25. (Til optagelse af 96-vill plader, Synergy SL2 blev anvendt som optageenhed, se Diskussion 1,1 for detaljer).

5. Dataanalyse og præsentation

Reporter celler letter i høj opløsning kvantitativ luminescens optagelse, kritisk til bestemmelse fænotypiske effekter på døgnrytmen ur funktion. For at opnå døgnrytmen parametre, herunder fase, periode længde, rytme amplitude, og dæmpning sats, vi bruger LumiCycle Analysis programmet (Actimetrics) til at analysere bioluminescens data ^5,14. Kort beskrevet rådata er baseline monteret først, og baseline-korrigeret data er monteret på en sinusbølge, hvorfra parametre bestemmes. For prøver, der viser vedvarende rytmer, goodness-of-fit på> 90% opnås sædvanligvis. På grund af høj forbigående bioluminescens ved medium forandring, vi normalt udelukke den første cyklus af data fra analysen.

For præsentationen af ​​data, vi normalt plotte rådata (bioluminescens, tællinger / sek) mod timig (dage). Når det er nødvendigt, kan baseline-korrigeret data blive plottet til at sammenligne amplitude og fase.

6. Repræsentative resultater

1. Phase-specifikke cirkadiske reportere

Circadian clock er baseret på en biokemisk negativ feedback-mekanisme ^1. Kernen feedback loop består af transkriptionelle aktivatorer BMAL1 og ur, og repressorer pers og krystal, der virker på de cirkadiske E / E'-box enhancerelementer at producere rytmisk genekspression (med morgen fase, f.eks Rev-erb α). Kernen loop regulerer og integrerer mindst to andre cirkadiske cis-elementer, den DBP/E4BP4 bindende element (D-box, for dagen fase, f.eks Per3) og ROR / REV-ERB bindende element (RRE, for natten fase, fx Bmal1) ^17. Kombinatorisk regulering af flere cirkadiske elementer kan generere nye mellemliggende faser. For eksempel transcrip Cry1tion medieres af alle tre cirkadiske elementer (dvs. E / E'-box og D-box elementer i promotoren og Rres i den første intron af Cry1-genet), der giver anledning til særskilte Cry1 aftenperioden fase ^13.

Baseret på disse mekanismer genregulering, genererede vi fire forskellige reporterkonstruktioner: P (Per2)-d Luc og P (Cry1)-D Luc reportere indeholder både E / E'-box og D-box elementer i den regulatoriske region ^{17, 26,27,} P (Cry1) - Intron-d Luc repræsenterer kombinatorisk regulering af alle tre elementer (dvs. E / E'-box, D-box, og RRE) ^13,17, og P (Bmal1)-d Luc reguleret udelukkende af RRE ^9,17,19,21. Vi indførte disse reportere i 3T3-celler til at producere de forventede særskilte faser af reporter-ekspression (figur 2).

2. Gene knockdown via RNAi og farmakologisk aktive forbindelser

Når transfektionseffektivitet er høj, kan syntetiske siRNA være transient transficeret ind i celler for at vælte genekspression. Når transfektion er teknisk vanskeligt, kan et shRNA ekspressionsvektor være stabilt transduceres ind i celler via lentiviral infektion, således at shRNA produceret af cellen processeres til siRNA for gen knockdown (KD). Her præsenteres KD virkninger af Cry1 og Cry2 gener ved anvendelse siRNA i U2OS-celler (figur 3A) og shRNA i 3T3-celler under anvendelse af en pLL3.7 Gateway ekspressionsvektor ⁹ (figur 3B). Ud over 3T3-celler er U2OS model blevet et andet fremtrædende cellulær ur model hovedsagelig fordi det opfylder de vigtigste krav til high-throughput screening af kommercielt tilgængelige humane siRNA biblioteker (f.eks menneskelig oprindelse, der kan skabe robuste døgnrytmen, validerede funktion alle kendte ur gener, og som kan underkastes meget effektiv transfektion ogkvantitativ luminescence optagelse). I begge celletyper, resulterede RNAi-medieret KD ur fænotyper i overensstemmelse med tidligere mus knockout (KO) og cellulære KD studier ^5,10,11,28. For eksempel, mens Cry1 KD forkorter perioden længde og reducerer rytme vedholdenhed, Cry2 KD forlænger periode. Endvidere kan udvalgte små molekyler anvendes til farmakologisk target og forstyrrer proteinfunktion (figur 3C).

Figur 1. Lentivirus-medieret gen-afgivelsessystem. (A) Skematisk diagram af to lentiviral P (Per2)-d Luc reporter vektorerne og en CMV-EGFP-konstruktion. Kun i regionen til integration i værtscellegenomet er vist. I begge reporterkonstruktioner, er transkriptionen af d Luc under direkte kontrol af den Per2 promotoren. I pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vektoren (reKombinationen-baseret kloning), en co-udtrykte blasticidin resistensgen (Bsd) letter selektion af inficerede celler. I pLV156-P (Per2)-d Luc vektoren (ligering-baseret kloning), er EGFP translation medieret af et internt ribosomindgangssted (IRES) nedstrøms for d Luc, muliggør visuel observation og FACS-sortering af inficerede celler. Desuden, SV40 promotor / terminator (P / T) en anvendes som en isolator (se diskussionen 1.3). I CMV-EGFP kontrol vektoren, er EGFP-ekspression under kontrol af en stærk CMV-promotor. (B) fluorescerende billeder af transficerede og inficerede GFP-udtrykkende celler. Typisk vi opnå en høj effektivitet, både i forbigående transfektion af 293T celler og i lentiviral infektion af cellelinier af vores interesse, som indikeret ved GFP-ekspression i disse celler. Klik her for at se større figur .

Figur 2. Fase-specifik ekspression af bioluminescens reportere i 3T3-celler De lentivirale reporter vektorerne anvendt i dette forsøg er pLV7-Bsd-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, og P (Bmal1)-d Luc. Hver reporter viser mærkbar fase af oscillation, som angivet med pilene. Mens Per2 og Cry1 promotorer drev peak bioluminescens på morgen-dagen faser og Bmal1 promotor natten fase, kombinatorisk regulering af P (Cry1) - Intron husly E-box, D-box, og RRE elementer giver aften fase af top bioluminescens . Klik her for at se større figur .

Figur 3. Genetisk og farmakologiske forstyrrelse af døgnrytmen bioluminescens rytmer i reporter-celler. (A) Virkninger af Cry1 og Cry2 knockdown af siRNAs på cellulære rytmer af U2OS reporter celler. The LumiCycle luminometer anvendtes til bioluminescens registrering af celler i 35 mm-skåle. Figur efter fra reference # 10, med tilladelse fra Elsevier (2009). (B) Virkninger af Cry2 knockdown af shRNAs på cellulære rytmer af 3T3 reporter-celler. En pLL3.7 Gateway vektor indeholdende et U6-shRNA kassette blev anvendt til Cry2 genet knockdown. shRNA2 har en bedre knockdown effektivitet end shRNA1 som bestemt ved Western blot-analyse (data ikke vist). En Synergy luminometer anvendtes til bioluminescens registrering af celler i en plade med 96 brønde. Indstillingerne for optagelse er som følger:. Inkubatortemperaturen, 33 ° C, integration tid, 15 sek, interval tid, 30 min (c) Virkninger af små molekyler inhibitorer på cellular rytmer af U2OS reporter celler. Chir99021 og Roscovitine er inhibitorer mod GSK-3 og CDK hhv. The ViewLux system (Chir99021 assay) og en Tecan luminometer (Roscovitine assay) blev anvendt til bioluminescens optagelser af celler i 384-brøndsplader. Figur er tilpasset fra reference # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). Klik her for at se større figur .

Discussion

1. Ændringer af nuværende protokol

1,1 Optagelse enheder og gennemløb overvejelser

På grund af sin kommercielle tilgængelighed har LumiCycle (Actimetrics) blevet den mest almindeligt anvendte automatiserede luminometer enhed for real-time optagelse ^{4,5,9,19,29-31.} The LumiCycle anvender fotomultiplikatorrør (PMT'er), som lysdetektorer, der giver ekstremt høj følsomhed og lav støj ^14, og derfor er særlig egnet til dataregistreringen ekstremt svage luciferase-baseret bioluminescens. Andre lignende PMT-baserede enheder (f.eks Kronos, Atto Co, og Polarstar Optima, BMG Labtech Inc.) er også blevet anvendt i mange undersøgelser ^32,33.

The LumiCycle assay under anvendelse af 35-mm skåle kan tilpasses til 96 -, 384 - eller endog 1152-brøndplade formater til high-throughput screening (HTS) eksperimenter. HTS assay udvikling hovedsagelig fokuserer på følgende to aspekter: 1) Bedre reporter celler med lysere luciferase og / eller højere reporter udtryk (se nedenfor), og 2) meget følsomme optageenheder der tilgodeser multi-brønds plader. Vi og andre har brugt flere mikropladelæsere såsom Synergy SL2 (Biotek), Infinite M200 (Tecan) ^19, TopCount (PerkinElmer) ^28, og EnVision (Perkin Elmer) ^34. I vores laboratorium, er både LumiCycle og Synergy anordninger anbragt i et temperaturstyret og lystæt inkubator. Alternativt, hvis ressourcer tillader det, kan optagemediet enheder anbringes i et temperaturkontrolleret rum. For HTS, skal kritiske indstillinger såsom integration / eksponeringstid og intervallet mellem tidspunkterne bestemmes empirisk for en given journalist og optageenhed.

Den LumiCycle analysen giver ikke geografisk information på enkelt celle opløsning. Yamaguchi et al. ³⁵ og Welsh et al. ^4,5 pioner realtid bioluminescens billeddannelse ved integrating en specialdesignet mikroskop med et meget følsomt, støjsvag CCD-kamera ¹⁵ for at opnå enkelt celle opløsning. I de senere år er mere følsomme billeddannende systemer bliver kommercielt tilgængelige, herunder LV200 (Olympus) og CellGraph (AB3000-B, Atto) med en ultrasensitive afkølet og bagbelyste elektron multiplicere CCD og flerfarvet filtre ^36,37. Billeddannelse er også blevet anvendt i mere sofistikerede HTS eksperimenter, f.eks a ViewLux CCD Imager (Perkin-Elmer) kombineret med GNF automatiserede robotsystem (GNF Systems). Dette system givet store skærme til nye gener og små molekyler, der påvirker urfunktion ^10,12,19.

1,2 Luciferaseaktiviteter reportere

Luciferaser blev første gang brugt i real-time luminescens optagelse af døgnrytmen genekspression i begyndelsen af 1990'erne i planter og cyanobakterier, og er blevet almindeligt anvendt i pattedyrs-systemet siden 2000 ^29,35,38-40 (enLSO se anmeldelser ^14,15). Luciferase reportere er generelt mindre toksiske og mere følsomme end fluorescerende reportere såsom GFP, som følge af meget lavere baggrund ^41. Det mest almindeligt anvendte bioluminescerende reporter er ildflue (Photinus pyralis) luciferase (Luc +) konstrueret i pGL3 vector serien (Promega), ved hvilken den kodende region af det native Luc blev modificeret for optimal transskription og translation. Kombinationen af ​​ildflue-luciferase og dens yderst stabile og celle-permeable substrat, D-luciferin, er ideel til langvarig optagelse. d Luc er en modificeret version af Luc + med en PEST-sekvens fusioneret ved dets C-terminal for at muliggøre hurtig proteinnedbrydning. En yderligere forbedret version, Luc2, er tilgængelig i pGL4 vektoren serien (Promega) med højere og mindre anomale ekspression. Men vi ikke oplever en betydelig forskel i ydelse mellem Luc + og Luc2 i transient transficeret 3T3-og U2OS celler (data ikke vist). I en nylig rapport blev brasilianske klik billeluciferase (E Luc) vist at udvise en meget lysere signal end Luc +, egnet til enkelt cell imaging ^42.

Mange nyere undersøgelser har draget fordel af den mPER2 :: LUC fusion knock-in reporter mus ^{4,5,9,19,25,29-31,43.} Dette reportersystem tillader døgnrytmen fænotypebestemmelse af celler og væv eksplantater herunder SCN. I vores tidligere undersøgelser, krydsede vi denne reporter mus linje med mange af de behaviorally kendetegnet ur gen-knockouts og undersøgt dynamikken i bioluminescens rytmer i SCN, lever og lunge eksplantater dyrkes ex vivo og i dissocierede SCN neuroner og fibroblaster dyrket in vitro ^{4, 5,9,31.} Disse undersøgelser tilladt os at få vigtig indsigt i de molekylære detaljer uret på celle-og organismal niveauer.

1,3 Gene leveringsmetoder

e_content "> vektorbaseret ur reportere giver stor alsidighed, idet de kan indføres i forskellige celletyper via transient transfektion ^11,13,16,17 eller lentiviral transduktion ^5,9,18. Selv om besværlige og mindre reproducerbare, transient transficerede celler kan også dyrkes i den kontinuerte tilstedeværelse af antibiotika for at generere stabile cellelinjer. lentivirusvektorer stadig foretrækkes på grund af deres stabile integration i cellens genom, og større effektivitet og alsidighed. Udover pLV7 vektoren præsenteret ovenfor, hvor inficerede celler kan være udvælges med antibiotika har vi anvendt andre vektorer. For eksempel indeholder pLV156-P (Per2)-d Luc vektoren a P (Per2)-d Luc-IRES-EGFP ekspressionskassette, hvori EGFP translation medieres af et internt ribosom-entry Site (IRES) nedstrøms for d Luc, der giver mulighed for visuel observation og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) af celler med inteed vektorer ⁵ (figur 1) (se nedenfor). At afskærme reporteren fra integrationsstedet virkninger, en konstitutiv promotor og terminatorsekvenser (P / T) kan indføres som en isolator eller attrap umiddelbart opstrøms for P (Per2)-d Luc reporter ekspressionskassette (fx bunden konstruktion i figur 1A ), som beskrevet af Brown et al. ¹⁸ og Liu et al. ^fem

Tidligere undersøgelser etablerede grundlaget for udforskning af vævsspecifik genetisk forstyrrelse både in vivo og / eller ex vivo ^44-48. For eksempel kan virale partikler injiceres i SCN region efterfulgt af SCN skive præparat. Som et alternativ til denne in vivo efterfulgt af ex vivo-assay, kan SCN skiver udskæres først og dyrkes ex vivo, efterfulgt af inkubation med høj titer virus. Men på grund af lav infektionseffektivitet af relativt tykke vævssnit,en meget konsekvent ex vivo protokol mangler at blive udviklet.

1,4 Valg af cellelinjer og optageforhold

Meget af det, vi ved om biokemi og cellebiologi af uret mekanisme er baseret på tre cellulære modeller: 3T3 musefibroblaster ^16,17, U2OS humane osteosarcomceller ^10,11,19,28 og musefibroblaster afledt fra mus ^{9,13 , 34.} The lentiviral vektor system tillader effektiv levering og stabil integration i værtsgenomet af både delende og ikke-delende pattedyrceller, og er derfor ikke begrænset til bestemte celletyper som i transient transfektion. I betragtning af de roller døgnrytmen ure i reguleringen af ​​en bred vifte af cellulære og fysiologiske reaktioner, vil fremtidige undersøgelser bestemt omfatter mange forskellige celletyper, enten kommercielt tilgængelige cellelinier og primære celler afledt fra mus. Disse celle-selvstændige ur undersøgelser vil bidrage til at belyse vævs-ubiquitous, såvel som vævsspecifikke, egenskaber døgnrytmen ure.

Det skal bemærkes, at generere reporter celler kan kræve empirisk afprøvning af forskellige reportere (fx forskellige vektor og promotor typer), og undertiden yderligere optimering. Ikke alle celletyper har celle-autonome rytmer. For at forbedre celle sundhed og persistens af cellulære rytmer, optimering af optagemediet er ofte nødvendigt. For eksempel, som et alternativ til de 3T3 indspilningsmediet optagemediet anvendes til U2OS celler er som følger: 1x DMEM (Invitrogen), 2% B-27, 1 uM forskolin, 1 mM luciferin, 14,5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES (pH 7,2). 1 mM luciferin er sædvanligvis tilstrækkelig, men en slutkoncentration (0,1-1 mM) kan bestemmes for hver celle / reporter type. Forskolin måske ikke nødvendig, og dets koncentration kan bestemmes empirisk for hver celletype.

1,5 transfektionseffektivitet i lentiviral prep

High transfection effektiviteten af ​​293T-celler er afgørende for en god viral prep. Større overvejelser omfatter sundhed 293T celler og valg af en transfektion reagens. 293T-celler kan være meget kræsne og kræver omhyggelig håndtering. Således må cellevæksthastigheden og morfologi overvåges nøje. For konsistens, anbefaler vi, at serum testes først, og det samme testede batch anvendes derefter til opretholdelse af cellerne. Vi har altid afprøve nye 2x BBS og CaCl ₂ stamopløsninger og optimere arbejdet koncentration af CaCl ₂ omkring 0,25 M. Celler med høj passage nummer og / eller visning langsom vækst bør ikke anvendes. 293T-celler er let transfectable med en række transfektionsreagenser. Foruden Capo ₄ har vi også opnået fremragende transfektionseffektivitet med Fugene 6 (Roche eller Promega) eller Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Disse lipidbaserede transfektion (lipofektion) reagenser er dyrere, men giver bedre transfektion konsistens end Capo _4. For store lentivirale preps, anbefaler vi at bruge CaPO4 til transfektion på grund af lavere omkostninger.

1,6 Generering af klonale cellelinier

Un-koncentrerede rå virale partikler er af relativt lav titer (10 ⁶ virale partikler / ml), og reporter-ekspression i transducerede celler er lav. Selv om dette er tilstrækkeligt til de fleste anvendelser, såsom LumiCycle optagelse, er lysere reportere ofte brug, fx i high-throughput assays under anvendelse af en mindre følsom registreringsapparat. Reporter ekspression kan forøges ved anvendelse af højere titer virale preps. For at gøre dette, anbefaler vi at bruge større dyrkningsbeholdere sådanne as15 cm skåle til transfektion og opsamling medier to gange på dag 4 og dag 5. For 10x koncentration (10 ⁷ viruspartikler / ml), udfører filtrering ved anvendelse af centrifugal filterindretninger (Millipore). For 100x eller mere (≥ 10 ⁸ virale partikler / ml), udfører ultracentrifugering som tidligere beskrevet 5,18. Hvis en homogen cellepopulation ønskes, kan klonale cellelinier opnås ved FACS-baseret enkelt celle sortering i plader med 96 brønde. Men det er afgørende, at disse klonale celler nøje undersøges, cellemorfologi bør være umulig at skelne fra forældrenes celler, og ur egenskaber, såsom periode længde og amplitude skal være repræsentative for den inficerede celle population.

2. Anvendelse af Cell-autonome Reporter Clock Modeller

I modsætning til væv eller dyremodeller, er celle-baserede modeller modtagelige for genetiske og farmakologiske perturbationer, og når det er nødvendigt, også bruge i HTS formater. Forstyrrelse af genfunktion kan opnås ved over-ekspression eller RNAi-medieret knockdown. Selektive små molekyler kan anvendes til at interferere med proteinfunktion. Her har vi kort d somiscuss nogle anvendelser af celle-selvstændige ur modeller i cirkadiske undersøgelser.

2,1 Undersøgelse af centrale ur mekanismer

Cell-autonome ur modeller har lettet mekanistiske undersøgelser. Hogenesch og kolleger brugte 3T3 model at vise, at feedback-undertrykkelse af krystal kræves for urfunktion ^16, og den U2OS model til at undersøge systemniveau egenskaber af ur funktion ^11. Vi anvendt Cry1-/ -: Cry2-/ - fibroblast model afledt fra mus viser, at forsinket feedback-undertrykkelse er nødvendig for urfunktion ^13, og Bmal1-/ - fibroblast model til at vise, at Rev-erbα og β spiller redundante roller regulering RRE-medieret rytmisk genekspression, og at Bmal1 rytme er ikke kritisk nødvendig for core clock funktion ^9. Desuden kemisk screening i reporter celler tilladt identifikation og / eller afklaring af funktionerne i GSK-3 β (periode afkortning når perturberede) ^19, CK1σ og ε (periode forlængelse når perturberede) ^49, og CK1α ^12. Som diskuteret nedenfor er disse modeller letter identifikation af yderligere ur komponenter. Strategisk disse cellulære modeller er mere medgørlig til hurtig opdagelse af basale mekanismer, som derefter giver nye indgange til in vivo validering og udforskning.

2,2 Identifikation af ur faktorer

Ud over den centrale sløjfe, også uret mekanisme integrerer forskellige signalering og regulatoriske faktorer. Til identifikation af yderligere ur komponenter og modifikator, er celle-selvstændige ur modeller fordelagtig i forhold til genetisk screening i mus på grund af den iboende letalitet, pleiotropiske virkninger, og udviklingsmæssige genetiske kompensation forbundet med mutante dyremodeller ^50. Cellebaserede skærme i kombination med funktionel genomik hensigtsømhed, er blevet effektivt gennemført ved hjælp af high-throughput registreringssystemer til skærm genom-dækkende siRNA og shRNA biblioteker til identifikation af nye ur faktorer ^10,28. Ligeledes kan man anvende kemiske biologiske metoder og en skærm til forskellige små molekyler til at undersøge deres indvirkning på ur-funktion ^12,19,34,49. Selv store ur gener og deres funktioner er blevet identificeret, er disse skærme identificeret yderligere komponenter eller modifikatorer, der er involveret i regulering eller modulering af uret. Mange af disse modifikatorer repræsenterer særlige retningslinjer for at integrere signaltransduktion af synkrone eller asynkrone signaler (klokindgange).

2,3 Undersøgelse af ur udgange

Mens næsten alle celler in vivo har døgnrytmen ure, behøver celler dyrket in vitro ikke nødvendigvis vist åbenlyse døgnrytmen. I denne forbindelse tilvejebringer reporter fremgangsmåde et nyttigt værktøj til at afprøve, omur mekanisme eksisterer i en bestemt celletype. Tilstedeværelsen af celle-selvstændige ur mekanismer garanterer undersøgelser af ur udgange i disse celler, såvel som i væv in vivo, herunder transkriptomet ved microarray eller RNA-sekventering ^51,52, transskriptionelle regulatoriske netværk, proteomet, og metabolomet. Disse studier undersøger genom-dækkende RNA og protein ekspressionsmønstre og dermed vil supplere cellebaserede luminescens reporter assays, der ikke nødvendigvis afspejler den endogene udtryk.

3. Betydningen af ​​Cell-autonome Clock Modeller

Koordinering af døgnrytmen funktion inden for SCN og på tværs af forskellige celle-og vævstyper er et kritisk aspekt af normal fysiologi ^30. Den centrale SCN og perifere ure er alle væsentlige dele af den samlede cirkadiske organisation. SCN modtager lys input direkte fra nethinden til medrive til lys / mørkecyklus, og tjener som en koordinatorsynkronisere perifere ure gennem både neuronale og hormonale forbindelser. Ud over intern synkronisering, også den molekylære urværk i perifere væv og celler orkestrerer et utal af transkriptionelle output net, som i sidste ende styrer åbenlyse cirkadiske rytmer i fysiologi og adfærd.

Således både systemiske og lokale signaler regulerer circadian fysiologi, og der er behov for at afdække cirkadiske gener direkte reguleres af celle-selvstændige ure vs dem indirekte af systemiske signaler fra SCN. Rolle perifere ure kan undersøges i celle-selvstændige ur modeller, hvori systemiske påvirkninger fjernes. I tilfælde af leveren, genererer vævsspecifikke regulatoriske netværk rytmer i lokale fysiologi ^51,53. Ved at sammenligne in vitro og in vivo døgnrytmen, vil vi være i stand til at skelne mellem celle-selvstændige og systemiske cue-drevne urfunktionerne. Faktisk recent studier er begyndt at afsløre en væsentlig rolle for leveren uret i hepatisk genekspression ^6,51,52. Fremtidig forskning på området berettiger udvikling af forskellige væv og celler typespecifikke ur modeller, der repræsenterer forskellige fysiologiske udgange.

Tidligere studier af biokemi og cellebiologi af ur mekanisme har i høj grad baseret sig på en begrænset antal celle-og vævstyper, herunder især 3T3, U2OS, musefibroblaster og lever. En implicit antagelse i de fleste cirkadiske undersøgelser er, at uret fungerer på samme måde i alle celle-og vævstyper, og genfunktion bestemt i en celle eller vævstype anses generelt anvendes universelt i alle cellerne ^7. Men ved at etablere og karakterisere flere celle-autonome ur modeller, er fremtidige undersøgelser forventes at afdække vævsspecifikke ur egenskaber underliggende lokale døgnrytme biologi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics