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Biology

Überwachung Zell-autonome circadiane Uhr Rhythms der Genexpression mittels Luciferase Biolumineszenz Reporter

Published: September 27, 2012 doi: 10.3791/4234

Summary

Circadiane Uhren funktionieren innerhalb einzelner Zellen, dh sie sind zellautonome. Hier beschreiben wir Verfahren zur Erzeugung von Zell-autonome Uhrenmodelle mit nicht-invasiven, Luciferase-basierte Echtzeit-Biolumineszenz-Technologie. Reporter Zellen bereitzustellen gefügig, funktionales Modell für das Studium zirkadianen Biologie.

Abstract

Bei Säugetieren sind viele Aspekte des Verhaltens und der Physiologie wie Schlaf-Wach-Zyklen und Leberstoffwechsel durch endogene circadiane Uhren (bewertet 1,2) geregelt. Die circadiane zeithaltenden System ist eine hierarchische Multi-Oszillator-Netzwerk, mit dem zentralen Takt im suprachiasmatischen Nukleus (SCN) zu synchronisieren und koordinieren extra-SCN und peripheren Uhren anderswo 1,2 liegt. Zellen sind die einzelnen Funktionseinheiten für die Erzeugung und Aufrechterhaltung der zirkadianen Rhythmen 3,4 und dieser Oszillatoren verschiedener Gewebetypen im Organismus teilen eine bemerkenswert ähnliche biochemische negativen Rückkopplungsmechanismus. Jedoch aufgrund von Wechselwirkungen an der neuronalen Netzwerk-Ebene im SCN und durch rhythmische, systemischer Cues am organismal Ebene werden Tagesrhythmus am organismal Ebene nicht notwendigerweise zellautonome 5-7. Im Vergleich zu herkömmlichen Studien der lokomotorischen Aktivität in vivo und ex vivo SCN Explantate, cell-basierte in vitro-Assays ermöglichen Entdeckung der Zell-autonome circadiane Mängeln 5,8. Strategisch sind zell-basierte Modelle mehr experimentell handhabbar zur phänotypischen Charakterisierung und schnelle Entdeckung der Grundtakt Mechanismen 5,8-13.

Da zirkadianen Rhythmen dynamisch sind, sind Längs-Messungen mit hoher zeitlicher Auflösung benötigt, um Uhrfunktion beurteilen. In den letzten Jahren hat Echtzeit Biolumineszenz Aufnahme mit Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu einer gebräuchlichen Methode zur Untersuchung Tagesrhythmus in Säugetieren 14,15, wie es für die Prüfung des Persistenz und Dynamik molekularer Rhythmen ermöglicht. Um Zell-autonome circadiane Rhythmen der Genexpression überwachen, können Luciferase Reporter in Zellen durch transiente Transfektion 13,16,17 oder stabile Transduktion 5,10,18,19 eingeführt werden. Hier beschreiben wir eine stabile Transduktion Protokoll unter Verwendung Lentivirus-vermittelte Gentransfer. Ter Lentivirales Vektorsystem ist den herkömmlichen Methoden wie transiente Transfektion und Keimbahntransmission wegen ihrer Effizienz und Vielseitigkeit: er ermöglicht die effiziente Bereitstellung und stabile Integration in das Wirtsgenom von beiden Teilen und nicht teilende Zellen 20. Sobald ein Reporter-Zelllinie hergestellt ist, kann die Dynamik der Uhr-Funktion durch Biolumineszenz-Aufnahme untersucht werden. Wir beschreiben zunächst die Erzeugung von P (Per2)-d Luc Reporter Linien, und dann vorliegenden Daten aus diesem und anderen circadianen Reportern. In diesen Assays werden 3T3 Mausfibroblasten und U2OS humanen Osteosarkomzellen als zelluläre Modelle verwendet. Wir diskutieren auch verschiedene Möglichkeiten der Verwendung dieser Uhrenmodelle in zirkadianen Studien. Hier beschriebenen Methoden können zu einer Vielzahl von Zelltypen, die zellulären und molekularen Grundlagen von circadianen Uhren studieren angewendet werden, und es kann nützlich sein bei der Bewältigung von Problemen in anderen biologischen Systemen.

Protocol

Ein. Bau Lentivirale Luciferase Reporter

Ein Säuger zirkadianen Reporterkonstrukt enthält üblicherweise eine Expressionskassette in dem eine circadiane Promotor mit dem Luciferase-Gen fusioniert ist. Sowohl Ligations-und Rekombinations-basierte Strategien werden üblicherweise für DNA-Klonierung verwendet. Als ein Beispiel beschreiben wir hier eine Rekombination basierende Gateway-Klonen Verfahren zur Erzeugung eines P (Per2)-d Luc-Reporter lentiviralen, in der die destabilisierte Luciferase (Luc d) unter Kontrolle des Maus Per2 Promotor.

  1. Klonierung Per2 Promotor. Verwenden, um die PCR Per2 Promotor DNA-Fragment von 526 bp amplifizieren, stromaufwärts von der Transkriptionsstartstelle aus einer Maus Per2 BAC-Klon 9-13, unter Verwendung eines Vorwärtsprimers (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') und einen Rückwärts-Primer (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 ') und Klon in pENTR5'-TOPO-Vektor (Invitrogen) zu erzeugenpENTR5'-P (Per2).
  2. Klonierung von d Luc. Der d Luc enthält das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen und eine C-terminale Sequenz für die schnelle PEST Proteinabbau, wie zuvor beschrieben 21. Verwenden, um die PCR-DNA-Fragment d Luc und Klon in pENTR / D-TOPO-Vektor (Invitrogen) zu amplifizieren pENTR / Dd Luc erzeugen.
  3. Bau-Reporter-Vektor. Mischen Sie die beiden pENTR Plasmide, pENTR5'-P (Per2) und pENTR / Dd Luc, mit dem lentiviralen Zielvektor pLV7-BSD (BSD, Blasticidin Resistenzgen), und führen Sie die Rekombination mit Clonase eine pLV7-BSD-P erzeugen (Per2)-d Luc Reporter (Abbildung 1). pLV7-BSD ist eine modifizierte Version (made in unserem Labor) der pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), in dem die woodchuck Hepatitis-Virus post-Transkriptionsregulatorelements (WPRE) Sequenzen 22 wurden sofort nach dem Ausdruck ca eingesetzt ssette die Genexpression zu erhöhen.

2. Produktion von Lentivirale Partikel

Ein. Seed 293T-Zellen (Tag 1)

  1. Wachsen menschliche embryonale Nieren (HEK) 293T-Zellen zu 90-100% Konfluenz in regelmäßigen DMEM mit 10% FBS und 1x Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG) auf 10 cm Zellkulturschalen ergänzt. (Schnell wachsende Zellen mit niedrigen Durchgang Nummer sind entscheidend für die effiziente Transfektion.)
  2. Vor dem Aussäen der Zellen für Transfektion Mantel 6-well Kulturplatten durch Zugabe von 1 ml 0,001% Poly-L-Lysin in PBS in jede Vertiefung und Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min. Absaugen und spülen einmal mit 1x PBS vor der Verwendung.
  3. Dissoziieren 293T-Zellen mit Trypsin und Saatgut 0,75 x 10 6 Zellen auf jede Vertiefung der vorbeschichteten Platten mit 2 ml DMEM regelmäßigen. Swirl die Platten gründlich, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen in jeder Vertiefung erhalten. Wachsen die Zellen in den Inkubator bei 37 ° C über Nacht.
tep "> 2. Transiente Transfektion Via Capo 4 / DNA Niederschlag (Tag 2)

  1. Beachten Sie die ausgesäten Zellen von Tag 1. Zelle erreichen sollte Zusammenfluss von 80-90%.
  2. Bereiten Plasmidtransfektion Mischung in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen durch Zugabe von 2 ug eines lentiviralen Reporter Plasmid-DNA (zB pLV7-P (Per2)-d Luc; Liu lab) und die 3 Verpackungsvektoren (1,3 pg Gag / Pol, 0,5 ug Rev und 0,7 ug VSVG; Invitrogen). Als Kontrolle für sowohl Transfektion und nachfolgende Infektion, wir normalerweise einen zusätzlichen gut in Transfektion für einen lentiviralen GFP-Expressionsvektor, pLV156-CMV-EGFP (Abbildung 1A), beherbergt, Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) unter der Kontrolle des CMV-Promotors wie zuvor beschrieben 20.
  3. Fügen Sie 100 ul von 0,25 M CaCl 2 (verdünnt mit DNase / RNase-free ddH 2 O von 2,5 M Lager) mit dem Plasmid Mischung in Schritt 2 und gründlich mischen. Dann fügen Sie 100 ul 2x BBS-Lösung (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, pH 6,95) und mischen Sie vorsichtig, aber gründlich. Inkubieren des DNA-Mischung bei Raumtemperatur für 15 min.
  4. Während des Wartens, absaugen Medium aus 293T-Zellen und wechseln Sie in 2 ml frisches Medium. Bringen Sie die Platte in den Inkubator für mindestens 10 min bis mittlere pH vor der Transfektion äquilibrieren.
  5. Fügen Transfektion Mischung aus Schritt 3 bis 293T-Zellen Tropfen für Tropfen. Schwenken Sie die Platte vorsichtig und beobachten Partikelbildung unter dem Mikroskop. Inkubation bei 5% CO 2, 37 ° C über Nacht. (Fine Partikelbildung von CaPO 4 / DNA-Präzipitat ist entscheidend für eine effiziente Transfektion.)

3. Ernte Viruspartikel (Tage 3-4)

  1. Etwa 16 Stunden nach der Transfektion (Tag 3) Zu diesem Zeitpunkt Zellen sollten bis zu 100% Konfluenz absaugen Medium von Zellen und ersetzen mit 2 ml frischem regelmäßigen DMEM. Bei 37 ° C über Nacht.
  2. Am Tag 4 zu beurteilen Transfektionseffizienz durch Beobachtung EGFP-Expression in transfection Kontrollzellen (Transfektionseffizienz von 90-100% mit hoher EGFP-Expression ist ein zuverlässiger Indikator für eine gute virale prep.)
  3. Sammeln des Mediums enthaltend sekretiert, infektiöse Viruspartikel. Zentrifuge bei> 2.000 xg für 5 min, um das restliche 293T Zellen zu entfernen und sammeln das Virus enthaltende Überstand. Alternativ kann das Medium mit einer 0,45 um Membranfilter gelöscht. Die viralen Partikel sind bereit für den Einsatz in Infektion.

3. Infektion von Zellen 3T3

Ein. Seed 3T3-Zellen (Tag 3)

Split und Saatgut entsprechende Anzahl (~ 12.000) von 3T3-Zellen auf einer 12-Well-Platte auf 20-30% Konfluenz am nächsten Tag erhalten. Bei 37 ° C über Nacht.

2. Infect 3T3-Zellen (Tag 4)

  1. Beachten Sie die ausgesäten Zellen. Konfluenz von 20-30% (unter 50%) ist für die Infektion gewünscht.
  2. Hinzufügen Polybren in einer Endkonzentration von 5 pg / ml zu dem gesammelten Medium mit viralenTeilchen. Gut mischen durch Pipettieren.
  3. Absaugen Medium von 3T3-Zellen und 1 ml der oben viralen Mischung pro Vertiefung. Bei 37 ° C über Nacht. (Polybrene verwendet wird, um Infektionen Effizienz zu verbessern, ist aber nicht unbedingt erforderlich. Wie es zu toxisch sein einigen Zellen wird vorheriger Prüfung empfohlen.)

3. Wählen infizierten Zellen (Tag 5 und höher)

  1. Vierundzwanzig Stunden nach der Infektion, absaugen Medium mit Virus-und Polybren aus infizierten Zellen, einmal zu waschen mit 1x PBS, und wechseln Sie in frischem Medium. Bei 37 ° C über Nacht zur Verwertung und Wachstum.
  2. Wenn konfluent (in der Regel 1-2 Tage später), teilen die Zellen und bei 37 ° C über Nacht.
  3. Am folgenden Tag absaugen Medium von Zellen (<50% Konfluenz gewünscht) und ersetzen Sie sie durch frisches Medium mit 10 ug / ml Blasticidin für stabil wählen transduzierten Zellen. (Blasticidin kill-Kurve muss empirisch für eine bestimmte Zelllinie bestimmt werden.)

4. Biolumineszenz Aufzeichnung von Reporter Cells

Ein. Seed-Reporter-Zellen

Propagieren Blasticidin-resistente Reporter Zellen und aufgeteilt auf 35-mm-Kulturschalen. Bei 37 ° C bis zur Konfluenz. Wir in der Regel bereiten ≥ 3 Gerichte für jeden Reporter-Zelllinie unter jeder Bedingung für die circadiane Phänotypisierung.

2. Synchronisation und Änderung Aufzeichnungsträger

  1. Absaugen Medium von konfluenten Reporter Zellen, einmal zu waschen mit PBS, und ersetzen Sie sie durch DMEM mit 10 uM Forskolin (oder 200 nM Dexamethason). Bei 37 ° C für 1 Stunde, um die Zellen zu synchronisieren. (Alternativ können Zellen durch Temperaturzyklen 23 oder Serum Schock 24 synchronisiert.)
  2. Während des Wartens, bereiten Rekordten Weg für 3T3-Zellen wie folgt: 1x DMEM (HyClone), das 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 pM Forskolin, 1 mM Luciferin, 25 mM HEPES, pH 7,4. Serum und Forskolin-Konzentration kann empirisch ermittelt werden. Für sehr dunklen Zellen kann Phenolrot-freies Medium verwendet werden.
  3. Am Ende der Forskolin Behandlung absaugen Medium und ersetzen mit frisch zubereiteten Speichermedium.

3. Aufzeichnung der Biolumineszenz Reporterzellen

  1. Nach Mediumwechsel decken Kulturschalen mit 40 mm sterile Deckgläser und Dichtung an Ort und Stelle mit Vakuumfett um Verdunstung zu verhindern.
  2. Legen Sie die Speisen auf den LumiCycle Luminometer, die innerhalb eines eingestellten Brutschrank bei 36 ° C ohne H 2 O oder CO 2 gehalten.
  3. Starten Sie real-time Biolumineszenz Aufnahme. Wir in der Regel erfassen Rhythmen für 1 Woche, gefolgt von mittleren Wandel und kontinuierliche Aufzeichnung für eine zweite Woche (siehe Savelyev et al. Für Details) 25. (Für die Aufnahme von 96-wirll Platten, Synergy SL2 wurde als Aufnahmegerät verwendet, siehe Diskussion 1.1 für Details).

5. Datenanalyse und Präsentation

Reporter Zellen zu erleichtern hochauflösende quantitative Lumineszenz Aufnahme von entscheidender Bedeutung für die Bestimmung phänotypischen Auswirkungen auf circadiane Uhr-Funktion. Um circadianen Parameter einschließlich Phase Periodenlänge, Rhythmus Amplitude und Dämpfungsrate zu erhalten, verwenden wir die LumiCycle Analyse-Programm (Actimetrics) zu analysieren Biolumineszenz Daten 5,14. Kurz gesagt sind Rohdaten Basislinie taillierter ersten und Baseline-subtrahierten Daten werden an eine Sinuswelle, aus denen die Parameter bestimmt werden angebracht. Für Proben, die persistent Rhythmen, die Güte der Passung von> 90% wird in der Regel erreicht zu zeigen. Aufgrund der hohen transienten Biolumineszenz nach Medium ändern, wir in der Regel auszuschließen den ersten Zyklus von Daten aus der Analyse.

Für Präsentationen, wir in der Regel zeichnen Rohdaten (Biolumineszenz, counts / sec) gegen time (Tage). Wenn nötig, kann basisliniengetrennten subtrahierten Daten aufgetragen, um Amplitude und Phase zu vergleichen.

6. Repräsentative Ergebnisse

Ein. Phase-spezifische circadiane Reporter

Die circadiane Uhr auf einer biochemischen negativen Feedback-Mechanismus 1 basiert. Der Kern besteht aus Rückkopplungsschleife Transkriptionsaktivatoren BMAL1 und CLOCK, und Repressoren PERs und CRYS, die auf den zirkadianen E / E'-Box Enhancerelemente wirken, um rhythmische Genexpression (mit Morgen Phase, z. B. Rev-erb α) zu erzeugen. Der Kern Schleife regelt und integriert mindestens zwei anderen zirkadianen cis-Elemente, die DBP/E4BP4 Bindeelements (D-Box, für Tage Phase, z. B. Per3) und dem ROR / REV-ERB Bindeelements (RRE; für Nachtphase, zB BMAL1) 17. Kombinatorische Regulierung von mehreren circadianen Elementen erzeugen können neuartige Zwischenphasen. Beispielsweise Cry1 Transkriptiontion wird von allen drei zirkadianen Elemente (dh E / E'-Box und D-Kastenelemente im Promotor und RRES im ersten Intron des Gens Cry1), was zu dem unterscheidbaren Cry1 Abend-Zeitphase 13 vermittelt.

Basierend auf diesen Mechanismen der Genregulation, erzeugten wir vier verschiedenen Reporter-Konstrukte: P (Per2)-d Luc und P (Cry1)-d Luc-Reporter, die sowohl E / E'-Box und D-Boxenelemente in der regulatorischen Region 17, 26,27; P (Cry1) - Intron-d Luc darstellt kombinatorischen Regulierung durch alle drei Elemente (dh E / E'-Box, D-Box, und RRE) 13,17; und P (BMAL1)-d Luc geregelten ausschließlich durch RRE 9,17,19,21. Wir führten diese Reportern in 3T3-Zellen, die zu erwartenden unterschiedlichen Phasen der Reporterexpression (Abbildung 2) zu erzeugen.

2. Gene knockdown mittels RNAi und pharmakologisch aktiviertve Verbindungen

Wenn Transfektionseffizienz hoch ist, können synthetische siRNA transient in Zellen transfiziert werden, um knock down Genexpression. Wenn Transfektion technisch schwierig ist, kann ein Expressionsvektor sein shRNA stabil transduzierten in Zellen über lentiviralen Infektion, so daß shRNA von der Zelle produziert wird, um siRNA zur Gen Knockdown (KD) verarbeitet. Hier findet KD Wirkungen Cry1 und Cry2 Gene mittels siRNA in U2OS Zellen (3A) und shRNA in 3T3 Zellen unter Verwendung eines Gateway-pLL3.7 Expressionsvektor 9 (Abbildung 3B). Neben 3T3-Zellen wurde die U2OS Modell zu einem weiteren Takt herausragende zellulären Modell zuletzt deswegen, weil die wesentlichen Anforderungen für das Hochdurchsatz-Screening von kommerziell erhältlichen humanen siRNA-Bibliotheken (zB menschlichen Ursprungs, geeignet zur Erzeugung robuste zirkadiane Rhythmen, validiert Funktion erfüllt alle bekannten Uhren-Gene und zugänglich hocheffiziente Transfektion undquantitative Lumineszenz-Aufnahme). In beiden Zelltypen führte RNAi-vermittelte KD in clock Phänotypen konsistent mit früheren Maus-Knockout (KO) und zellulären KD Studien 5,10,11,28. Zum Beispiel, Cry1 KD verkürzt Periodenlänge und reduziert Rhythmus Persistenz, während Cry2 KD verlängert Zeitraum. Zusätzlich können ausgewählte kleine Moleküle zu pharmakologisch Target und perturb Proteinfunktion (3C) eingesetzt werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Das Lentivirus-vermittelte Genliefersystem. (A) Schematische Darstellung von zwei lentiviralen P (Per2)-d Luc Reporter Vektoren und einer CMV-EGFP konstruieren. Nur der Bereich für die Integration in das Genom der Wirtszelle gezeigt ist. In beiden Reporter-Konstrukte, die Transkription von d Luc unter direkter Kontrolle des Per2 Promotor. In der pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc Vektor (reKombination-Klonen), erleichtert ein coexprimierten Blasticidin-Resistenzgen (BSD) Auswahl der infizierten Zellen. Im pLV156-P (Per2)-d Luc-Vektors (ligation-Klonen), wird EGFP Übersetzung durch eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) stromabwärts d Luc vermittelt, so dass für eine visuelle Beobachtung und FACS-Sortierung von infizierten Zellen. Zusätzlich ist ein SV40-Promotor / Terminator (P / T) als ein Isolator (siehe Diskussion 1.3) verwendet. In der CMV-EGFP Kontrollvektor ist EGFP-Expression unter der Kontrolle eines starken CMV-Promotors. (B) Fluoreszierende Bilder der transfizierten und infizierten GFP-exprimierenden Zellen. Normalerweise erreichen wir eine hohe Effizienz sowohl im transienten Transfektion von 293T-Zellen und in lentivirale Infektion von Zelllinien unseres Interesses, wie GFP-Expression in diesen Zellen angezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2 Abbildung 2. Phase-spezifische Expression von Biolumineszenz Reportern in 3T3-Zellen Die lentiviralen Reportervektoren in diesem Experiment verwendet werden pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc, P (Cry1)-d Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, und P (BMAL1)-d Luc. Jedes Reporterkügelchen durch einen deutlichen Phase der Oszillation, wie durch die Pfeile angedeutet. Während die Per2 und Cry1 Promotoren Laufwerk peak Biolumineszenz am Morgen-Tag Phasen und der BMAL1 Promotors in der Nacht Phase kombinatorischen Regulierung durch die P (Cry1) - Intron beherbergen E-Box, verleiht D-Box und RRE Elementen Abend Phase peak Biolumineszenz . Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3
Abbildung 3. Genetische und pharmakologische Störung des zirkadianen Biolumineszenz Rhythmen Reporter Zellen. (A) Auswirkungen von Cry1 und Cry2 knockdown von siRNAs auf zelluläre Rhythmen U2OS Reporter Zellen. Die LumiCycle Luminometer wurde für Biolumineszenz Aufnahme von Zellen in 35 mm-Schalen verwendet. Abbildung angepasst ist von Referenz Nr. 10, mit Genehmigung von Elsevier (2009). (B) Auswirkungen von Cry2 knockdown von shRNAs auf zelluläre Rhythmen 3T3 Reporter Zellen. A pLL3.7 Gateway-Vektor, der ein U6-shRNA-Kassette wurde für Cry2 Gen knockdown verwendet. shRNA2 hat einen besseren Wirkungsgrad als Knockdown shRNA1 wie durch Western-Blot-Analyse (Daten nicht gezeigt) bestimmt. Eine Synergie Luminometer wurde für Biolumineszenz Aufnahme von Zellen in einer 96-Well-Platte verwendet. Die Einstellungen für die Aufnahme sind wie folgt:. Inkubatortemperatur, 33 ° C; Integrationszeit, 15 sec; Intervallzeit, 30 min (C) Wirkung von Kleinmolekül-Inhibitoren auf celzellulären Rhythmen U2OS Reporter Zellen. Chir99021 und Roscovitin sind Inhibitoren gegen GSK-3 und CDK gerichtet sind. Die ViewLux System (Chir99021 Assay) und eine Tecan Luminometer (Roscovitine Assay) wurden für Biolumineszenz-Aufnahmen von Zellen in 384-Well-Platten verwendet. Abbildung von Referenz # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA) angepasst. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Discussion

Ein. Änderungen Aktuelle Protocol

1,1 Aufnahmegeräte und Durchsatz Überlegungen

Wegen seiner kommerziellen Verfügbarkeit hat die LumiCycle (Actimetrics) werden die am häufigsten verwendeten automatisierten Luminometer Vorrichtung zur Echtzeit-Aufzeichnung 4,5,9,19,29-31. Die LumiCycle beschäftigt Photomultiplier (PMT) als Licht-Detektoren, die extrem hohe Empfindlichkeit und geringe Geräuschentwicklung 14 bereitzustellen, und deshalb ist besonders geeignet für die Datenerfassung von extrem dim Luciferase-basierten Biolumineszenz. Andere ähnliche PMT-basierten Geräten (z. B. Kronos Atto Co.; und POLARstar Optima, BMG labtech Inc.) wurden ebenfalls in vielen Studien 32,33 eingesetzt.

Die LumiCycle Assay unter Verwendung von 35-mm-Schalen können bis 96 angepasst werden -, 384 - oder sogar 1152-Well-Platte Formate für das Hochdurchsatz-Screening (HTS)-Experimente. HTS Assay-Entwicklung konzentriert sich hauptsächlich auf die folgenden zwei Aspekte: 1) Besser Reporter Zellen mit heller Luciferase und / oder höhere Reportergen Expression (s. unten), und 2) hochempfindlichen Aufnahmegeräte, die Multi-Well-Platten aufzunehmen. Wir und andere haben mehrere Mikroplatten-Reader wie Synergy SL2 (BioTek), Infinite M200 (Tecan) 19, TopCount (PerkinElmer) 28 und EnVision (Perkin Elmer) 34 verwendet. In unserem Labor werden sowohl die LumiCycle und Synergy Geräte in einer temperatur-und lichtdicht Inkubator gestellt. Alternativ, wenn die Ressourcen erlauben, können die Aufnahme-Einheiten in einem temperierten Raum platziert werden. Für HTS, müssen kritische Einstellungen wie Integration / Belichtungszeit und Intervall zwischen den Zeitpunkten empirisch für einen bestimmten Reporter und Aufnahmegerät bestimmt werden.

Die LumiCycle Test liefert keine räumliche Informationen einzigen Zelle Auflösung. Yamaguchi et al. 35 und Welsh et al. 4,5 Pionierarbeit Echtzeit-Biolumineszenz-Bildgebung von integrating ein speziell entwickeltes Mikroskop mit einem hochempfindlichen, rauscharmen CCD-Kamera 15 bis einzelne Zelle Auflösung zu erreichen. In den letzten Jahren sind empfindlicher Bildgebungssysteme kommerziell verfügbar, einschließlich LV200 (Olympus) und CellGraph (AB3000-B, Atto) mit einem gekühlten und ultrasensitive hinten beleuchteten Elektronenvervielfachungseinheit CCD und mehrfarbigen Filter 36,37. Bildgebung wurde auch in komplexeren HTS Experimenten, zB ein CCD-Bildgeber ViewLux (Perkin-Elmer) mit dem GNF Automatisches Roboter-System (GNF Systems) kombiniert verwendet worden. Dieses System ermöglichte großflächige Bildschirme für neue Gene und kleine Moleküle, die Uhrfunktion 10,12,19 beeinflussen.

1,2 Luciferase Reporter

Luziferasen wurden zunächst in Echtzeit Lumineszenz Aufzeichnung von zirkadianen Genexpression in den frühen 1990er Jahren in Pflanzen und Cyanobakterien verwendet und wurden die üblicherweise in der Säuger-System seit 2000 29,35,38-40 (einem gebrauchtenlso siehe Bewertungen 14,15). Luciferase Reporter sind in der Regel weniger toxisch und empfindlicher als fluoreszierende Reporter wie GFP, wegen der viel niedrigeren Hintergrund 41. Das am häufigsten verwendete biolumineszierenden Reporter Glühwürmchen (Photinus pyralis) Luciferase (Luc +) ausgebildet in den pGL3 Vektor-Serie (Promega), bei dem die kodierende Region des nativen Luc für optimierte Transkription und Translation modifiziert wurde. Die Kombination von Glühwürmchen-Luciferase und seine sehr stabile und Zell-durchlässiges Substrat, D-Luciferin, ist ideal für Langzeit-Aufzeichnung. d Luc ist eine modifizierte Version von Luc + mit einer PEST-Sequenz am C-Terminus fusioniert, um eine rasche Proteinabbau ermöglichen. Eine weiter verbesserte Version Luc2, ist im pGL4 Vektor-Serie (Promega) mit höheren und weniger anomale Ausdruck. Allerdings haben wir nicht beobachten einen signifikanten Unterschied in der Leistung zwischen Luc + und Luc2 in transient transfizierten 3T3 und U2OS Zellen (Daten nicht gezeigt). In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurde brasilianische Klick Käferluciferase (E Luc) gezeigt, dass eine viel heller Signal als Luc +, geeignet für Einzel-cell imaging 42 aufweisen.

Viele neuere Studien haben den Vorteil der mPER2 übernommen :: LUC Fusion Knock-in-Reporter Maus 4,5,9,19,25,29-31,43. Dieser Reporter ermöglicht zirkadianen Phänotypisierung von Zellen und Gewebe Explantate einschließlich des SCN. In unseren früheren Studien, überquerten wir diese Reporter Mauslinie mit vielen der Verhaltensebene gekennzeichnet Uhr Gen-Knockouts und untersucht die Dynamik der Biolumineszenz Rhythmen im SCN, Leber und Lunge Explantate kultivierten ex vivo und in dissoziierten SCN Neuronen und Fibroblasten in vitro 4 kultiviert, 5,9,31. Diese Studien konnten wir wichtige Einblicke in die molekularen Details der Uhr-Betrieb an den Zell-und organismal Ebenen zu gewinnen.

1,3 Gene Versandmethoden

e_content "> Vektor-basierte Taktgeber Reporter bereitzustellen große Vielseitigkeit, da sie in verschiedene Zelltypen über transiente Transfektion 11,13,16,17 oder lentiviralen Transduktion 5,9,18 eingeführt werden kann. Obwohl umständlich und weniger reproduzierbar, transient transfizierten Zellen können Auch im kontinuierlichen Nachweis von Antibiotika, um stabile Zelllinien zu erzeugen gezüchtet werden. Lentivirale Vektoren noch aufgrund ihrer stabilen Integration in das Genom der Zelle, sowie eine größere Effizienz und Vielseitigkeit bevorzugt. Neben der pLV7 Vektor oben dargestellten, in der infizierten Zellen kann ausgewählt mit Antibiotika, haben wir andere Vektoren verwendet. Beispielsweise enthält das pLV156-P (Per2)-d Luc Vektor eine P (Per2)-d Luc-IRES-EGFP Expressionskassette in dem EGFP Übersetzung durch eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle vermittelt wird (IRES) stromabwärts von Luc d, so dass für eine visuelle Beobachtung und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Zellen mit integrated vektoren 5 (Abbildung 1) (siehe unten). Um die Reporter aus Integrationsstelle Effekte, einem konstitutiven Promotor und Terminator (P / T) abschirmen kann als ein Isolator eingebracht oder Decoy unmittelbar stromaufwärts von der P (Per2)-d Luc-Reporter Expressionskassette (beispielsweise unten in 1A-Konstrukt ), wie von Braun et al. 18 und Liu et al. 5

Frühere Studien etabliert den Grundstein für die Erforschung von Gewebe-spezifischen genetischen Störung sowohl in vivo und / oder ex vivo 44-48. Zum Beispiel können virale Partikel in die Region durch SCN SCN Slice Zubereitung gefolgt injiziert werden. Als Alternative zu diesem in vivo durch ex vivo Assay gefolgt kann SCN Scheiben zerlegt ersten und ex vivo kultiviert werden, gefolgt von Inkubation mit hochtitrige Virus. Aufgrund niedrigen Infektionsraten Effizienz der relativ dicken Gewebeschnitten,ein hochkonsistentes ex vivo-Protokoll noch entwickelt werden.

1,4 Wahl von Zelllinien und Aufnahmebedingungen

3T3 Mausfibroblasten 16,17, U2OS menschlichen Osteosarkomzellen 10,11,19,28 und Maus-Fibroblasten von Mäusen 9,13 abgeleitet: Vieles, was wir über die Biochemie und Zellbiologie des Uhrwerks auf drei zellulären Modellen , 34. Lentivirales Vektorsystem erlaubt eine effiziente Lieferung und stabile Integration in das Wirtsgenom von beiden Teilen und nicht teilende Säugetierzellen, und daher ist nicht beschränkt auf bestimmte Zelltypen nach transienter Transfektion. Angesichts der Rolle des inneren Uhren in der Regulation einer Vielzahl von zellulären und physiologischen Reaktionen werden zukünftige Studien sicher an eine Vielzahl von Zelltypen erstrecken, entweder im Handel erhältlich Zelllinien oder primäre Zellen von Mäusen abgeleitet sind. Diese Zell-autonome Uhr Studien helfen aufzudecken Gewebe-ubiquitous sowie gewebespezifische, Eigenschaften von inneren Uhren.

Es ist erwähnenswert, dass das Erzeugen Reporter Zellen können empirische Prüfung von verschiedenen Reportern erfordern (z. B. verschiedene Typen Vektors und Promotors), und manchmal weiteren Optimierung. Nicht alle Zelltypen Zell-autonome Rhythmen. Um Cell Gesundheit und Persistenz der zellulären Rhythmen, Optimierung von Aufzeichnungsmediums zu verbessern, ist oft notwendig. Zum Beispiel, als eine Alternative zu dem 3T3 Aufzeichnungsmedium ist das Aufzeichnungsmedium für U2OS Zellen wie folgt verwendet: 1x DMEM (Invitrogen), 2% B-27, 1 pM Forskolin, 1 mM Luciferin, 14.5 mM NaHCO3, 10 mM HEPES (pH 7,2). 1 mM Luciferin ist normalerweise ausreichend, aber eine Endkonzentration (0,1-1 mM) kann für jede Zelle / Reporter-Typ bestimmt werden. Forskolin möglicherweise nicht erforderlich und seine Konzentration kann empirisch für jeden Zelltyp bestimmen.

1,5 Transfektionseffizienz in lentiviralen prep

Hohe transfection Effizienz der 293T-Zellen ist entscheidend für eine gute virale prep. Wichtige Überlegungen gehören Gesundheit von 293T-Zellen und die Wahl eines Transfektionsreagenz. 293T-Zellen können sehr wählerisch und erfordern eine sorgfältige Handhabung. So muss Zeilwachstumsrate und Morphologie sorgfältig überwacht werden. Aus Gründen der Einheitlichkeit empfohlen, dass Serum getestet werden erste und die gleiche getesteten Chargen danach zur Aufrechterhaltung der Zellen verwendet. Wir testen immer neue 2x BBS und CaCl 2 Stammlösungen und Optimierung des Working Konzentration von CaCl 2 um 0,25 M. Cells hohe Passage-Nummer und / oder Anzeigen langsamen Wachstums sollten nicht verwendet werden. 293T-Zellen werden leicht mit einer Anzahl von Transfektionsreagenzien transfizierbar. Neben CaPO 4 wir auch erreicht ausgezeichnete Transfektionseffizienz mit Fugene 6 (Roche oder Promega) oder Lipofectamin-2000 (Invitrogen). Diese Lipid-basierte Transfektion (Lipofektion) Reagenzien sind teurer, aber bessere Transfektion Konsistenz als CaPO 4. For großen lentiviralen preps, empfehlen wir die Verwendung CaPO 4 für die Transfektion wegen der niedrigeren Kosten.

1,6 Generierung von klonalen Zelllinien

Un-konzentrierte rohe viralen Partikel von relativ niedrigem Titer (10 6 Viruspartikel / ml), und Reporterexpression in transduzierten Zellen gering ist. Obwohl dies reicht für die meisten Anwendungen wie LumiCycle Aufzeichnung werden hellere Reportern häufig erforderlich, z. B. in High-Throughput-Assays unter Verwendung einer weniger empfindlichen Aufnahmegerät. Reporter Ausdruck kann durch höhere Titer viraler preps erhöht werden. Dazu empfehlen wir die Verwendung größerer Kulturgefäße wie AS15 cm-Schalen für die Transfektion und das Sammeln media zweimal am Tag 4 und Tag 5. Für 10x Konzentration (10 7 Viruspartikel / ml), führen Filtration mit Zentrifugalfilter Geräte (Millipore). Für 100x oder mehrere Konzentrationen (≥ 10 8 Viruspartikel / ml), führen Ultrazentrifugation wie oben beschrieben 5,18. Wenn eine homogene Zellpopulation gewünscht wird, kann klonale Zelllinien durch FACS-basierte Sortierung einzelnen Zelle in 96-well Platten erhalten werden. Jedoch ist es unerlässlich, dass diese klonalen Zellen sorgfältig geprüft werden; Zellmorphologie sollte nicht von parentalen Zellen, und Uhren Eigenschaften wie Periodenlänge und Amplitude sollte stellvertretend für infizierte Zellpopulation sein.

2. Anwendung von Zell-autonome Reporter Clock Models

Anders als Gewebe oder Tiermodellen, zellbasierten Modellen zugänglich genetische und pharmakologische Perturbationen sind, und wenn erforderlich, auch in HTS-Formate verwenden. Perturbation der Genfunktion durch Überexpression oder RNAi-vermittelte Knockdown erreicht werden. Selektive kleine Moleküle können verwendet werden, um mit Protein-Funktion stören. Hier haben wir kurz Discuss einige Verwendungen von Zell-autonome Uhrenmodelle in zirkadianen Studien.

2,1 Studium der Kerntakt Mechanismen

Zell-autonome Uhrenmodelle haben stark mechanistische Studien erleichtert. Hogenesch und Kollegen nutzten die 3T3-Modell zu zeigen, dass Feedback Unterdrückung durch Crys für Uhrfunktion 16 und die U2OS Modell, um die System-Level-Eigenschaften Uhrfunktion 11 Probe erforderlich ist. Wir verwendeten die Cry1-/ -: Cry2-/ - Fibroblast Modell von Mäusen stammen zu zeigen, dass verzögertem Feedback Repression ist notwendig für Uhrfunktion 13 und das BMAL1-/ - Fibroblast Modell zu zeigen, dass Rev-erbα-und β redundanten Rollen spielen Regulierung RRE-vermittelte rhythmischen Genexpression, und dass BMAL1 Rhythmus nicht kritisch für Kerntakt Funktion 9 benötigt. Darüber hinaus erlaubt chemisches Screening in Reporterzellen Identifizierung und / oder Aufklärung der Funktionen von GSK-3 β (Zeitraum Verkürzung, wenn gestört) 19, CK1σ und ε (Zeitraum verlängert, wenn gestört) 49 und CK1α 12. Wie unten diskutiert, erleichtern diese Modelle Identifizierung weiterer Taktgeber Komponenten. Strategisch sind diese zellulären Modellen gefügiger für die schnelle Entdeckung der grundlegenden Mechanismen, die dann neue Einstiegspunkte für in vivo Validierung und Exploration.

2,2 Bezeichnung Uhr Faktoren

Zusätzlich zu dem Kern Rückkopplungsschleife, das Uhrwerk auch integriert unterschiedliche Signalisierungs und regulatorische Faktoren. Zur Identifizierung von zusätzlichen Komponenten Takt und Modifikatoren sind zellautonome Uhrenmodelle über genetisches Screening in Mäusen aufgrund der inhärenten Letalität, pleiotrope Effekte und Entwicklungsstörungen genetischen Kompensation mit Mutante Tiermodellen 50 zugeordnet vorteilhaft. Zellbasierten Bildschirme in Kombination mit funktionellen Genomik entspreGliederschmerzen, wurden effektiv aus mit High-Throughput-Erfassungssysteme Bildschirm genomweite siRNA und shRNA Bibliotheken zur Identifizierung neuartiger Uhr Faktoren 10,28 durchgeführt. Ebenso kann ein chemisch-biologische Ansätze und Leinwand für diverse kleine Moleküle, um ihre Auswirkungen auf die Uhrfunktion 12,19,34,49 studieren beschäftigen. Obwohl große Uhren-Gene und ihre Funktionen identifiziert wurden, haben diese Bildschirme zusätzliche Komponenten oder Modifikatoren, die bei der Regulation oder Modulation der Uhr beteiligt sind identifiziert. Viele dieser Modifikatoren stellen insbesondere die Modalitäten der Integration Signaltransduktion von synchronen oder asynchronen Cues (Takteingänge).

2,3 Study of Taktausgänge

Obwohl praktisch alle Zellen in vivo circadiane Uhren haben, können Sie Zellen in vitro kultiviert nicht unbedingt angezeigt offene zirkadianen Rhythmen. In diesem Zusammenhang sieht das Reporter Ansatz ein nützliches Mittel, um zu testen, ob dieUhrwerk existiert in einem bestimmten Zelltyp. Gegenwart zellautonome Uhrwerke rechtfertigen Studien Taktausgänge in diesen Zellen sowie in Geweben in vivo, einschließlich der Transkriptom durch Microarray-oder RNA-Sequenzierung 51,52, Transkriptionsregulations Netzwerken, das Proteom, und der Metabolom. Diese Studien untersucht genomweiten RNA und Protein Expressionsmuster und somit würde zellbasierten Lumineszenz Reporterassays die nicht notwendigerweise die endogene Expression ergänzen.

3. Bedeutung von Zell-autonome Clock Models

Koordinierung der circadianen Funktion innerhalb des SCN und in verschiedenen Zell-und Gewebetypen ist ein kritischer Aspekt der normalen Physiologie 30. Die zentrale SCN und peripheren Uhren sind alle wesentlichen Teile des gesamten zirkadianen Organisation. Der SCN empfängt Licht Eingang direkt von der Netzhaut zum Mitreißen der Hell / Dunkel-Zyklus, und dient als KoordinatorSynchronisieren peripheren Uhren sowohl durch neuronale und hormonelle Verbindungen. Zusätzlich zu den internen Synchronisation, die molekulare Uhrwerk in peripheren Geweben und Zellen auch orchestriert eine Vielzahl von Transkriptions-Ausgang Netzwerke, die letztlich zu regieren offene zirkadianen Rhythmen in Physiologie und Verhalten.

So regulieren beide systemische und lokale Signale zirkadianen Physiologie, und es gibt eine Notwendigkeit, die zirkadianen Gene direkt reguliert durch zellautonome Takte aufzudecken vs indirekt durch die systemische Signale aus dem SCN reguliert. Die Rolle der peripheren Uhren können in zellautonome Uhrenmodelle studiert werden, in denen systemischer Einflüsse entfernt werden. Im Falle der Leber, erzeugen gewebespezifische regulatorische Netzwerke Rhythmen im lokalen Physiologie 51,53. Durch den Vergleich in vitro und in vivo zirkadianen Rhythmen, werden wir in der Lage sein, zwischen Zell-autonome und systemische Cue-driven Uhrfunktionen diskriminieren. Tatsächlich recent Studien haben begonnen, eine bedeutende Rolle für die Leber Uhr in der Leber Genexpression 6,51,52 offenbaren. Zukünftige Forschung im Bereich Optionsscheine Entwicklung verschiedener Gewebe-und Zelltyp-spezifische Uhrenmodelle, die verschiedene physiologische Ausgänge.

Frühere Studien der Biochemie und Zellbiologie der Uhrmechanismus weitgehend auf eine begrenzte Anzahl von Zell-und Gewebetypen, einschließlich insbesondere 3T3, U2OS, Maus-Fibroblasten und Leber gestützt. Eine implizite Annahme in den meisten zirkadianen Studien ist, dass die Uhr auf die gleiche Weise funktioniert in alle Zell-und Gewebetypen und-Gen-Funktion in einer Zelle oder einem Gewebe-Typ bestimmt wird allgemein als universell anwendbar in allen Zellen 7. Allerdings, durch die Errichtung und Charakterisierung weitere Zell-autonome Uhrenmodelle werden zukünftige Studien zu erwarten gewebespezifische Uhr Eigenschaften zugrunde liegenden lokalen zirkadianen Biologie aufzudecken.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde zum Teil von der National Science Foundation (IOS-0.920.417) (ACL) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201
B-27 Invitrogen 17504-044
D-Luciferin Biosynth L-8220
Poly-L-lysine Sigma P4707
Polybrene Millipore TR-1003-G
Forskolin Sigma F6886
All other chemicals Sigma
Equipment
Tissue culture incubator 5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics

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Ramanathan, C., Khan, S. K.,More

Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).

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