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Biology

निगरानी सेल जीन एक्सप्रेशन के स्वायत्त circadian घड़ी लय luciferase Bioluminescence रिपोर्टर का उपयोग

Published: September 27, 2012 doi: 10.3791/4234
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, The University of Memphis

Summary

Circadian घड़ियों व्यक्ति की कोशिकाओं के भीतर कार्य, यानी, वे सेल स्वायत्त हैं. यहाँ, हम सेल स्वायत्त घड़ी गैर इनवेसिव, luciferase आधारित bioluminescence वास्तविक समय प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मॉडल को पैदा करने के लिए तरीके का वर्णन करता है. रिपोर्टर कोशिकाओं विनयशील, circadian जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए कार्यात्मक मॉडल प्रणाली प्रदान करते हैं.

Protocol

1. Lentiviral luciferase पत्रकारों का निर्माण

एक स्तनधारी circadian संवाददाता का निर्माण आम तौर पर एक अभिव्यक्ति कैसेट है जो एक circadian प्रमोटर luciferase जीन के साथ जुड़े हुए है. दोनों ligation और पुनर्संयोजन आधारित रणनीति आमतौर पर डीएनए क्लोनिंग के लिए किया जाता है. एक उदाहरण के रूप में, यहाँ हम एक पी (PER2) घ ल्यूक lentiviral संवाददाता, जो में अस्थिर luciferase (घ ल्यूक) माउस PER2 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत पैदा करने के लिए एक गेटवे पुनर्संयोजन आधारित क्लोनिंग विधि का वर्णन है.

  1. प्रमोटर क्लोनिंग PER2. पीसीआर का उपयोग करने के लिए 526 बीपी की PER2 प्रमोटर डीएनए टुकड़ा बढ़ाना, प्रतिलेखन शुरू साइट के एक माउस PER2 बीएसी 9-13 क्लोन से ऊपर, एक आगे (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') किताब और एक रिवर्स प्राइमर (5' का उपयोग 'TTGG 3) - CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC, और क्लोन pENTR5' Topo वेक्टर (Invitrogen) में उत्पन्न करने के लिएpENTR5' पी (PER2).
  2. घ ल्यूक की क्लोनिंग. घ ल्यूक जुगनू luciferase जीन और प्रोटीन तेजी से गिरावट के लिए एक सी टर्मिनल कीट अनुक्रम के रूप में पहले 21 वर्णित होता है. पीसीआर का प्रयोग घ ल्यूक डीएनए टुकड़ा, pENTR / D-Topo वेक्टर (Invitrogen) में और क्लोन बढ़ाना / pENTR Dd ल्यूक उत्पन्न.
  3. संवाददाता वेक्टर के निर्माण. Lentiviral गंतव्य वेक्टर pLV7 बीएसडी (BSD, प्रतिरोध जीन blasticidin) के साथ दो pENTR plasmids, (PER2) pENTR5' पी और / pENTR Dd ल्यूक, मिक्स, और पुनर्संयोजन Clonase का उपयोग करने के लिए एक pLV7 bsd-P उत्पन्न प्रतिक्रिया प्रदर्शन (PER2) घ ल्यूक रिपोर्टर (1 चित्रा). pLV7-BSD pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) का एक संशोधित संस्करण हमारी प्रयोगशाला में किए गए जिसमें woodchuck हेपेटाइटिस वायरस के बाद विनियामक तत्व (WPRE) 22 दृश्यों तुरंत अभिव्यक्ति क्षमताओं के नीचे डाला गया है ssette जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए.

2. Lentiviral कण का उत्पादन

1. बीज 293T कोशिकाओं (1 दिन)

  1. मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T कोशिकाओं के विकास में 90-100% संगम नियमित DMEM 10% FBS और 1x 10 सेमी संस्कृति व्यंजन पर पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन Glutamine (PSG) के साथ पूरक. (कम पारित होने संख्या के साथ तेजी से बढ़ कोशिकाओं कुशल अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण हैं.)
  2. पहले एक अच्छी तरह से करने के लिए 0,001% पीबीएस में पाली एल Lysine के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं द्वारा अभिकर्मक कोट, 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के लिए कोशिकाओं को बोने के लिए. समाधान Aspirate और 1x पीबीएस के साथ प्रयोग करने से पहले एक बार कुल्ला.
  3. Trypsin और 0.75 बीज के साथ 293T कोशिकाओं को अलग कर देना x 10 2 मिलीग्राम नियमित DMEM के साथ पूर्व में लिपटे प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह पर 6 कोशिकाओं. प्लेटें अच्छी तरह भंवर प्रत्येक में अच्छी तरह से कोशिकाओं की एक भी वितरण प्राप्त. इनक्यूबेटर में 37 ° रातोंरात सी कोशिकाओं के विकास.
> 2 tep "Capo 4 / डीएनए वर्षण की संभावना (2 दिन) के माध्यम से. क्षणिक अभिकर्मक

  1. 1 दिन से वरीय कोशिकाओं का निरीक्षण. सेल 80-90% के संगम तक पहुँचने चाहिए.
  2. और 3 पैकेजिंग वैक्टर (1.3 ग्राम चुप / पोल, 0.5 ग्राम, एक lentiviral संवाददाता प्लास्मिड डीएनए की 2 ग्राम (लियू प्रयोगशाला जैसे, (pLV7 PER2-P) घ ल्यूक) जोड़कर एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्लाज्मिड अभिकर्मक मिश्रण तैयार राजस्व, और 0.7 ग्राम VSVG, Invitrogen). दोनों अभिकर्मक और बाद के संक्रमण के लिए एक नियंत्रण के रूप में, हम आम तौर पर एक lentiviral GFP अभिव्यक्ति वेक्टर के लिए एक अभिकर्मक में अतिरिक्त अच्छी तरह से, pLV156 सीएमवी EGFP (चित्रा 1 ए) सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण के तहत बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) शरण 20 के रूप में पहले से वर्णित है.
  3. चरण 2 में प्लाज्मिड मिश्रण करने के लिए 0.25 एम CACL 2 के 100 μl (2.5 एम स्टॉक से DNase / RNase मुक्त DDH 2 हे के साथ पतला) जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. फिर 2x BBS समाधान के 100 μl (50 मिमी जोड़नेएस, 280 मिमी NaCl, 1.5 मिमी और 2 4 HPO, 6.95 पीएच) ना धीरे लेकिन अच्छी तरह से मिश्रण. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए डीएनए मिश्रण सेते हैं.
  4. जबकि इंतज़ार कर रही है, 293T कोशिकाओं से मध्यम aspirate और 2 मिलीलीटर ताजा मध्यम बदलने. इनक्यूबेटर में कम से कम 10 मिनट के लिए अभिकर्मक पहले मध्यम पीएच संतुलन में लाना थाली लौटें.
  5. 293T ड्रॉप द्वारा कोशिकाओं को ड्रॉप करने के लिए चरण 3 से अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें. भंवर धीरे थाली और एक खुर्दबीन के नीचे कण गठन का पालन. 5% से कम 2 सीओ, 37 ° C रातोंरात सेते हैं. (Capo 4 / डीएनए तलछट के ठीक कण गठन कुशल अभिकर्मक के लिए महत्वपूर्ण है.)

3. हार्वेस्ट वायरल कणों (3-4 दिन)

  1. समय कोशिकाओं के बारे में है जिसके द्वारा 16 घंटे के बाद अभिकर्मक (3 दिन) 100% संगम तक पहुँचने, कोशिकाओं से मध्यम aspirate चाहिए और 2 मिलीलीटर ताजा नियमित DMEM के साथ बदलें. 37 ° रातोंरात सी सेते हैं.
  2. 4 दिन, ट्रॅन में EGFP अभिव्यक्ति देख द्वारा अभिकर्मक दक्षता का आकलनsfection नियंत्रण कक्ष (उच्च EGFP अभिव्यक्ति के साथ 90-100% की अभिकर्मक दक्षता एक अच्छा वायरल प्रस्तुत करने के एक विश्वसनीय कारक है.)
  3. Secreted, संक्रामक वायरल कणों से युक्त मध्यम ले लीजिए. > 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर अपकेंद्रित्र अवशिष्ट 293T कोशिकाओं को हटाने के और तैरनेवाला वायरस युक्त इकट्ठा करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, मध्यम 0.45 सुक्ष्ममापी झिल्ली फिल्टर के साथ मंजूरी दे दी जा सकती है. कणों वायरल संक्रमण में इस्तेमाल के लिए तैयार कर रहे हैं.

3. 3T3 कोशिकाओं का संक्रमण

1. बीज 3T3 कोशिकाओं (3 दिन)

अगले दिन से 20-30% संगम प्राप्त करने के लिए और एक 12-अच्छी तरह से थाली पर बीज 3T3 कोशिकाओं की उचित संख्या भाजित (१२,००० ~). 37 ° रातोंरात सी सेते हैं.

2. 3T3 कोशिकाओं (4 दिन) को संक्रमित

  1. वरीय कोशिकाओं देखो. 20-30% (कम से कम 50%) का संगम संक्रमण के लिए वांछित है.
  2. 5 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता polybrene एकत्र वायरल युक्त मध्यम जोड़ेंकणों. Pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं.
  3. 3T3 कोशिकाओं से मध्यम Aspirate, और अच्छी तरह से प्रति ऊपर वायरल मिश्रण के 1 मिलीलीटर जोड़ें. 37 ° रातोंरात सी सेते हैं. (Polybrene संक्रमण दक्षता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन बिल्कुल आवश्यक नहीं है, जैसा कि यह कुछ कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है, पहले परीक्षण की सिफारिश की है.)

3. संक्रमित कोशिकाओं (5 दिन और आगे) का चयन करें

  1. चौबीस घंटे के बाद संक्रमण, संक्रमित कोशिकाओं से वायरस और polybrene युक्त मध्यम aspirate, 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लो, और ताजा मध्यम बदलने. 37 ° C वसूली और विकास के लिए रातोंरात सेते हैं.
  2. संगामी जब (1-2 आमतौर पर दिन बाद), 37 ° रातोंरात सी कोशिकाओं और सेते विभाजित.
  3. अगले दिन, कोशिकाओं (<50% संगम वांछित है) से Aspirate मध्यम और ताजा 10 ग्राम / मिलीलीटर Blasticidin stably लिए चयन युक्त मध्यम के साथ जगह कोशिकाओं transduced. (Blasticidin को मारने के वक्र empirically एक विशेष सेल लाइन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.)

4. रिपोर्टर प्रकोष्ठों के Bioluminescence रिकॉर्डिंग

1. बीज संवाददाता कोशिकाओं

Blasticidin प्रतिरोधी संवाददाता कोशिकाओं का प्रचार और 35 मिमी संस्कृति व्यंजन पर विभाजित है. सहधारा तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. हम आम तौर पर circadian phenotyping के लिए प्रत्येक संवाददाता सेल लाइन के लिए ≥ 3 व्यंजन प्रत्येक शर्त के तहत तैयार.

2. तुल्यकालन और रिकॉर्डिंग माध्यम परिवर्तन

  1. सहधारा संवाददाता कोशिकाओं से मध्यम Aspirate, पीबीएस के साथ एक बार धो लो, और DMEM युक्त 10 सुक्ष्ममापी forskolin (या 200 एनएम dexamethasone) के साथ बदलें. 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते कोशिकाओं सिंक्रनाइज़. (वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं तापमान 23 चक्र या सीरम 24 सदमे से सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है.)
  2. प्रतीक्षा करते हुए, रिकॉर्ड तैयारके रूप में 3T3 कोशिकाओं के लिए आईएनजी मध्यम: 1x (HyClone) DMEM 10% FBS, 1x पेन / / Strep GLN, 1 सुक्ष्ममापी forskolin, 1 मिमी Luciferin, 25 मिमी HEPES, पीएच 7.4 से युक्त. सीरम और forskolin एकाग्रता empirically निर्धारित किया जा सकता है. बहुत गंभीरता से कोशिकाओं के लिए, phenol मध्यम लाल मुक्त इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. Forskolin उपचार के अंत में, मध्यम aspirate और ताजा बना रिकॉर्डिंग माध्यम के साथ बदलें.

3. संवाददाता कोशिकाओं के Bioluminescence रिकॉर्डिंग

  1. मध्यम परिवर्तन के बाद, 40 मिमी बाँझ और वैक्यूम वाष्पीकरण को रोकने के तेल के साथ जगह में coverslips मुहर के साथ संस्कृति व्यंजन को कवर.
  2. LumiCycle luminometer, जो एक इनक्यूबेटर सेट के अंदर एच 2 हे या सीओ 2 के बिना 36 डिग्री सेल्सियस पर रखा है पर बर्तन लोड.
  3. वास्तविक समय bioluminescence रिकॉर्डिंग शुरू. हम आम तौर पर एक सप्ताह के लिए लय रिकॉर्ड, मध्यम परिवर्तन और एक दूसरे सप्ताह के लिए सतत रिकॉर्डिंग (Savelyev एट अल जानकारी के लिए देखें) 25 से पीछा किया. (96 हम रिकॉर्डिंग के लिएकरूँगा प्लेटें, सिनर्जी SL2 रिकॉर्डिंग डिवाइस के रूप में इस्तेमाल किया गया था, विस्तार के लिए 1.1 चर्चा देखें).

5. डेटा विश्लेषण और प्रस्तुति

रिपोर्टर कोशिकाओं उच्च संकल्प मात्रात्मक luminescence रिकॉर्डिंग, प्ररूपी circadian घड़ी समारोह पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण सुविधा. चरण, अवधि लंबाई, ताल आयाम, और भिगोना दर सहित circadian मानकों को प्राप्त करने के लिए, हम LumiCycle विश्लेषण (Actimetrics) कार्यक्रम bioluminescence 5,14 डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपयोग. संक्षेप में, कच्चे डेटा आधारभूत हैं 1, फिट और आधारभूत - घटाया डेटा एक साइन लहर, जिसमें से पैरामीटर निर्धारित कर रहे हैं, के लिए फिट हैं. नमूने कि लगातार लय,> 90% आम तौर पर हासिल की है की भलाई के फिट दिखाने के लिए. मध्यम परिवर्तन पर उच्च क्षणिक bioluminescence के कारण, हम आम तौर पर विश्लेषण से डेटा का पहला चक्र बाहर.

डेटा प्रस्तुति के लिए, हम आमतौर ती (bioluminescence मायने रखता है, / सेक) के खिलाफ कच्चे डेटा की साजिशमुझे (दिन). आवश्यक होने पर, आधारभूत घटाया डेटा आयाम और चरण की तुलना करने के लिए साजिश रची जा सकता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम

1. चरण विशिष्ट circadian पत्रकारों

circadian घड़ी एक जैव रासायनिक नकारात्मक प्रतिक्रिया 1 तंत्र पर आधारित है. कोर प्रतिक्रिया पाश transcriptional Bmal1 activators और घड़ी, और repressors pers और crys, जो circadian / ई E'बॉक्स तत्वों बढ़ाने पर कार्य करने के लिए लयबद्ध जीन की अभिव्यक्ति का उत्पादन (सुबह चरण में, उदाहरण के लिए, Rev-erb α के साथ) के होते हैं. कोर पाश को नियंत्रित करता है और एकीकृत रात चरण के लिए कम से कम दो अन्य circadian सीआईएस तत्वों, DBP/E4BP4 बाध्यकारी तत्व,, और आतंक विरोधी / REV-ERB बाध्यकारी तत्व (RRE (डी बॉक्स दिन चरण में, उदाहरण के लिए, Per3 के लिए) उदाहरण के लिए, Bmal1) 17. कई circadian तत्वों द्वारा मिश्रित विनियमन उपन्यास मध्यवर्ती चरणों उत्पन्न कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, Cry1 transcription सभी तीन circadian तत्वों (और जीन की Cry1 1 intron में प्रमोटर RREs में तत्वों यानी ई / E'बॉक्स और डी - बॉक्स), अलग Cry1 शाम समय 13 चरण को जन्म देने के द्वारा मध्यस्थता है.

जीन विनियमन के इन तंत्र पर आधारित है, हम चार अलग संवाददाता constructs उत्पन्न: (PER2) पी घ ल्यूक और पी (Cry1) घ ल्यूक संवाददाताओं से दोनों ई / E'बॉक्स और विनियामक क्षेत्र 17 में डी - बॉक्स तत्वों से युक्त, 26,27, (Cry1) पी - Intron घ ल्यूक का प्रतिनिधित्व सभी तीन तत्वों द्वारा मिश्रित विनियमन (यानी, / ई E'बॉक्स, D-बॉक्स, और आरआरई) 13,17, और पी (Bmal1) घ ल्यूक विनियमित 9,17,19,21 RRE के द्वारा विशेष रूप से है. हम 3T3 कोशिकाओं में इन पत्रकारों संवाददाता अभिव्यक्ति के प्रत्याशित अलग चरणों (2 चित्रा) का उत्पादन शुरू करने के लिए.

2. आरएनएआई और pharmacologically acti के माध्यम से जीन पछाड़नायौगिकों ve

जब अभिकर्मक दक्षता उच्च है, सिंथेटिक siRNA transiently कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है नीचे जीन की अभिव्यक्ति दस्तक. जब अभिकर्मक तकनीकी रूप से कठिन है, एक shRNA अभिव्यक्ति वेक्टर stably lentiviral संक्रमण के माध्यम से कोशिकाओं में transduced, इतना है कि सेल द्वारा निर्मित shRNA जीन पछाड़ना (केडी) के लिए siRNA को संसाधित कर सकते हैं. यहाँ हम केडी Cry1 और Cry2 3T3 एक pLL3.7 गेटवे अभिव्यक्ति 9 वेक्टर (3B चित्रा) का उपयोग कोशिकाओं में U2OS कोशिकाओं में siRNA (चित्रा 3 ए) और shRNA उपयोग जीन के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं. 3T3 कोशिकाओं के अलावा, U2OS मॉडल एक और preeminent सेलुलर घड़ी मॉडल बन गया है मुख्यतः क्योंकि यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानव siRNA पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीनिंग (जैसे, मानव मूल, मजबूत circadian लय, पुष्टि के समारोह पैदा करने में सक्षम के लिए महत्वपूर्ण आवश्यकताओं को पूरा सभी ज्ञात घड़ी जीन, और अत्यधिक कुशल अभिकर्मक और करने के लिए उत्तरदायीमात्रात्मक luminescence रिकार्डिंग). दोनों प्रकार के सेल में, आरएनएआई की मध्यस्थता केडी घड़ी पिछले माउस (KO) पीटा और सेलुलर केडी अध्ययन 5,10,11,28 के साथ संगत phenotypes में हुई. उदाहरण के लिए, Cry1 केडी shortens अवधि लंबाई और ताल हठ को कम कर देता है, जबकि Cry2 केडी अवधि lengthens. इसके अलावा, छोटे अणुओं चयनित pharmacologically लक्ष्य और घबड़ा देना प्रोटीन समारोह (चित्रा -3 सी) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. lentivirus की मध्यस्थता जीन वितरण प्रणाली. (ए) दो lentiviral (PER2) पी घ ल्यूक संवाददाता वैक्टर और एक सीएमवी - EGFP योजनाबद्ध आरेख का निर्माण. केवल मेजबान कोशिका के जीनोम में एकीकरण के लिए इस क्षेत्र को दिखाया गया है. दोनों रिपोर्टर constructs में, घ Luc की प्रतिलेखन PER2 प्रमोटर के सीधे नियंत्रण में है. PLV7-BSD-P (PER2) घ ल्यूक वेक्टर (पुनःसंयोजन आधारित) क्लोनिंग, एक coexpressed Blasticidin प्रतिरोध जीन (बीएसडी) संक्रमित कोशिकाओं के चयन की सुविधा. PLV156 पी (PER2) घ ल्यूक वेक्टर (क्लोनिंग ligation आधारित), EGFP अनुवाद एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि (IRES) साइट घ ल्यूक के अनुप्रवाह द्वारा मध्यस्थता, दृश्य अवलोकन और संक्रमित कोशिकाओं की छंटाई FACS के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एक SV40 प्रमोटर / टर्मिनेटर (पी / टी) एक विसंवाहक (चर्चा देखने के 1.3) के रूप में प्रयोग किया जाता है. सीएमवी EGFP नियंत्रण वेक्टर EGFP अभिव्यक्ति एक मजबूत सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण के तहत ट्रांसफ़ेक्ट और संक्रमित GFP व्यक्त कोशिकाओं (बी) चित्र फ्लोरोसेंट. आमतौर पर, हम दोनों 293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक में और हमारे हित के सेल लाइनों, के रूप में इन कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति द्वारा संकेत lentiviral संक्रमण में उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2 चित्रा 2. चरण 3T3 कोशिकाओं में विशिष्ट bioluminescence पत्रकारों की अभिव्यक्ति lentiviral संवाददाता इस प्रयोग में इस्तेमाल वैक्टर (PER2) pLV7 Bsd पी घ ल्यूक, पी (Cry1) घ ल्यूक, (Cry1) पी - ल्यूक Intron घ, और पी (Bmal1) घ ल्यूक. प्रत्येक संवाददाता दोलन की एक विशिष्ट चरण में है, के रूप में तीर द्वारा संकेत दर्शाती है. जबकि PER2 और Cry1 सुबह दिन चरणों और रात चरण में Bmal1 प्रमोटर, (Cry1 पी) द्वारा मिश्रित विनियमन में प्रमोटरों ड्राइव शिखर bioluminescence - Intron ई - बॉक्स शरण, D-बॉक्स, और आरआरई तत्वों शिखर bioluminescence की शाम चरण प्रदान बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. आनुवंशिक और औषधीय संवाददाता कोशिकाओं में circadian bioluminescence लय की गड़बड़ी. Cry1 (ए) के प्रभाव और U2OS संवाददाता कोशिकाओं के सेलुलर लय पर siRNAs द्वारा Cry2 पछाड़ना. LumiCycle luminometer कोशिकाओं की bioluminescence रिकॉर्डिंग के लिए 35 मिमी व्यंजनों में इस्तेमाल किया गया था. चित्रा अनुकूलित है # Elsevier (2009) से अनुमति के साथ 10, 3T3 संवाददाता कोशिकाओं के सेलुलर लय पर shRNAs द्वारा Cry2 पछाड़ना के प्रभाव (बी). संदर्भ से. एक pLL3.7 गेटवे एक कैसेट U6 - shRNA युक्त वेक्टर Cry2 जीन पछाड़ना के लिए इस्तेमाल किया गया था. shRNA2 shRNA1 की तुलना में एक बेहतर पछाड़ना दक्षता के रूप में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा निर्धारित है. सिनर्जी luminometer कोशिकाओं के bioluminescence रिकॉर्डिंग के लिए एक 96-अच्छी तरह से थाली में इस्तेमाल किया गया था. रिकॉर्डिंग के लिए सेटिंग्स निम्नानुसार हैं: इनक्यूबेटर तापमान, 33 डिग्री सेल्सियस; एकीकरण समय, 15 सेकंड, अंतराल समय 30 मिनट (सी) cel पर छोटे अणु inhibitors का प्रभावU2OS संवाददाता कोशिकाओं की lular लय. और Roscovitine Chir99021 GSK-3 और CDK के खिलाफ निर्देशित, क्रमशः inhibitors. 384 अच्छी तरह प्लेटें में ViewLux (Chir99021 परख) प्रणाली और एक Tecan luminometer (Roscovitine परख) कोशिकाओं के bioluminescence रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया गया. चित्रा 19 # संदर्भ (कॉपीराइट 2008 नेशनल एकेडमी ऑफ साइंसेज, यूएसए) से अनुकूल है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

1. वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए संशोधन

1.1 रिकॉर्डिंग डिवाइस और throughput विचार

अपने वाणिज्यिक उपलब्धता की वजह से, (Actimetrics) LumiCycle वास्तविक समय 4,5,9,19,29-31 रिकॉर्डिंग के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया स्वचालित luminometer युक्ति बन गया है. LumiCycle डिटेक्टरों प्रकाश है, जो अत्यंत उच्च संवेदनशीलता और कम शोर 14 प्रदान photomultiplier ट्यूब (PMTs) के रूप में कार्यरत हैं, और इसलिए अत्यंत मंद bioluminescence luciferase आधारित डाटा अधिग्रहण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है. अन्य समान PMT आधारित उपकरणों (जैसे, Kronos, ATTO कं, और POLARstar ऑप्टिमा, बीएमजी LABTECH इंक) भी कई 32,33 अध्ययन में किया गया है.

LumiCycle परख 35 मिमी व्यंजन का उपयोग कर 96 करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, 384 या 1152 भी अच्छी तरह से उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) प्रयोगों के लिए थाली प्रारूपों. 1: HTS परख विकास मुख्य रूप से निम्नलिखित दो पहलुओं पर ध्यान केंद्रित) बेहतर उज्जवल luciferase और / या उच्च संवाददाता अभिव्यक्ति (नीचे देखें) के साथ संवाददाता कोशिकाओं, और 2) अत्यधिक संवेदनशील रिकॉर्डिंग डिवाइस है कि बहु - अच्छी तरह से प्लेटों को समायोजित. हम और दूसरों को ऐसे सिनर्जी SL2 (बायोटेक), M200 अनंत (Tecan) 19, (PerkinElmer) TopCount 28, और कल्पना (Perkin एल्मर) 34 के रूप में कई microplate पाठकों का इस्तेमाल किया है. हमारी प्रयोगशाला में, दोनों LumiCycle और सिनर्जी उपकरणों एक तापमान नियंत्रित और हलका सा इनक्यूबेटर में रखा जाता है. वैकल्पिक रूप से, अगर संसाधनों की अनुमति, रिकॉर्डिंग इकाइयों में एक कमरे के तापमान नियंत्रित रखा जा सकता है. HTS के लिए, एक पत्रकार और रिकॉर्डिंग डिवाइस के लिए एकीकरण / जोखिम समय और समय बिंदुओं के बीच अंतराल के रूप में महत्वपूर्ण सेटिंग्स empirically निर्धारित करना चाहिए.

LumiCycle परख एकल कोशिका प्रस्ताव पर स्थानिक जानकारी प्रदान नहीं करता है. यामागुची एट अल 35 और वेल्श एट अल. 4,5 int द्वारा वास्तविक समय bioluminescence इमेजिंग का बीड़ा उठायाएक बेहद संवेदनशील, कम शोर सीसीडी 15 कैमरे के लिए एकल कक्ष प्रस्ताव प्राप्त करने के साथ एक विशेष रूप से डिजाइन सूक्ष्मदर्शी egrating. हाल के वर्षों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और अधिक संवेदनशील इमेजिंग सिस्टम बन गए हैं (ओलिंप) LV200 और एक ultrasensitive ठंडा और पीछे से प्रबुद्ध इलेक्ट्रॉन सीसीडी और बहुरंगा फ़िल्टर 36,37 गुणा के साथ CellGraph (AB3000-B, ATTO) सहित. इमेजिंग भी अधिक परिष्कृत HTS प्रयोगों में, उदाहरण के लिए, एक ViewLux सीसीडी (Perkin एल्मर) imager GNF स्वचालित रोबोट प्रणाली (GNF सिस्टम) के साथ संयुक्त में इस्तेमाल किया गया है. इस प्रणाली के लिए बड़े पैमाने पर उपन्यास जीन और छोटे अणुओं कि घड़ी 10,12,19 समारोह को प्रभावित स्क्रीन सक्षम होना चाहिए.

1.2 luciferase पत्रकारों

Luciferases पौधों और cyanobacteria में 1990 के दशक के शुरू में circadian जीन अभिव्यक्ति की वास्तविक समय luminescence रिकॉर्डिंग में पहली बार इस्तेमाल किया गया है, और आमतौर पर बीस सौ 29,35,38-40 (एक के बाद से किया गया स्तनधारी प्रणाली में इस्तेमाल कियाlso 14,15 समीक्षा देखें). Luciferase पत्रकारों आम तौर पर कर रहे हैं कम विषाक्त और GFP के रूप में फ्लोरोसेंट पत्रकारों, बहुत कम 41 पृष्ठभूमि की वजह से अधिक संवेदनशील है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया bioluminescent संवाददाता जुगनू (Photinus pyralis) luciferase (ल्यूक +) में निर्माण pGL3 वेक्टर (PROMEGA) श्रृंखला, जिसमें देशी ल्यूक की कोडिंग क्षेत्र अनुकूलित प्रतिलेखन और अनुवाद के लिए संशोधित किया गया था. जुगनू luciferase और उसके अत्यधिक स्थिर और सेल पारगम्य सब्सट्रेट, डी Luciferin, लंबी अवधि के रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श संयोजन है. घ ल्यूक ल्यूक का एक संशोधित संस्करण + एक कीट सी टर्मिनस पर जुड़े हुए तेजी से प्रोटीन गिरावट के लिए अनुमति देने के दृश्य के साथ है. एक और उन्नत संस्करण, Luc2, उच्च और कम विषम अभिव्यक्ति के साथ pGL4 वेक्टर श्रृंखला (PROMEGA) में उपलब्ध है. हालांकि, हम ल्यूक + और ​​Luc2 के बीच एक प्रदर्शन में उल्लेखनीय transiently ट्रांसफ़ेक्ट में अंतर का पालन नहीं किया 3T3 और U2OS कोशिकाओं (नहीं दिखाया डेटा). हाल ही की एक रिपोर्ट में, ब्राजील क्लिक बीटल luciferase (ई ल्यूक) Luc + की तुलना में एक बहुत उज्ज्वल संकेत, एकल कक्ष 42 के लिए इमेजिंग उपयुक्त प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया था.

हाल ही में कई अध्ययन mPER2 का लाभ ले लिया है :: ल्यूक संलयन संवाददाता 4,5,9,19,25,29-31,43 माउस में दस्तक. इस संवाददाता प्रणाली की कोशिकाओं की SCN सहित और ऊतक explants के circadian phenotyping की अनुमति देता है. हमारे पिछले अध्ययनों में, हम behaviorally विशेषता घड़ी जीन knockouts के कई के साथ इस संवाददाता माउस लाइन को पार कर गया है और SCN, जिगर और फेफड़ों explants सुसंस्कृत पूर्व vivo में bioluminescence लय की गतिशीलता की जांच की, और dissociated SCN न्यूरॉन्स और 4 इन विट्रो में संवर्धित fibroblasts में, 5,9,31. इन अध्ययनों हमें घड़ी आपरेशन सेल और organismal स्तर पर आणविक विवरण में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए अनुमति दी.

1.3 जीन प्रसव के तरीके

e_content "> वेक्टर आधारित घड़ी संवाददाताओं महान बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करते हैं, क्योंकि वे क्षणिक अभिकर्मक 11,13,16,17 या lentiviral 5,9,18 पारगमन के माध्यम से विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है. बोझिल और कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, transiently ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कर सकते हैं, हालांकि स्थिर सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के निरंतर उपस्थिति में भी उगाया जा lentiviral वैक्टर अभी भी अपने सेल जीनोम, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अधिक से अधिक दक्षता और बहुमुखी प्रतिभा में स्थिर एकीकरण की वजह से पसंद कर रहे हैं. pLV7 ऊपर प्रस्तुत वेक्टर जो संक्रमित कोशिकाओं में किया जा सकता है के अलावा. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ चयनित, हम अन्य वैक्टर का इस्तेमाल किया है, उदाहरण के लिए, pLV156 पी (PER2) घ ल्यूक वेक्टर (PER2) पी घ अभिव्यक्ति कैसेट ल्यूक IRES-EGFP में EGFP अनुवाद एक आंतरिक ribosome प्रविष्टि द्वारा मध्यस्थता है. साइट घ ल्यूक के अनुप्रवाह (IRES), दृश्य और integrat साथ कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) अवलोकन के लिए अनुमति देता हैएड 5 वैक्टर (1 चित्रा) (नीचे देखें). एकीकरण साइट प्रभाव, एक विधान प्रमोटर और टर्मिनेटर (पी / टी) से संवाददाता ढाल एक विसंवाहक के रूप में पेश किया जा सकता है या लूभाव तुरंत PER2) पी (घ ल्यूक संवाददाता अभिव्यक्ति कैसेट (उदाहरण के लिए नदी के ऊपर, नीचे चित्र 1 ए में निर्माण ), के रूप में ब्राउन एट अल 18 और लियू एट अल द्वारा रिपोर्ट 5.

पिछले अध्ययनों से पता ऊतक विशेष आनुवंशिक गड़बड़ी के अन्वेषण के लिए दोनों vivo में और / या पूर्व vivo 44-48 नींव की स्थापना की. उदाहरण के लिए, वायरल कणों SCN SCN टुकड़ा तैयारी द्वारा बाद क्षेत्र में इंजेक्ट किया जा सकता है. पूर्व vivo परख द्वारा पीछा vivo में इस के लिए एक विकल्प के रूप में, SCN स्लाइस 1 और सुसंस्कृत पूर्व vivo dissected किया जा सकता है, बाद उच्च अनुमापांक वायरस के साथ ऊष्मायन द्वारा. हालांकि, कम संक्रमण अपेक्षाकृत मोटी ऊतक स्लाइस की दक्षता के कारण,एक अत्यधिक संगत पूर्व vivo प्रोटोकॉल को विकसित किए जाने की बनी हुई है.

सेल लाइनों और रिकॉर्डिंग की स्थिति की 1.4 विकल्प

3T3 माउस fibroblasts 16,17, U2OS मानव ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं 10,11,19,28, और माउस fibroblasts 9,13 चूहों से प्राप्त: क्या हम और घड़ी तंत्र के जैव रसायन और कोशिका जीव विज्ञान के बारे में पता है की ज्यादातर तीन सेलुलर मॉडल पर आधारित है 34. lentiviral वेक्टर प्रणाली दोनों विभाजन और गैर विभाजित स्तनधारी कोशिकाओं के मेजबान जीनोम में कुशल प्रसव और स्थिर एकीकरण की अनुमति देता है, और इसलिए क्षणिक अभिकर्मक के रूप में कुछ सेल प्रकार तक ही सीमित नहीं है. सेलुलर और शारीरिक प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के विनियमन में circadian घड़ियों की भूमिका को देखते हुए भविष्य के अध्ययन निश्चित रूप से सेल प्रकार की एक विस्तृत विविधता के लिए या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं को चूहों से प्राप्त का विस्तार करने के लिए,. ये सेल स्वायत्त घड़ी अध्ययन ऊतक ubiqu को उजागर करने में मदद करेगाitous, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक विशेष circadian घड़ियों के गुण.

यह ध्यान देने योग्य बात है कि रिपोर्टर कोशिकाओं पैदा विभिन्न पत्रकारों के अनुभवजन्य परीक्षण की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, विभिन्न प्रकार के वेक्टर और प्रमोटर के), हो सकता है और कभी कभी आगे अनुकूलन के लायक है. नहीं सभी सेल प्रकार सेल स्वायत्त लय है. सेल स्वास्थ्य और सेलुलर लय हठ, रिकॉर्डिंग माध्यम के अनुकूलन में सुधार अक्सर आवश्यक है. 3T3 रिकॉर्डिंग माध्यम के लिए एक विकल्प के रूप में, उदाहरण के लिए, रिकॉर्डिंग U2OS कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया माध्यम के रूप में इस प्रकार है: 1x (Invitrogen) DMEM, 2% B-27, 1 forskolin सुक्ष्ममापी, 1 मिमी Luciferin, 14.5 NaHCO3 मिमी, 10 मिमी HEPES (7.2 पीएच). 1 मिमी Luciferin आमतौर पर पर्याप्त है, लेकिन एक अंतिम एकाग्रता (0.1-1 मिमी) प्रत्येक प्रकार / सेल रिपोर्टर के लिए निर्धारित किया जा सकता है. Forskolin आवश्यक नहीं हो सकता है और अपनी एकाग्रता empirically प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारित किया जा सकता है.

Lentiviral तैयार करने में 1.5 अभिकर्मक दक्षता

उच्च tr293T कोशिकाओं के ansfection दक्षता एक अच्छा वायरल प्रस्तुत करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रमुख कारणों में से एक अभिकर्मक अभिकर्मक के 293T कोशिकाओं और चुनाव के स्वास्थ्य शामिल हैं. 293T कोशिकाओं को बहुत नकचढ़ा और सावधानी से निपटने की आवश्यकता है. इस प्रकार, सेल विकास दर और आकारिकी सावधानी से निगरानी की जानी चाहिए. स्थिरता के लिए, हम कि सीरम पहले परीक्षण किया जाना है और एक ही परीक्षण उसके बाद कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया बैच की सलाह देते हैं. हम हमेशा नए 2x BBS और CACL 2 स्टॉक समाधान का परीक्षण और 0.25 उच्च बीतने के संख्या और / या प्रदर्शित धीमी विकास दर का इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए एम. कोशिकाओं के चारों ओर 2 CACL का काम कर रहे एकाग्रता का अनुकूलन. 293T कोशिकाओं को आसानी से अभिकर्मक अभिकर्मकों की एक संख्या के साथ transfectable हैं. 4 Capo के अलावा, हम भी Fugene 6 (Roche या PROMEGA) या Lipofectamine 2000 (Invitrogen) के साथ उत्कृष्ट अभिकर्मक दक्षता हासिल की. ये लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मकों (lipofection) अधिक महंगे हैं, लेकिन बेहतर 4 Capo से अभिकर्मक स्थिरता दे. के लिएr बड़े पैमाने पर lentiviral preps, हम अभिकर्मक के लिए कम लागत की वजह CaPO4 का उपयोग करने की सलाह देते हैं.

Clonal सेल लाइनों का 1.6 पीढ़ी

संयुक्त राष्ट्र केंद्रित कच्चे वायरल कणों अपेक्षाकृत कम टिटर (10 6 वायरल कणों / मिलीलीटर) कर रहे हैं, और संवाददाता में अभिव्यक्ति transduced कोशिकाओं कम है. हालांकि इस सबसे LumiCycle रिकॉर्डिंग के रूप में इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है, उज्जवल संवाददाताओं से अक्सर, की जरूरत है उच्च throughput एक कम संवेदनशील रिकॉर्डिंग डिवाइस का उपयोग assays में उदा. रिपोर्टर अभिव्यक्ति उच्च अनुमापांक वायरल preps का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है. ऐसा करने के लिए, हम बड़ा संस्कृति वाहिकाओं अभिकर्मक के लिए इस तरह के as15 सेमी व्यंजन का उपयोग कर रहे हैं, और मीडिया 4 दिन और 5 दिन में दो बार इकट्ठा करने की सलाह देते हैं. 10x एकाग्रता (10 7 वायरल कणों / मिलीलीटर) के लिए, केन्द्रापसारक फिल्टर उपकरणों (Millipore) का उपयोग छानने का काम करते हैं. 100x या अधिक एकाग्रता (8 ≥ 10 वायरल कणों / मिलीलीटर) के लिए, ultracentrifugation प्रदर्शन के रूप में पहले से वर्णित 5,18 लंबाई के रूप में महत्वपूर्ण circadian मापदंडों को बदल नहीं करता. यदि एक समरूप सेल आबादी वांछित है, clonal सेल लाइनों FACS आधारित एकल 96 अच्छी तरह प्लेटें में छँटाई सेल के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, यह जरूरी है कि इन clonal कोशिकाओं को सावधानी से जांच की जानी है, सेल आकारिकी पैतृक कोशिकाओं से अप्रभेद्य होना चाहिए, और अवधि की लंबाई और आयाम के रूप में घड़ी गुण संक्रमित सेल की आबादी का प्रतिनिधि होना चाहिए.

2. सेल स्वायत्त रिपोर्टर घड़ी मॉडल के आवेदन

ऊतक या पशु मॉडल के विपरीत, सेल आधारित मॉडल आनुवंशिक और pharmacologic perturbations करने के लिए उत्तरदायी हैं, और जब आवश्यक हो, तो भी HTS स्वरूपों में उपयोग. जीन समारोह की गड़बड़ी अति अभिव्यक्ति या आरएनएआई की मध्यस्थता पछाड़ना द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. चयनात्मक छोटे अणुओं प्रोटीन समारोह के साथ हस्तक्षेप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ हम संक्षेप घiscuss circadian अध्ययन में सेल स्वायत्त घड़ी मॉडल के कुछ का उपयोग करता है.

कोर घड़ी तंत्र के 2.1 अध्ययन

सेल स्वायत्त घड़ी मॉडल बहुत यंत्रवत अध्ययनों की है. Hogenesch और उनके सहयोगियों ने 3T3 मॉडल का इस्तेमाल करने के लिए दिखाने के लिए crys कि प्रतिक्रिया दमन घड़ी 16 समारोह, और U2OS मॉडल घड़ी समारोह 11 की प्रणाली स्तर गुण की जांच के लिए आवश्यक है. हम Cry1 / नियोजित: Cry2 / fibroblast चूहों से प्राप्त करने के लिए दिखाने के लिए देरी प्रतिक्रिया दमन घड़ी समारोह 13 के लिए आवश्यक है कि मॉडल, और Bmal1 / fibroblast मॉडल दिखाने के लिए कि Rev-erbα और β में अनावश्यक भूमिका निभाते हैं आरआरई की मध्यस्थता लयबद्ध जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित करने, और कि Bmal1 ताल समीक्षकों 9 कोर घड़ी समारोह के लिए आवश्यक नहीं है. इसके अलावा, संवाददाता कोशिकाओं में रासायनिक जांच की पहचान और / या जी एस के कार्य का स्पष्टीकरण की अनुमति दीK-3 β (अवधि को छोटा जब परेशान) 19, CK1σ और ε 49 (लंबी अवधि जब परेशान), और CK1α 12. नीचे के रूप में चर्चा की, इन मॉडलों अतिरिक्त घड़ी घटकों की पहचान की सुविधा. रणनीतिक, इन सेलुलर मॉडल बुनियादी तंत्र है, जो तब लिए vivo सत्यापन और अन्वेषण में नई प्रविष्टि अंक प्रदान के तेजी से खोज के लिए और अधिक विनयशील हैं.

2.2 घड़ी कारकों की पहचान

कोर प्रतिक्रिया पाश के अलावा, घड़ी तंत्र भी विविध संकेतन और विनियामक कारकों को एकीकृत. अतिरिक्त घड़ी घटकों और संशोधक की पहचान के लिए, सेल स्वायत्त घड़ी मॉडल निहित मारक, pleiotropic प्रभाव, और विकास के आनुवंशिक उत्परिवर्ती पशु 50 मॉडल के साथ जुड़े मुआवजा की वजह से चूहों में आनुवंशिक स्क्रीनिंग पर फायदेमंद हैं. संयोजन में सेल आधारित कार्यात्मक जीनोमिक्स appro के साथ स्क्रीनदर्द, प्रभावी ढंग से किया गया है बाहर उच्च throughput रिकॉर्डिंग सिस्टम उपन्यास घड़ी 10,28 कारकों की पहचान के लिए किया जाता है स्क्रीन siRNA जीनोम चौड़ा और shRNA पुस्तकालयों का उपयोग कर. इसी तरह, एक घड़ी 12,19,34,49 समारोह पर अपने प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विविध छोटे अणुओं के लिए रासायनिक जैविक दृष्टिकोण और स्क्रीन के लिए काम कर सकते हैं. हालांकि प्रमुख घड़ी जीन और उनके कार्यों की पहचान की गई है, इन स्क्रीन अतिरिक्त घटकों या संशोधक है कि विनियमन या घड़ी की मॉडुलन में शामिल कर रहे हैं की पहचान की है. इन संशोधक के कई तुल्यकालिक या अतुल्यकालिक संकेत (घड़ी इनपुट) के संकेत पारगमन एकीकरण की विशेष तौर तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

घड़ी outputs 2.3 अध्ययन

हालांकि vivo में लगभग सभी कोशिकाओं circadian घड़ियों, इन विट्रो में संवर्धित कोशिकाओं जरूरी प्रकट circadian लय नहीं प्रदर्शित करते हैं. इस संदर्भ में, संवाददाता दृष्टिकोण करने के लिए कि क्या परीक्षण के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता हैघड़ी तंत्र एक विशेष सेल प्रकार में मौजूद है. सेल स्वायत्त घड़ी तंत्र की उपस्थिति इन कोशिकाओं में, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo में ऊतकों में घड़ी outputs माइक्रोएरे या शाही सेना अनुक्रमण 51,52, विनियामक नेटवर्क, proteome, और metabolome transcriptome सहित अध्ययन वारंट. इन अध्ययनों जीनोम चौड़ा शाही सेना और प्रोटीन अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच करने और इस प्रकार सेल आधारित assays luminescence संवाददाता है कि जरूरी अंतर्जात अभिव्यक्ति को प्रतिबिंबित नहीं करते पूरक होगा.

3. सेल स्वायत्त घड़ी मॉडल के महत्व

SCN भीतर और अलग सेल और ऊतक प्रकार भर circadian समारोह के समन्वय सामान्य 30 शरीर क्रिया विज्ञान का एक महत्वपूर्ण पहलू है. केंद्रीय SCN और परिधीय घड़ियों समग्र circadian संगठन के सभी आवश्यक भागों हैं. SCN / प्रकाश अंधेरे चक्र चढ़ना करने के लिए रेटिना से सीधे प्रकाश प्राप्त इनपुट, और करने के लिए एक समन्वयक के रूप में कार्य करता हैदोनों neuronal और हार्मोनल कनेक्शन के माध्यम से परिधीय घड़ियों सिंक्रनाइज़. आंतरिक तुल्यकालन के अलावा, परिधि के ऊतकों और कोशिकाओं के भीतर आणविक घड़ी की कल भी transcriptional उत्पादन नेटवर्क है, जो अंत में शरीर विज्ञान और व्यवहार में प्रकट circadian लय सरकार की असंख्य orchestrates.

इस प्रकार, दोनों प्रणालीगत और स्थानीय संकेतों circadian शरीर क्रिया विज्ञान को विनियमित करने, और वहाँ एक करने के लिए परोक्ष रूप से प्रणालीगत SCN से निकलती संकेतों द्वारा विनियमित उन बनाम सेल स्वायत्त घड़ियों द्वारा circadian सीधे विनियमित जीन को उजागर करने की आवश्यकता है. परिधीय घड़ियों की भूमिका सेल स्वायत्त घड़ी मॉडल में अध्ययन किया जा सकता है, जो में प्रणालीगत प्रभाव हटा रहे हैं. जिगर के मामले में, ऊतक विशेष विनियामक नेटवर्क में स्थानीय शरीर क्रिया विज्ञान 51,53 लय उत्पन्न करते हैं. इन विट्रो में और vivo circadian लय में तुलना करके, हम सेल स्वायत्त और प्रणालीगत क्यू संचालित घड़ी कार्यों के बीच भेदभाव करने में सक्षम हो जाएगा. दरअसल, recenटी के अध्ययन के लिए यकृत जीन अभिव्यक्ति 6,51,52 में जिगर घड़ी के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका प्रकट करने के लिए शुरू कर दिया है. विभिन्न ऊतकों और सेल प्रकार विशिष्ट घड़ी विभिन्न शारीरिक outputs मॉडल का प्रतिनिधित्व के क्षेत्र वारंट विकास में भविष्य के अनुसंधान.

जैव रसायन और घड़ी तंत्र की कोशिका जीव विज्ञान का पिछला अध्ययन सेल और ऊतक प्रकार, विशेष रूप से 3T3 सहित, U2OS, माउस fibroblasts, और जिगर की एक सीमित संख्या पर काफी हद तक भरोसा किया है. सबसे circadian अध्ययन में एक अंतर्निहित धारणा है कि सभी सेल और ऊतक प्रकार, और जीन समारोह एक कोशिका या ऊतक प्रकार में निर्धारित घड़ी में उसी तरह काम करता है और आम तौर पर सभी कोशिकाओं में 7 सार्वभौमिक लागू माना जाता है. हालांकि, स्थापना और अधिक सेल स्वायत्त घड़ी मॉडल निस्र्पक द्वारा भविष्य के अध्ययन के ऊतक विशिष्ट घड़ी स्थानीय circadian जीव विज्ञान अंतर्निहित गुण को उजागर करने की उम्मीद कर रहे हैं.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS 0,920,417) (एसीएल) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201
B-27 Invitrogen 17504-044
D-Luciferin Biosynth L-8220
Poly-L-lysine Sigma P4707
Polybrene Millipore TR-1003-G
Forskolin Sigma F6886
All other chemicals Sigma
Equipment
Tissue culture incubator 5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics

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Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).

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