Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

Summary

Orologi circadiani funzionare all'interno di singole celle, cioè, sono cellule autonome. Qui, descriviamo i metodi per la generazione di cellule autonome modelli di orologio con tecniche non invasive, luciferasi a base di tecnologia in tempo reale bioluminescenza. Cellule Reporter fornire trattabili, sistemi modello per lo studio della biologia funzionale circadiano.

Abstract

Nei mammiferi, molti aspetti del comportamento e della fisiologia, come cicli sonno-veglia e il metabolismo del fegato sono regolati da orologi circadiani endogeni (recensione ^1,2). Il circadiano cronometraggio è un sistema gerarchico multi-oscillatore di rete, con l'orologio centrale situato nel nucleo soprachiasmatico (SCN), la sincronizzazione e il coordinamento extra-SCN e periferiche orologi altrove ^1,2. Le singole cellule sono le unità funzionali per la generazione e il mantenimento dei ritmi circadiani ^3,4, e questi oscillatori di diversi tipi di tessuto della quota di un organismo molto simile meccanismo biochimico feedback negativo. Tuttavia, a causa di interazioni a livello della rete neuronale nel SCN e attraverso ritmiche, segnali sistemici a livello organismal, ritmi circadiani a livello organismal non sono necessariamente cellula-autonoma ^5-7. Rispetto agli studi tradizionali di attività locomotoria in vivo e ex vivo SCN espianti, cell-base in vitro permettono la scoperta di difetti circadiani cellule autonome ^5,8. Strategica, a base di cellule modelli sono più trattabili sperimentalmente per la caratterizzazione fenotipica e rapida scoperta di meccanismi di clock di base ^5,8-13.

Dato che i ritmi circadiani sono dinamiche, misure longitudinali con alta risoluzione temporale sono necessari per valutare la funzione orologio. Negli ultimi anni, registrazione in tempo reale utilizzando bioluminescenza luciferasi di lucciola come reporter è diventata una tecnica comune per studiare ritmi circadiani nei mammiferi ^14,15, in quanto permette di esaminare la persistenza e dinamiche di ritmi molecolare. Per monitorare ritmi circadiani cellule autonome di espressione genica, reporter luciferasi può essere introdotto nelle cellule tramite trasfezione transiente ^13,16,17 o trasduzione stabile ^5,10,18,19. Qui si descrive un protocollo stabile trasduzione con lentivirus-mediata consegna del gene. Tl sistema vettore lentivirale è superiore ai metodi tradizionali come trasfezione transiente e trasmissione germinale causa della sua efficienza e versatilità: consente consegna efficiente e stabile integrazione nel genoma dell'ospite sia divisione e non divisione delle cellule ^20. Una volta che una linea cellulare reporter viene stabilita, la dinamica della funzione orologio può essere monitorata tramite registrazione bioluminescenza. Per prima cosa descrivere la generazione di P (Per2)-d linee giornalista Luc, e quindi i dati presenti di questo e di altri giornalisti circadiani. In questi saggi, fibroblasti di topo 3T3 e osteosarcoma U2OS cellule umani sono usati come modelli cellulari. Discutiamo anche diversi modi di utilizzo di questi modelli di clock in studi circadiani. Metodi descritti qui può essere applicato ad una grande varietà di tipi cellulari per studiare le basi cellulari e molecolari di orologi circadiani, e possono risultare utili per affrontare problemi in altri sistemi biologici.

Protocol

1. Costruzione di lentivirali Reporter luciferasi

Un costrutto reporter di mammifero circadiano solitamente contiene una cassetta di espressione in cui è fuso con un promotore circadiano il gene della luciferasi. Sia legatura e ricombinazione basata strategie sono comunemente usati per la clonazione del DNA. Come esempio, qui si descrive un metodo basato ricombinazione clonazione per generare una Gateway (Per2) P-d giornalista lentivirale Luc, in cui la luciferasi destabilizzato (d Luc) è sotto il controllo del promotore di topo Per2.

1. Clonazione di Per2 promotore. Utilizzare PCR per amplificare il frammento di DNA Per2 promotore di 526 bp, a monte del sito di inizio trascrizione da un Per2 topo clone BAC ^9-13, utilizzando un primer forward (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') e un primer reverse (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), e clone in pENTR5'-vettore TOPO (Invitrogen) per generarepENTR5'-P (Per2).
2. Clonazione di d Luc. La Luc d contiene il gene della luciferasi di lucciola e un terminale C sequenza PEST per una rapida degradazione proteica come precedentemente descritto ^21. Utilizzare PCR per amplificare il frammento di DNA d Luc, e clone in pENTR / D-TOPO vettore (Invitrogen) per generare pENTR / Dd Luc.
3. Costruzione del vettore reporter. Mescolare i due plasmidi pENTR, pENTR5'-P (Per2) e pENTR / Dd Luc, con il vettore di destinazione lentivirale pLV7-Bsd (Bsd, gene di resistenza blasticidina), ed eseguire la reazione di ricombinazione con Clonase per generare un pLV7-Bsd-P (Per2) d-Luc reporter (Figura 1). pLV7-BSD è una versione modificata (realizzato nel nostro laboratorio) di pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) in cui sono stati inseriti il virus dell'epatite woodchuck post-trascrizionale di regolamentazione elemento (WPRE) sequenze ²² immediatamente a valle dell'espressione ca ssette per migliorare l'espressione genica.

2. Produzione di particelle lentivirali

1. Cellule semi 293T (giorno 1)

1. Crescere renali embrionali umane (HEK) 293T al 90-100% di confluenza in regolare DMEM supplementato con 10% FBS e 1x Penicillina-Streptomicina-Glutammina (PSG) su piatti di coltura 10 centimetri. (Cellule in rapida crescita con il numero di passaggio basso sono fondamentali per la trasfezione efficiente.)
2. Prima della semina delle cellule per la trasfezione, coat piastre da 6 pozzetti di coltura con l'aggiunta di 1 ml di 0,001% di poli-L-lisina in PBS ad ogni pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 20 min. Aspirare la soluzione e lavare una volta con PBS 1x prima dell'uso.
3. Separa celle 293T con tripsina e di semi di 0.75 x 10 ⁶ cellule su ciascun pozzetto di pre-piastre rivestite con 2 ml di DMEM regolare. Swirl le piastre accuratamente per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in ciascun pozzetto. Crescere le cellule in incubatore a 37 ° C per una notte.

tep "> 2. trasfezione transitoria Via Capo ₄ / precipitazione del DNA (giorno 2)

1. Osservare le cellule seminate dal giorno 1. Cellulare dovrebbe raggiungere la confluenza del 80-90%.
2. Preparare mix plasmide trasfezione in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml aggiungendo 2 pg di DNA di un plasmide reporter di lentivirale (ad esempio, pLV7-P (Per2) d-Luc; Liu lab) ed i tre vettori di imballaggio (1,3 mcg Gag / Pol, 0,5 mg Rev, e 0,7 mg VSVG, Invitrogen). Come controllo sia per trasfezione e successiva infezione, di solito comprendono un pozzo supplementare per trasfezione in un vettore lentivirale espressione di GFP, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), harboring maggiore proteina fluorescente verde (EGFP) sotto il controllo del promotore CMV come descritto in precedenza ^20.
3. Aggiungere 100 ml di 0,25 M CaCl ₂ (diluito con DNasi / RNasi-free DDH ₂ O da 2,5 magazzino M) al mix plasmide al punto 2 e mescolare accuratamente. Aggiungere quindi 100 ml di soluzione di 2x BBS (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 6,95) e mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare la miscela DNA a temperatura ambiente per 15 min.
4. In attesa, aspirare media da cellule 293T e cambiare a 2 ml di terreno fresco. Riportare la piastra alla incubatore per almeno 10 minuti per equilibrare pH medio prima della transfezione.
5. Aggiungi mix di trasfezione dal punto 3 al 293T cellule goccia a goccia. Agitare delicatamente la piastra e osservare la formazione di particelle al microscopio. Incubare al 5% di CO _2, 37 ° C per una notte. (Formazione di particelle di precisione del Capo ₄ precipitato / DNA è fondamentale per la trasfezione efficiente.)

3. Particelle virali Harvest (giorni 3-4)

1. Circa 16 ore dopo la trasfezione (giorno 3) con cui cellule tempo dovrebbe raggiungere il 100% di confluenza, aspirare media da cellule e sostituire con 2 ml di DMEM fresco regolare. Incubare a 37 ° C per una notte.
2. Il giorno 4, valutare l'efficienza di trasfezione osservando espressione EGFP nel transfection cellule di controllo (efficienza di trasfezione di 90-100% con l'espressione di EGFP elevata è un fattore predittivo affidabile di una buona preparazione virale.)
3. Raccogliere il mezzo contenente secrete, particelle virali infettive. Centrifugare a> 2000 xg per 5 minuti per rimuovere i residui di cellule 293T e raccogliere il surnatante contenente virus. In alternativa, il supporto può essere eliminato con un filtro da 0,45 micron membrana. Le particelle virali sono pronti per l'uso in infezioni.

3. Infezione di cellule 3T3

1. Cellule 3T3 Seed (giorno 3)

Spalato e numero di sementi adeguate (~ 12.000) di cellule 3T3 su un 12-pozzetti per ottenere 20-30% confluenza di giorno successivo. Incubare a 37 ° C per una notte.

2. Infettare le cellule 3T3 (giorno 4)

1. Osservare le cellule seminate. Confluenza del 20-30% (meno del 50%) è desiderato per l'infezione.
2. Aggiungere polibrene ad una concentrazione finale di 5 pg / ml per il mezzo contenente raccolti viraleparticelle. Mescolare bene pipettando.
3. Aspirare il terreno da cellule 3T3, e aggiungere 1 ml della suddetta miscela virale per pozzetto. Incubare a 37 ° C per una notte. (Polybrene viene utilizzato per migliorare l'efficienza dell'infezione, ma non è assolutamente necessaria. Come può essere tossico per alcune cellule, previo controllo è raccomandato.)

3. Selezionare cellule infette (giorno 5 e successivi)

1. Ventiquattro ore dopo l'infezione, aspirare terreno contenente virus e polibrene dalle cellule infette, lavare una volta con PBS 1x, e cambiare con terreno fresco. Incubare a 37 ° C per una notte per il recupero e la crescita.
2. Quando confluenti (di solito 1-2 giorni dopo), dividere le celle e incubare a 37 ° C per una notte.
3. Il giorno seguente, medie aspirato dalle cellule confluenza (<50% è desiderato) e sostituirlo con mezzo fresco contenente 10 ug / ml di blasticidina per selezionare stabilmente trasdotte. (Blasticidina kill-curva deve essere empiricamente determinato per una linea cellulare di particolare.)

4. Registrazione bioluminescenza di celle Reporter

1. Seed giornalista cellule

Propagare blasticidina cellule resistenti giornalista e dividere su 35 mm piastre di coltura. Incubare a 37 ° C fino confluenti. Noi di solito preparare ≥ 3 piatti per ogni linea cellulare giornalista sotto ogni condizione di fenotipizzazione circadiano.

2. Sincronizzazione e modifica di supporto di registrazione

1. Aspirare il terreno dalle cellule giornalista confluenti, lavare una volta con PBS, e sostituirlo con DMEM contenente 10 pM forskolina (o 200 nM desametasone). Incubare a 37 ° C per 1 ora per sincronizzare le cellule. (In alternativa, le cellule possono essere sincronizzati da ²³ cicli di temperatura o scosse siero ^24.)
2. Durante l'attesa, la preparazione di registrazioneMedio ING per 3T3 come segue: 1x DMEM (HyClone) contenente 10% FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 pM forskolin, 1 mM luciferina, HEPES 25 mM, pH 7,4. E la concentrazione sierica forskolin possono essere determinate empiricamente. Per le cellule molto debole, rosso fenolo terreno privo possono essere utilizzati.
3. Alla fine del trattamento forskolina, aspirare medio e sostituirlo con supporto di registrazione appena fatta.

3. Registrazione bioluminescenza di cellule del reporter

1. Dopo il cambiamento medio, coprire piastre di coltura con 40 millimetri coprioggetto sterili e tenuta in posizione con grasso per vuoto per evitare l'evaporazione.
2. Caricare le stoviglie sul luminometro LumiCycle, che è mantenuta all'interno di un incubatore a 36 ° C senza H ₂ O e CO _2.
3. Inizio registrazione in tempo reale bioluminescenza. Di solito registrare ritmi per 1 settimana, seguito dal cambiamento medio e registrazione continua per la seconda settimana (vedi Savelyev et al. Per i dettagli) ^25. (Per la registrazione di 96-noill piatti, Synergy SL2 è stato usato come dispositivo di registrazione, vedere discussione 1.1 per i dettagli).

5. Analisi dei dati e presentazione

Cellule Reporter facilitare registrazione ad alta risoluzione quantitativa luminescenza, fondamentale per determinare effetti fenotipici sulla funzione orologio circadiano. Per ottenere i parametri circadiani, compresi l'introduzione, durata del periodo, l'ampiezza del ritmo, e il tasso di smorzamento, si utilizza il programma di analisi LumiCycle (Actimetrics) per analizzare i dati bioluminescenza ^5,14. Brevemente, i dati grezzi sono basale installare prima, e basale sottratto dati sono montati una sinusoide, da cui sono determinati i parametri. Per i campioni che mostrano ritmi persistenti, la bontà di adattamento del> 90% si ottiene in genere. A causa di alta bioluminescenza transitoria upon cambiamento medio, di solito esclude il primo ciclo di analisi dati.

Per la presentazione dei dati, di solito tracciare i dati grezzi (bioluminescenza, conteggi / sec) contro time (giorni). Se necessario, i dati di base-sottratti possono essere tracciati per confrontare ampiezza e fase.

6. Risultati rappresentativi

1. Giornalisti circadiani fase-specifici

L'orologio circadiano è basato su un meccanismo biochimico feedback negativo ^1. L'anello di retroazione nucleo è costituito da attivatori trascrizionali Bmal1 e orologio, e repressori PERS e cristallina, che agiscono sulle circadiani E / E'-box per la produzione di elementi enhancer del gene espressione ritmica (con fase mattina, ad esempio, Rev-erb α). Il ciclo di base regola e integra almeno altri due circadiani cis-elementi, l'elemento di legame DBP/E4BP4 (D-box, per la fase giorno, ad esempio, PER3) e il ROR / REV-ERB elemento di rilegatura (RRE, per la fase notte, ad esempio, Bmal1) ^17. Regolazione combinatoria da più elementi circadiani può generare nuove fasi intermedie. Per esempio, Cry1 trascrizionezione è mediata da tre elementi circadiani (cioè E / E'-box e D-box elementi del promotore e RREs nel primo introne del gene Cry1), dando luogo alla distinta Cry1 sera-tempo di fase ^13.

Sulla base di questi meccanismi di regolazione genica, abbiamo generato quattro costrutti diversi giornalista: P (Per2)-d Luc e P (Cry1)-d reporter Luc contenenti sia E / E'-box e D-box elementi nella regione regolatrice ^{17, 26,27,} P (Cry1) - Intron-d Luc rappresenta regolazione combinatoria da tutti e tre gli elementi (ad esempio, E / E'-box, D-box, e RRE), ^13,17, e P (Bmal1)-d Luc regolamentato esclusivamente da RRE ^9,17,19,21. Abbiamo introdotto questi giornalisti in cellule 3T3 per produrre le fasi previste distinte di espressione giornalista (Figura 2).

2. Knockdown Gene tramite RNAi e farmacologicamente Active composti

Quando è alta efficienza di trasfezione, siRNA sintetico può essere trasfettate in cellule di abbattere espressione genica. Quando trasfezione è tecnicamente difficile, un vettore di espressione shRNA può essere stabilmente trasdotti nelle cellule tramite infezione lentivirale, così che shRNA prodotta dalla cella viene elaborato per siRNA per knockdown gene (KD). Presentiamo qui di effetti KD Cry1 e Cry2 geni usando siRNA in cellule U2OS (Figura 3A) e shRNA in cellule 3T3 usando un vettore di espressione pLL3.7 Gateway ⁹ (Figura 3B). Oltre alle cellule 3T3, il modello U2OS è diventato un altro modello preminente orologio cellulare soprattutto perché soddisfa i requisiti chiave per high-throughput screening di librerie disponibili in commercio siRNA umani (ad esempio, l'origine umana, in grado di generare robusti ritmi circadiani, funzione convalidato di tutti i geni orologio noti e suscettibili di transfezione altamente efficiente eregistrazione luminescenza quantitativa). In entrambi i tipi di cellule, mediato da RNAi KD portato a fenotipi orologio coerenti con knockout mouse precedente (KO) e cellulari studi KD ^5,10,11,28. Ad esempio, Cry1 KD periodo accorcia lunghezza e riduce la persistenza del ritmo, mentre Cry2 KD allunga periodo. Inoltre, selezionate piccole molecole possono essere utilizzate per farmacologicamente bersaglio e funzione proteica perturbano (Figura 3C).

Figura 1. Il lentivirus-mediata gene delivery system. (A) Rappresentazione schematica di due lentivirale P (Per2)-d vettori giornalista Luc e CMV-EGFP costruire. Solo la regione di integrazione nel genoma della cellula ospite viene mostrato. In entrambi i costrutti reporter, la trascrizione di d Luc è sotto il controllo diretto del promotore Per2. Nel pLV7-Bsd-P (Per2)-d Luc vettore (ricombinazione basata clonazione), un gene di resistenza coexpressed blasticidina (Bsd) facilita la selezione di cellule infette. Nel pLV156-P (Per2) d-Luc vettoriale (legatura basata clonazione), traduzione EGFP è mediata da un sito interno voce ribosoma (IRES) a valle di Luc d, consentendo l'osservazione visiva e smistamento FACS di cellule infette. Inoltre, un promotore SV40 / terminatore (P / T) viene utilizzato come isolante (vedere discussione 1.3). Nel CMV-EGFP controllo vettoriale, espressione EGFP è sotto il controllo di un forte promotore CMV. (B) di immagini fluorescenti GFP-transfettate esprimenti e cellule infettate. Tipicamente, ottenere elevata efficienza sia in trasfezione transiente di cellule 293T e nelle infezioni lentivirali di linee cellulari di nostro interesse, come indicato dall'espressione GFP in queste cellule. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Fase-specifico espressione del reporter bioluminescenza in cellule 3T3 I vettori lentivirali del reporter usati in questo esperimento sono pLV7-BSD-P (Per2) d-Luc, P (Cry1) d-Luc, P (Cry1) -. Intron d-Luc, e P (Bmal1)-d Luc. Ogni giornalista presenta una distinta fase di oscillazione, come indicato dalle frecce. Mentre il Per2 e Cry1 unità promotori bioluminescenza picco a mattina-day fasi e il promotore Bmal1 nella fase notte, regolazione combinatoria dalla P (Cry1) - Intron ospitare E-box, D-box, e gli elementi RRE conferisce fase serata di bioluminescenza picco . Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Perturbazione genetica e farmacologica dei ritmi circadiani bioluminescenza nelle cellule reporter. (A) Effetti di Cry1 e Cry2 atterramento da siRNA sui ritmi cellulari delle cellule del reporter U2OS. Luminometro LumiCycle utilizzata per la registrazione bioluminescenza di cellule in piastre da 35 mm. Figura è adattato da Reference # 10, con il permesso di Elsevier (2009). (B) Effetti di Cry2 knockdown da shRNAs sui ritmi cellulari delle cellule 3T3 giornalista. Un pLL3.7 vettore contenente un Gateway U6-shRNA cassetta è stata utilizzata per Cry2 knockdown gene. shRNA2 ha un'efficienza migliore di knockdown shRNA1 come determinato mediante analisi Western blot (dati non mostrati). Un luminometro sinergia è stata utilizzata per la registrazione bioluminescenza di cellule in una piastra a 96 pozzetti. Le impostazioni di registrazione sono le seguenti: temperatura dell'incubatore., 33 ° C, tempo di integrazione, 15 sec; intervallo di tempo, 30 min (C) Effetti di piccole molecole inibitrici di celritmi lular di cellule giornalista U2OS. Chir99021 e Roscovitine sono inibitori diretti contro GSK-3 e CDK, rispettivamente. Il sistema ViewLux (Chir99021 assay) e un luminometro Tecan (Roscovitine saggio) sono stati utilizzati per le registrazioni bioluminescenza di cellule in piastre a 384 pozzetti. Figura di riferimento è tratto da # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, USA). Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

1. Modifiche al protocollo corrente

1,1 i dispositivi di registrazione e le considerazioni di throughput

A causa della sua disponibilità commerciale, il LumiCycle (Actimetrics) è diventato lo strumento più comunemente usato luminometro automatizzati per registrazione in tempo reale ^{4,5,9,19,29-31.} Il LumiCycle impiega tubi fotomoltiplicatori (PMT) come rivelatori di luce, che forniscono elevata sensibilità e basso rumore ^14, ed è quindi particolarmente adatto per l'acquisizione di dati estremamente dim luciferasi basata bioluminescenza. Altri simili PMT-dispositivi basati su (ad esempio, Kronos, Atto Co. e Polarstar Optima, BMG Labtech Inc.) sono stati utilizzati in molti studi ^32,33.

Il saggio LumiCycle utilizzando piatti da 35 mm può essere adattato a 96 -, 384 - o anche 1152-e formati lastra di high-throughput screening (HTS) esperimenti. HTS saggio di sviluppo si concentra principalmente sui seguenti due aspetti: 1Giornalista), le cellule migliori con brillante giornalista luciferasi e l'espressione / o superiore (vedi sotto), e 2) dispositivi di registrazione ad alta sensibilità in grado di ospitare più pozzetti. Noi e altri ricercatori hanno utilizzato lettori di piastre diversi, come Synergy SL2 (BioTek), Infinite M200 (Tecan) ^19, TopCount (PerkinElmer) ^28, e EnVision (Perkin Elmer) ^34. Nel nostro laboratorio, sia il LumiCycle e dispositivi Synergy sono collocati in una temperatura controllata e tenuta di luce incubatore. In alternativa, se le risorse lo permettono, le unità di registrazione può essere collocato in un ambiente a temperatura controllata. Per HTS, impostazioni critiche, quali l'integrazione / tempo di esposizione e l'intervallo di tempo tra i punti devono essere determinati empiricamente per un reporter dato e dispositivo di registrazione.

Il saggio LumiCycle non fornisce informazioni spaziali a risoluzione singola cellula. Yamaguchi et al. ³⁵ e Welsh et al. ^4,5 pioniere in tempo reale immagini bioluminescenza da integrating un microscopio appositamente progettato con un alta sensibilità, basso rumore fotocamera CCD da ¹⁵ a ottenere una risoluzione singola cellula. In anni recenti, sistemi di imaging più sensibili sono diventati disponibili in commercio, compresi LV200 (Olympus) e CellGraph (AB3000-B, Atto) con un raffreddato ultrasensibile e retroilluminato elettroni moltiplicando filtri CCD e multicolor ^36,37. Imaging è stato utilizzato anche in più sofisticati esperimenti HTS, ad esempio, un ViewLux CCD (Perkin-Elmer) in combinazione con il sistema di GNF robotizzato (Sistemi GNF). Tale sistema ha consentito grandi schermi per nuovi geni e piccole molecole che agiscono sulle funzioni orologio ^10,12,19.

1,2 reporter luciferasi

Luciferases stati utilizzati in registrazione in tempo reale luminescenza di espressione genica circadiano nei primi anni 1990 in piante e cianobatteri, e sono stati comunemente usati nel sistema di mammiferi ^29,35,38-40 dal 2000 (unLSO visualizzare le recensioni ^14,15). Reporter luciferasi sono generalmente meno tossici e più sensibile reporter fluorescenti come la GFP, a causa di sfondo molto inferiore ^41. Il reporter più comunemente usato è bioluminescent lucciola (Photinus pyralis) luciferasi (Luc +) costruita nel vettore pGL3 serie (Promega), in cui si è modificata la regione codificante del nativo Luc ottimizzato per la trascrizione e la traduzione. La combinazione di lucciola luciferasi e il suo substrato altamente stabile e cellula permeabile, D-luciferina, è ideale per registrazioni a lungo termine. d Luc è una versione modificata di Luc + con una sequenza PEST fusa al suo C-terminale per consentire una rapida degradazione proteica. Una versione ulteriormente migliorata, Luc2, è disponibile nella serie PGL4 vector (Promega) con l'espressione più alta e meno anomalo. Tuttavia, non è stata osservata una differenza significativa in termini di prestazioni tra Luc + e Luc2 in trasfettate 3T3 e U2OS (dati non mostrati). In un recente rapporto, fare clic su scarabeo brasiliano luciferasi (E Luc) è stato dimostrato che mostra un segnale molto più luminoso Luc +, adatto per l'imaging singola cella ^42.

Molti studi recenti hanno approfittato del mPER2 :: LUC fusione knock-in topo giornalista ^{4,5,9,19,25,29-31,43.} Questo sistema permette di giornalista fenotipizzazione circadiano di cellule e tessuti espianti compreso il SCN. Nei nostri studi precedenti, abbiamo attraversato questa linea di topi reporter con molti dei fori di clock comportamentale caratterizzato gene ed esaminate le dinamiche di ritmi bioluminescenza in SCN, fegato e polmone espianti coltivate ex vivo, e nei neuroni dissociati SCN e fibroblasti coltivati ​​in vitro ^{4, 5,9,31.} Questi studi ci hanno permesso di ottenere importanti intuizioni nei dettagli molecolari di funzionamento dell'orologio a livello delle cellule e degli organismi.

1,3 Gene dei loro metodi

e_content "> basata su vettori reporter di clock di fornire una grande versatilità, in quanto possono essere introdotti in vari tipi di cellule mediante trasfezione transiente ^11,13,16,17 o trasduzione lentivirale ^5,9,18. Anche se ingombranti e meno riproducibile, le cellule trasfettate transitoriamente può anche essere coltivate in presenza continua di antibiotici per generare linee cellulari stabili. vettori lentivirali sono ancora preferito a causa della loro integrazione stabile nel genoma cellulare, così come una maggiore efficienza e versatilità. Oltre al vettore pLV7 presentato sopra in cui le cellule infette possono essere selezionato con antibiotici, abbiamo utilizzato altri vettori. Ad esempio, il pLV156-P (Per2) d-Luc vettore contiene un P (Per2) d-Luc-IRES-EGFP cassetta di espressione in cui è mediata traduzione EGFP da una voce interna ribosoma site (IRES) a valle di Luc d, consentendo l'osservazione visiva e fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) di cellule con integratvettori ID ⁵ (Figura 1) (vedi sotto). Per proteggere il reporter da effetti di sito di integrazione, un promotore costitutivo e terminatore (P / T) può essere introdotto come un isolante o esca immediatamente a monte del (Per2) P-d cassetta di espressione reporter di Luc (per esempio, inferiore costruire in Figura 1A ), come riportato da Brown et al. ¹⁸ e Liu et al. ⁵

Studi precedenti stabilito le basi per l'esplorazione del tessuto-specifica perturbazione genetica sia in vivo e / o ex vivo ^44-48. Per esempio, particelle virali può essere iniettato nella regione SCN seguita dalla preparazione SCN slice. Come alternativa a questo in vivo seguita da test ex vivo, fette SCN possono essere sezionati prima e coltivate ex vivo, seguita da incubazione con alto titolo virale. Tuttavia, a causa della bassa efficienza di infezione fette di tessuto relativamente spessi,altamente coerente protocollo ex vivo ancora da sviluppare.

1,4 La scelta delle linee cellulari e condizioni di registrazione

Molto di ciò che sappiamo sulla biochimica e biologia cellulare del meccanismo dell'orologio si basa su tre modelli cellulari: fibroblasti di topo 3T3 ^16,17, cellule di osteosarcoma U2OS umani ^10,11,19,28, e fibroblasti di topo derivate da topi ^{9,13 , 34.} Il sistema permette vettore lentivirale consegna efficiente e stabile integrazione nel genoma dell'ospite sia divisione e non divisione delle cellule di mammifero, e quindi non è limitata a certi tipi di cellule, come in trasfezione transiente. Dato il ruolo di orologi circadiani nella regolazione di una vasta gamma di risposte cellulari e fisiologiche, studi futuri certamente estendere a una grande varietà di tipi di cellule, sia in linee cellulari disponibili in commercio o cellule primarie derivate da topi. Queste cellule autonome studi orologio aiuterà scoprire tessuto-ubiquitous, così come tessuto-specifici, proprietà di orologi circadiani.

Vale la pena notare che la generazione di cellule reporter può richiedere test empirico di diversi reporter (per esempio, vari tipi di vettore e promotore), e talvolta ulteriore ottimizzazione. Non tutti i tipi di cellule sono cellule autonome ritmi. Per migliorare la salute delle cellule e la persistenza dei ritmi cellulari, ottimizzazione del supporto di registrazione è spesso necessario. Ad esempio, in alternativa al supporto di registrazione 3T3, il supporto di registrazione utilizzato per le celle U2OS è il seguente: 1x DMEM (Invitrogen), 2% di B-27, 1 pM forskolina, 1 mM luciferina, 14,5 mM NaHCO3, HEPES 10 mM (pH 7,2). 1 mM luciferina è sufficiente, ma una concentrazione finale (0,1-1 mM) può essere determinata per ciascuna cella / reporter tipo. Forskolin può non essere necessario e la sua concentrazione può essere determinata empiricamente per ogni tipo cellulare.

1,5 efficienza di transfezione in prep lentivirale

Alta trefficienza ansfection di cellule 293T è fondamentale per una buona preparazione virale. Considerazioni principali includono salute delle cellule 293T e la scelta di un reagente di trasfezione. Cellule 293T può essere molto pignolo e richiedono una gestione attenta. Pertanto, il tasso di crescita cellulare e la morfologia deve essere attentamente monitorato. Per coerenza, si consiglia di siero da testare prima e lo stesso lotto testato utilizzato successivamente per mantenere le cellule. Abbiamo sempre la sperimentazione di nuovi BBS 2x e CaCl ₂ soluzioni di archivi fotografici e ottimizzare concentrazione di lavoro di CaCl ₂ circa 0,25 M. Celle di numero elevato passaggio e / o la visualizzazione di tasso di crescita lenta non deve essere usato. Cellule 293T sono prontamente transfectable con una serie di reagenti di trasfezione. Oltre a Capo _4, abbiamo anche raggiunto un'eccellente efficienza di trasfezione con Fugene 6 (Roche o Promega) o Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Questi a base di lipidi trasfezione (lipofezione) reagenti sono più costosi, ma dare consistenza trasfezione meglio di Capo _4. For prepara lentivirali su larga scala, si consiglia di utilizzare per la trasfezione CaPO4 a causa di un costo inferiore.

1,6 Generazione di linee cellulari clonali

Particelle grezze Un-concentrati virali sono di titolo relativamente bassa (10 ⁶ particelle virali / ml), e l'espressione reporter in cellule trasdotte è bassa. Anche se questo è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni, come la registrazione LumiCycle, brillanti giornalisti sono spesso necessari, ad esempio in high-throughput test utilizzando un dispositivo di registrazione meno sensibile. Reporter espressione può essere aumentata utilizzando Preps titoli più alti virali. Per fare questo, si consiglia di utilizzare recipienti di coltura più grandi tali AS15 piatti cm per la trasfezione, e la raccolta dei media due volte al giorno 4 e il giorno 5. Per concentrazione 10X (10 ⁷ particelle virali / ml), eseguire la filtrazione utilizzando centrifughe dispositivi filtranti (Millipore). Per concentrazione 100x o più (≥ 10 ⁸ particelle virali / ml), eseguire ultracentrifugazione come precedentemente descritto 5,18. Se una popolazione cellulare omogenea è desiderato, linee cellulari clonali può essere ottenuta tramite FACS-based singola cella ordinamento in piastre da 96 pozzetti. Tuttavia, è imperativo che queste cellule clonali attentamente esaminato; morfologia cellulare deve essere distinguibile dalle cellule parentali, e le proprietà di clock come lunghezza periodo e l'ampiezza deve essere rappresentativo della popolazione di cellule infette.

2. Applicazione di modelli Reporter Cell-autonome Clock

A differenza dei modelli di tessuto o animale, a base di cellule modelli sono suscettibili di perturbazioni genetici e farmacologici e, se necessario, utilizzare anche in formati HTS. Perturbazione della funzione del gene può essere ottenuto mediante sovra-espressione o RNAi-mediata knockdown. Selettivi piccole molecole può essere utilizzato per interferire con la funzione della proteina. Qui brevemente d aliscuss alcuni usi di cellule autonome modelli dell'orologio circadiano negli studi.

2,1 Studio dei meccanismi di clock di base

Cell-autonomi modelli di orologio hanno notevolmente facilitato studi meccanicistici. Hogenesch e colleghi hanno usato il modello 3T3 per mostrare che la repressione commento, cristalli è necessaria per la funzione orologio ^16, e il modello U2OS per sondare il livello di sistema proprietà della funzione orologio ^11. Abbiamo impiegato la Cry1-/ -: Cry2-/ - modello fibroblasti derivati ​​da topi per mostrare che la repressione feedback ritardato è necessario per la funzione orologio ^13, e il Bmal1-/ - fibroblasti modello per dimostrare che Rev-erbα e β svolgono ruoli ridondanti in regolazione RRE-mediata espressione ritmica del gene, e che Bmal1 ritmo non è critico necessario per il funzionamento di base ore ^9. Inoltre, lo screening chimico in cellule reporter di permesso di identificazione e / o chiarimento delle funzioni di GS(Periodo di accorciamento quando perturbato) K-3 β ¹⁹ CK1σ e ε (periodo di allungamento, quando perturbato) ^49, e CK1α ^12. Come discusso in seguito, questi modelli facilitare l'identificazione dei componenti aggiuntivi di clock. Strategicamente, questi modelli cellulari sono più trattabili per individuare rapidamente i meccanismi di base, che poi forniscono i punti di ingresso in nuovi validazione in vivo e di esplorazione.

2.2 Identificazione dei fattori di clock

In aggiunta al circuito di retroazione di base, il meccanismo dell'orologio integra anche segnalazione diversi e aspetti normativi. Per l'identificazione dei componenti aggiuntivi di clock e modificatori, cellula-autonomi modelli di clock risultano vantaggiosi rispetto a screening genetico nei topi a causa della letalità intrinseca, effetti pleiotropici, e sullo sviluppo di compensazione genetica associata a modelli animali mutanti ^50. Celle a base di schermi, in combinazione con stanziamenti di genomica funzionaledolori, sono state effettivamente eseguite con high-throughput sistemi di registrazione a schermo genoma siRNA e shRNA librerie per l'identificazione dei fattori di clock nuovi ^10,28. Allo stesso modo, si possono utilizzare metodi biologici e chimici schermo per diverse piccole molecole per studiare i loro effetti sulla funzione orologio ^12,19,34,49. Sebbene geni orologio principali e le loro funzioni sono stati identificati, questi schermi hanno identificato componenti aggiuntivi o modificatori che sono coinvolti nella regolazione e modulazione del clock. Molti di questi modificatori rappresentano particolare delle modalità di integrazione di trasduzione del segnale di spunti sincrone o asincrone (ingressi di clock).

2,3 Studio di uscite di clock

Anche se quasi tutte le cellule in vivo hanno orologi circadiani, le cellule coltivate in vitro non necessariamente mostrare evidenti ritmi circadiani. In questo contesto, l'approccio giornalista fornisce uno strumento utile per verificare se l'meccanismo dell'orologio è presente in un particolare tipo di cellula. Presenza di cellule autonome meccanismi orologio garantisce studi di uscite di clock in queste cellule, così come in tessuti in vivo, compreso il trascrittoma da microarray o sequenziamento RNA ^51,52, trascrizionali reti di regolazione, il proteoma, e la metaboloma. Questi studi esaminano genoma RNA e modelli di espressione proteica e quindi a completare saggi cellulari reporter di luminescenza che non riflettono necessariamente l'espressione endogena.

3. Significato di Cell-autonome Modelli Clock

Il coordinamento della funzione circadiana nel SCN e tra cellule diverse e tipi di tessuto è un aspetto critico della normale fisiologia ^30. Il SCN centrale e orologi periferici sono tutte le parti essenziali della organizzazione complessiva circadiano. Il SCN riceve input luce direttamente dalla retina di sincronizzarsi al ciclo luce / buio, e funge da coordinatore persincronizzare gli orologi periferici sia attraverso connessioni neuronali e ormonali. Oltre alla sincronizzazione interna, il meccanismo molecolare all'interno dei tessuti periferici e le cellule orchestra anche una miriade di reti ad trascrizionali, che in definitiva governano evidenti ritmi circadiani in fisiologia e del comportamento.

Così, entrambi i segnali sistemica e locale regolare fisiologia circadiano, e vi è la necessità di scoprire geni circadiani direttamente regolati da cellule autonome orologi vs quelli indirettamente regolata da segnali sistemici provenienti dal SCN. Il ruolo degli orologi periferici possono essere studiate in cellule autonome modelli di clock, in cui influenze sistemiche vengono rimossi. Nel caso del fegato, reti di regolazione tessuto-specifici generare ritmi locale fisiologia ^51,53. Confrontando in vitro e in vivo ritmi circadiani, saremo in grado di discriminare tra cellule autonome e sistemica cue-driven funzioni orologio. Infatti, Recent studi hanno cominciato a rivelare un ruolo significativo per l'orologio fegato di espressione genica epatica ^6,51,52. La ricerca futura nel campo dello sviluppo di vari mandati di tessuti e cellule di tipo-specifiche che rappresentano modelli di clock differenti uscite fisiologiche.

Precedenti studi di biochimica e biologia cellulare del meccanismo dell'orologio, sono in gran parte basata su un numero limitato di tipi di cellule e tessuti, tra cui in particolare 3T3, U2OS, fibroblasti di topo, e il fegato. Nell'ipotesi implicita in molti studi circadiani è che l'orologio funziona allo stesso modo in tutti i tipi di cellule e tessuti, e la funzione genica determinata in una cella o tipo di tessuto è generalmente considerata universalmente applicabile in tutte le cellule ^7. Tuttavia, la creazione e la caratterizzazione delle cellule più autonomi modelli di clock, gli studi futuri dovrebbero scoprire le proprietà specifiche di clock tessuto sottostante locale biologia circadiana.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics