Summary
Суточные часы функционировать в рамках отдельных клеток, т. е. они являются клетки-автономные. Здесь мы опишем методы для создания клеточного часов автономной модели с помощью неинвазивного, люциферазы основе в режиме реального времени биолюминесценции технологии. Репортер клетки обеспечивают послушный, функциональных систем моделью для изучения циркадных биологии.
Protocol
1. Строительство Lentiviral Luciferase Репортеры
Млекопитающих циркадного репортера конструкции обычно содержит кассету экспрессии, в которых суточный промоутер слит с геном люциферазы. Оба перевязки и рекомбинации стратегий, основанных на которые обычно используются для клонирования ДНК. В качестве примера, здесь мы описываем рекомбинации на основе шлюза метод клонирования для создания P (Per2)-г Люк лентивирусные репортера, в котором дестабилизировали люциферазы (г Luc) находится под контролем мыши Per2 промоутер.
- Клонирование Per2 промоутер. Использование ПЦР для амплификации фрагмента ДНК Per2 промоутер из 526 б.п., вверх по течению от сайта начала транскрипции от мыши Per2 BAC 9-13 клона, с использованием прямого праймера (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') и обратного праймера (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 »), а клон в pENTR5'-TOPO вектор (Invitrogen) для созданияpENTR5'-P (Per2).
- Клонирование г Люк. D Люк содержит ген люциферазы светлячка и С-концевыми PEST последовательности для быстрого разложения белка, как описано выше 21. Использование ПЦР для амплификации г Люк фрагмент ДНК, а клон в pENTR / D-TOPO вектор (Invitrogen) для создания pENTR / Dd Люк.
- Строительство репортер вектор. Смешайте два pENTR плазмиды, pENTR5'-P (Per2) и pENTR / Dd Люк, с лентивирусов вектор назначения pLV7-BSD (BSD, бластицидин ген устойчивости), а также выполнять реакции рекомбинации использованием Clonase для создания pLV7-BSD-P (Per2)-г Люк репортер (рис. 1). pLV7-BSD представляет собой модифицированную версию (сделано в нашей лаборатории) из pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), в которых вирус гепатита сурка пост-транскрипционного регуляторного элемента (WPRE) последовательностей 22 были вставлены непосредственно после выражения ок ssette для повышения экспрессии генов.
2. Производство Lentiviral Частицы
1. Семенной 293T клеток (день 1)
- Расти человеческих эмбриональных почек (НЕК) 293T клетки до 90-100% слияния в регулярном DMEM с добавлением 10% FBS и 1 пенициллина-стрептомицина-Глютамин (PSG) на 10 см блюд культуры. (Быстро растущие клетки с низким числом прохождения имеют решающее значение для эффективной трансфекции.)
- До посева клеток для трансфекции, герб 6-луночных культуры путем добавления 1 мл 0,001% поли-L-лизин в PBS в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин. Аспирируйте раствор и промыть один раз 1x PBS перед использованием.
- Диссоциируют 293T клеток трипсином и семян 0,75 х 10 6 клеток на каждую лунку предварительно покрытых пластинами с 2 мл регулярные DMEM. Swirl пластины тщательно для получения равномерного распределения клеток в каждой лунке. Рост клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение ночи.
- Соблюдайте посеянных клеток от 1 дня. Сотовые должны достичь слияния 80-90%.
- Подготовьте смесь для трансфекции плазмиды в 1,5 мл трубки микроцентрифужных добавлением 2 мкг лентивирусные репортера плазмиды ДНК (например, pLV7-P (Per2)-г Люк; Лю лаборатории) и 3 упаковки векторов (1,3 мкг Gag / Pol, 0,5 мкг Rev, и 0,7 мкг VSVG; Invitrogen). В качестве контроля для трансфекции и последующей инфекции, мы обычно включает дополнительный а в трансфекции для лентивирусов вектор экспрессии GFP, pLV156-CMV-EGFP (рис. 1А), укрывательство расширения зеленого флуоресцентного белка (EGFP) под контролем промотора CMV как описано выше 20.
- Добавить 100 мкл 0,25 М CaCl 2 (разбавляют ДНКазы / РНКазы DDH 2 O от 2,5 складе M) с плазмидой смеси в шаге 2 и тщательно перемешать. Затем добавьте 100 мкл раствора 2x BBS (50 МтS, 280 мм NaCl, 1,5 мМ Na 2 HPO 4, рН 6,95) и аккуратно перемешать, но тщательно. Инкубируйте ДНК смесь при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Во время ожидания, аспирации среды от 293T клетки и изменить до 2 мл свежей среды. Вернуться пластины в инкубатор, по крайней мере 10 минут, чтобы уравновесить рН среды до трансфекции.
- Добавить трансфекции смесь шаги от 3 до 293T клетки капля за каплей. Swirl пластины аккуратно и наблюдать формирование частиц под микроскопом. Инкубировать при 5% CO 2, 37 ° C в течение ночи. (Fine формирования частиц CaPO 4 / ДНК осадок имеет решающее значение для эффективной трансфекции.)
3. Урожай вирусных частиц (дни 3-4)
- Около 16 часов после трансфекции (день 3) к этому времени клетки должны достигать 100% слияния, аспирации среды из клетки и замените 2 мл свежего регулярные DMEM. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
- На 4-й день, оценить эффективность трансфекции, наблюдая EGFP выражение в переходsfection контрольных клеток (Трансфекция эффективностью 90-100% с высокой экспрессией EGFP является надежным предиктором хорошего вирусного преп.)
- Сбор среде, содержащей выделяется, инфекционные вирусные частицы. Центрифуга в> 2000 мкг в течение 5 мин для удаления остаточных клеток 293Т и собирать содержащих вирус супернатант. Кроме того, среда может быть очищен с 0,45 мкм мембранный фильтр. Вирусные частицы готовы для использования в инфекции.
3. Инфекция 3Т3
1. Семенной 3Т3 (день 3)
Сплит и семян соответствующее количество (~ 12.000) из 3T3 клеток на 12-луночный планшет для получения 20-30% слияния на следующий день. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
2. Infect 3Т3 (день 4)
- Соблюдайте посеянных клеток. Слияние 20-30% (менее 50%) требуется для инфекции.
- Добавить полибрен до конечной концентрации 5 мкг / мл, собранные среде, содержащей вирусныйчастицами. Тщательно перемешать с помощью пипетки.
- Аспирируйте среды от 3Т3, и добавьте 1 мл указанного выше вирусная смеси на лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи. (Полибрен используется для повышения эффективности инфекции, но не абсолютно необходимо. Как это может быть токсично для некоторых клетках, предварительное тестирование рекомендуется).
3. Выберите инфицированных клеток (5-й день и далее)
- Двадцать четыре часа после инфицирования, аспирации среде, содержащей вирус и полибрен из инфицированных клеток, мыть один раз 1x PBS, и изменить на свежую среду. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи для восстановления и роста.
- Когда вырожденная (обычно через 1-2 дня), разделение клеток и инкубируют при 37 ° C в течение ночи.
- На следующий день, аспират среды от клеток (<50% слияния желательно) и заменить свежей средой, содержащей 10 мкг / мл бластицидин, чтобы выбрать для стабильно преобразованных клеток. (Бластицидин убить кривая должна быть определены эмпирически для конкретной линии клеток).
4. Биолюминесценция запись Reporter клетки
1. Клеток семени Репортер
Распространить бластицидин-устойчивых клеток репортер и разделен на 35-мм блюд культуры. Инкубировать при температуре 37 ° C до вырожденная. Мы обычно готовят ≥ 3 блюд для каждой клеточной линии репортер под каждым условием для суточного фенотипирования.
2. Синхронизация и изменение носителя
- Аспирируйте среды от сливной клетки репортер, мыть один раз PBS, и заменить DMEM, содержащей 10 мкМ форсколина (или 200 нМ дексаметазона). Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа, чтобы синхронизировать клетки. (Кроме того, клетки могут быть синхронизированы с помощью температурных циклов 23 или сыворотки шок 24).
- Во время ожидания, подготовить отчетния среды для 3Т3 следующим образом: 1x DMEM (HyClone), содержащей 10% FBS, 1 Pen / Strep / Gln, 1 мкМ форсколина, 1 мМ люциферин, 25 мМ HEPES, рН 7,4. Сыворотка и форсколина концентрация может быть определена опытным путем. Для очень тусклые клетки, фенола красного бесплатно среда может быть использована.
- В конце лечения форсколин, аспирации среднего и заменить недавно сделал запись среды.
3. Биолюминесценция записи репортера клеток
- После среде изменений, охватывают культуру блюд с 40 мм стерильной покровные и уплотнение в месте с вакуумной смазкой для предотвращения испарения.
- Загрузите блюда на LumiCycle люминометра, которая хранится в инкубатор при 36 ° C, без H 2 O или CO 2.
- Начало реального времени биолюминесценции записи. Мы обычно записывают ритмы в течение 1 недели, затем средние изменения и непрерывной записи в течение второй недели (см. Савельев и соавт. Подробности) 25. (Для записи 96-мыLL пластин, Synergy SL2 был использован в качестве записывающего устройства, см. обсуждение 1.1 для подробностей).
5. Анализа и представления данных
Репортер клеток способствовать высоким разрешением количественных записи люминесценции, решающее значение для определения фенотипические эффекты на циркадный функцию часов. Для получения циркадные параметры, включая фазу, длина периода, ритм амплитуды и скорости затухания, мы используем программу LumiCycle анализа (Actimetrics) для анализа биолюминесценции данных 5,14. Короче говоря, исходные данные являются базовыми Встроенная первыми, и базовой линии вычитаются данные устанавливаются на синусоиду, из которой параметры определяются. Для образцов, которые показывают постоянный ритм, добра, согласия,> 90%, как правило, достигается. В связи с высоким переходным биолюминесценции от среднего изменения, мы обычно исключают первом цикле данные из анализа.
Для представления данных, мы обычно построить исходные данные (биолюминесценции, имп / сек) от TIМне (дней). При необходимости, базовый-вычитаются данные могут быть нанесены для сравнения амплитуды и фазы.
6. Представитель Результаты
1. Фаза конкретных циркадных журналистами
Циркадные часы основана на биохимических механизм отрицательной обратной связи 1. Цикл основной обратной связи состоит из транскрипционных активаторов BMAL1 и часы, и репрессоры PERs и кристаллы, которые действуют на циркадный E / Е 'ящик элементов усилителя для создания ритмической экспрессии генов (с утра фазы, например, Rev-Еврорадио α). Основной цикл регулирует и интегрирует крайней мере два других циркадных цис-элементов, DBP/E4BP4 обязательным элементом (D-коробка; за день фазы, например, PER3) и ROR / REV-ERB обязательным элементом (RRE; для ночной фазы, например, BMAL1) 17. Комбинаторные регулирования циркадных нескольких элементов может генерировать новые промежуточные фазы. Например, Cry1 транскрипцииния при посредничестве все три циркадных элементы (например, E / Е 'ящик и D-элементов в окне промоутер и Rres в первый интрон гена Cry1), что приводит к различным Cry1 вечернее время фазы 13.
Основываясь на этих механизмах регуляции генов, мы получили четыре различных конструкций репортер: P (Per2)-г Люк и P (Cry1)-г Люк журналистам, содержащих как E / Е 'ящик и D-коробка элементов в регуляторной области 17, 26,27; P (Cry1) - Интрон-й Люк представляющих комбинаторной регулирование всех трех элементов (например, E / Е 'ящик, D-Box, и РРЭ) 13,17, а P (BMAL1)-г Люк регулируемом исключительно RRE 9,17,19,21. Мы представили эти журналистам в 3Т3 для получения ожидаемого различных фазах репортер выражении (рис. 2).
2. Гена нокдаун через RNAi и фармакологически ACTiве соединений
При трансфекции эффективность высока, синтетических миРНК может быть временно трансфицировали в клетки, чтобы сбить экспрессии генов. При трансфекции технически сложно, вектор ShRNA выражение может быть стабильно трансдуцированных в клетки через лентивирусные инфекции, так что ShRNA производства ячейки обрабатывается для миРНК для генной нокдаун (KD). Здесь мы представляем KD последствия Cry1 и Cry2 генов с помощью миРНК в клетки U2OS (рис. 3А) и ShRNA в 3T3 клеток с использованием pLL3.7 шлюз вектор экспрессии 9 (рис. 3В). В дополнение к 3Т3, модель U2OS стало еще одним выдающимся сотовый модель часов основном потому, что отвечает основным требованиям для высокопроизводительного скрининга коммерчески доступных человеческих библиотеки миРНК (например, человеческого происхождения, способные генерировать надежные циркадные ритмы, подтверждено функции все известные часовые гены, и поддаются высокоэффективной трансфекции иколичественные записи люминесценции). В обоих типах клеток, RNAi-опосредованной KD привело часы фенотипы согласуются с предыдущими нокаут мышей (KO) и клеточных исследований KD 5,10,11,28. Например, Cry1 KD сокращает длину периода и снижает ритм настойчивость, в то время как Cry2 KD удлиняет период. Кроме того, отдельные небольшие молекулы могут быть использованы для фармакологической мишени и возмущают функции белка (рис. 3).
Рисунок 1. Лентивирус-опосредованной доставки генов системы. (A) схема из двух лентивирусные P (Per2)-г векторов Люк репортер и CMV-EGFP построить. Только региона к интеграции в геном клетки-хозяина показано. В обоих репортер конструкций, транскрипция г Люк находится под прямым контролем Per2 промоутер. В pLV7-BSD-P (Per2)-г Люк вектор (повторноКомбинация на основе клонирования), экспрессируются сопротивление бластицидин гена (BSD) облегчает выбор инфицированных клеток. В pLV156-P (Per2)-г Люк вектор (перевязка на основе клонирования), EGFP перевод опосредовано внутренних рибосомы сайте вступления (IRES) вниз по течению от D Люк, позволяющий для визуального наблюдения и FACS сортировки инфицированных клеток. Кроме того, SV40 промотор / терминатор (P / T) используется в качестве диэлектрика (см. обсуждение 1,3). В CMV-EGFP векторного управления, EGFP выражение находится под контролем сильного промотора CMV. (B) флуоресцентных изображений трансфицированных и инфицированных GFP-экспрессирующих клеток. Как правило, мы достигаем высокой эффективности как в переходном трансфекции клетки и 293T в лентивирусные заражение клеточных линиях наших интересах, как указано GFP выражение в этих клетках. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Фаза-конкретное выражение биолюминесценции журналистам в 3Т3 лентивирусов векторов репортера, используемые в этом эксперименте pLV7-BSD-P (Per2)-г Люк, P (Cry1)-г Люк, P (Cry1) -. Интрон-й Luc, и P (BMAL1)-г Люк. Каждый репортер отчетливо демонстрирует фаза колебаний, как показано стрелками. В то время как Per2 и Cry1 промоутеров диск пик биолюминесценции на утро-день фаз и BMAL1 промоутер ночью фазы, комбинаторные регулирования P (Cry1) - Интрон укрывательство E-окна, D-Box, и RRE элементов придает вечеру фазы пика биолюминесценции . Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Генетические и фармакологических возмущение циркадных ритмов биолюминесценции в репортеру клеток. (A) Воздействие Cry1 и Cry2 нокдаун от siRNAs на клеточном ритмы клеток U2OS репортер. LumiCycle люминометра был использован для записи биолюминесценции клеток в 35 блюд мм. Рисунок выполнен Ссылка с № 10, с разрешения Elsevier (2009). (B) Влияние Cry2 нокдаун от shRNAs на клеточном ритмы 3Т3 репортер. PLL3.7 шлюз вектор, содержащий U6-ShRNA кассета была использована для Cry2 гена нокдаун. shRNA2 имеет лучшую эффективность, чем нокдаун shRNA1, как это определено Вестерн-блоттинга (данные не показаны). Synergy люминометра был использован для записи биолюминесценции клеток в 96-луночный планшет. Установки для записи следующим образом:. Инкубатора температура 33 ° C, время интегрирования, 15 сек; интервал времени, 30 минут (C) Влияние низкомолекулярных ингибиторов на челlular ритмы клеток U2OS репортер. Chir99021 и росковитина являются ингибиторами направлены против GSK-3 и CDK, соответственно. Система ViewLux (Chir99021 анализ) и люминометра Tecan (росковитина анализа) были использованы для записи биолюминесценции клеток в 384-луночных планшетах. Рисунок заимствован из Справочник № 19 (Copyright 2008 Национальная академия наук, США). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Изменения в данной протокола
1,1 записывающих устройств и пропускную способность соображения
Из-за своей коммерческой доступности, LumiCycle (Actimetrics) стал наиболее часто используемых автоматизированных устройств люминометра для записи в реальном времени 4,5,9,19,29-31. LumiCycle работает фотоэлектронных умножителей (ФЭУ) в качестве приемников света, которые обеспечивают чрезвычайно высокую чувствительность и низкий уровень шумов 14, и поэтому особенно подходит для сбора данных очень тусклый люциферазы на основе биолюминесценции. Другие подобные ПМТ-устройств (например, Kronos, Atto Ко, а Полярная звезда Optima, BMG Labtech Inc) также были использованы во многих работах 32,33.
LumiCycle методом с использованием 35-мм блюда могут быть адаптированы для 96 -, 384 - или даже тысяча сто пятьдесят две-луночный планшет форматы для высокопроизводительного скрининга (HTS) экспериментов. HTS анализ развития в основном сосредоточена на следующих двух аспектах: 1) Лучше репортер клетки с яркими люциферазы и / или выше репортер выражении (см. ниже), и 2) очень чувствительны записывающих устройств, которые размещают мульти-луночных планшетах. Мы и другие использовали несколько читателей микропланшет, такие как Synergy SL2 (BioTek), Бесконечные M200 (Tecan) 19, TopCount (PerkinElmer) 28, и представьте (Perkin Elmer) 34. В нашей лаборатории, как LumiCycle и Synergy устройства помещаются в контролируемой температурой и светонепроницаемой инкубатора. Кроме того, если позволяют средства, запись единицы могут быть размещены в контролируемой температурой комнаты. Для HTS, критические параметры, такие как интеграция / время экспозиции и интервал между моментами времени должен быть определен эмпирически для данного корреспондента и записывающее устройство.
LumiCycle анализа не обеспечивает пространственной информации в одной резолюции клетки. Yamaguchi и соавт. 35 и валлийский и соавт. 4,5 пионером в режиме реального времени биолюминесценции изображений на Integrating специально разработанный микроскоп с высокой чувствительностью, низким шумом CCD камеры 15 для получения одной резолюции клетки. В последние годы более чувствительными системами визуализации стали коммерчески доступны, в том числе LV200 (Olympus) и CellGraph (AB3000-B, Atto) с сверхчувствительные охлаждением и задней подсветкой электронного умножения CCD и многоцветной фильтры 36,37. Изображениями также используется в более сложных экспериментов HTS, например, ViewLux ПЗС-матрица (Perkin-Elmer) в сочетании с GNF роботизированные системы (GNF Systems). Эта система позволяла крупномасштабные экраны для новых генов и малые молекулы, которые влияют на функцию часов 10,12,19.
1,2 Luciferase журналистами
Люцифераз были впервые использованы в реальном времени регистрации люминесценции суточного экспрессии генов в начале 1990-х годов у растений и цианобактерий, и были широко используется в системе млекопитающих, начиная с 2000 года 29,35,38-40 (РБП см. обзоры 14,15). Luciferase журналисты, как правило, менее токсичные и более чувствительна, чем флуоресцентные журналистам, таких как GFP, из-за значительно ниже фона 41. Наиболее часто используемые биолюминесцентного репортер светлячков (Photinus pyralis) люциферазы (Luc +) построен в векторе pGL3 серии (Promega), в котором кодирующей области родном Люк был изменен для оптимизации транскрипции и трансляции. Сочетание люциферазы светляков и ее высокую стабильность и клеточной проницаемой подложкой, D-люциферин, идеально подходит для длительной записи. D Люк представляет собой модифицированную версию Luc + с PEST последовательности сливаются на своем С-конце, чтобы обеспечить быстрое разложение белка. Дальнейшее улучшение версии, Luc2, доступна в PGL4 вектор серии (Promega) с более высокой и менее аномальное выражение. Тем не менее, мы не наблюдаем существенной разницы в производительности между Люком + и Luc2 в временно трансфицировали 3T3 и U2OS клеток (данные не представлены). В недавнем докладе, бразильского жука нажмите люциферазы (E Luc) было показано, обладают гораздо ярче, чем сигнал Люк +, подходит для одной ячейки изображения 42.
Многие последние исследования воспользовались mPER2 :: LUC слияния стучаться в репортеру мыши 4,5,9,19,25,29-31,43. Этот репортер система позволяет циркадных фенотип клеток и тканей эксплантов в том числе SCN. В наших предыдущих исследованиях, мы пересекли эту линию мышей с корреспондентом многих поведенческих характеризуется нокаутом гена часы и изучили динамику биолюминесценции ритмы в SCN, печени и легких эксплантов культурного естественных бывшие, так и в диссоциированных нейронов SCN и фибробласты культивировали в пробирке 4, 5,9,31. Эти исследования позволили нам получить важную информацию о молекулярных деталях часов операции на клеточном и организменном уровнях.
1,3 методами генной доставки
e_content "> векторной журналистам часов обеспечивают большую универсальность, так как они могут быть введены в различные типы клеток с помощью временной трансфекции 11,13,16,17 или лентивирусов трансдукции 5,9,18. Несмотря на то, громоздкой и менее воспроизводимы, временно трансфицировали клетки могут Также можно выращивать в постоянном присутствии антибиотиков для получения стабильных клеточных линий. Lentiviral векторов по-прежнему предпочтительны, поскольку их стабильной интеграции в геном клетки, а также повышение эффективности и универсальности. Кроме того, pLV7 вектор, представленные выше, в которых инфицированных клеток может быть выбран с помощью антибиотиков, мы использовали другие векторы. Например, pLV156-P (Per2)-г Люк вектор содержит P (Per2)-г Luc-IRES-EGFP кассету экспрессии, в которой EGFP перевод опосредовано внутренних рибосомы запись сайт (IRES) вниз по течению от D Люк, позволяющий для визуального наблюдения и флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) клеток с интегрированнойред векторов 5 (рис. 1) (см. ниже). Чтобы оградить журналиста от сайта интеграции эффектов, конститутивного промотора и терминатора (P / T) может быть введен в качестве изолятора или приманку непосредственно перед P (Per2)-г Люк репортер кассеты экспрессии (например, нижняя построить в рис. 1А ), как сообщил Браун и др. 18. Лю и др. 5.Предыдущие исследования установили основу для исследования тканей специфических генетических возмущения как в естественных условиях и / или бывших естественных условиях 44-48. Например, вирусные частицы могут быть введены в SCN региона следует SCN подготовки срез. В качестве альтернативы этому в естественных условиях последующим анализом естественных условиях EX, SCN ломтики можно разрезать первый и культурных естественных условиях EX, с последующей инкубацией с высоким титром вируса. Однако из-за низкой эффективности заражения относительно толстые ломтики тканей,очень последовательно исключая виво протокола еще предстоит разработать.
1,4 Выбор клеточных линий и условий записи
Многое из того, что мы знаем о биохимии и клеточной биологии часовой механизм базируется на трех клеточных моделей: 3T3 фибробласты мышей 16,17, U2OS человеческих клеток остеосаркомы 10,11,19,28, и мышиных фибробластов, полученных от мышей 9,13 , 34. Лентивирусные векторная система обеспечивает эффективную доставку и стабильной интеграции в геном хозяина, так деления и без деления клеток млекопитающих, и, следовательно, не ограничивается определенными типами клеток, как и в переходных трансфекции. Учитывая роль циркадные часы в регуляции широкого спектра клеточных и физиологических реакций, будущие исследования, безусловно, распространяется на широкий спектр типов клеток, либо коммерчески доступными клеточных линий или первичных клеток, полученных от мышей. Эти клетки-автономные исследования часы помогут раскрыть ткани ubiquitous, а также тканеспецифические, свойства циркадных часов.
Стоит отметить, что получение репортер клетки может потребовать эмпирического тестирования различных журналистам (например, различные типы векторных и промоутер), а иногда и дальнейшей оптимизации. Не все типы клеток имеют ячейки-автономных ритмов. Для улучшения здоровья клеток и сохранение сотовой ритмы, оптимизация носителе часто необходима. Например, в качестве альтернативы 3T3 носитель записи, запись среда, используемая для клеток U2OS выглядит следующим образом: 1x DMEM (Invitrogen), 2% B-27, 1 мкМ форсколина, 1 мМ люциферин, 14,5 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES (рН 7,2). 1 мМ люциферин, как правило, достаточно, но окончательной концентрации (0,1-1 мм) могут быть определены для каждой ячейки / Репортер типа. Форсколин не может быть необходимым и его концентрации могут быть определены эмпирически для каждого типа клеток.
1,5 эффективности трансфекции в лентивирусные подготовки
Высокая TRansfection эффективности 293T клеток является необходимым условием для хорошего вирусного преп. Основные соображения включают здоровье 293T клетки и выбор трансфекции реагента. 293T клеток может быть очень привередливы и требуют осторожного обращения. Таким образом, клетки темпы роста и морфологии должны быть тщательно проверены. Для надежности, мы рекомендуем сыворотки быть проверены первыми и той же проверенной партии, используемой затем для поддержания клеток. Мы всегда тестировать новые BBS 2x и CaCl 2 растворы и оптимизировать рабочие концентрации CaCl 2 около 0,25 Клетки M. высоким числом прохода и / или отображения медленные темпы роста не должны быть использованы. 293T клетки легко transfectable с рядом реагентов трансфекции. В дополнение к CaPO 4, мы также добились отличных эффективность трансфекции Fugene 6 (Roche или Promega) или Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Эти основе липидов трансфекции (липофекция) реагенты стоят дороже, но дают более трансфекции консистенции, чем CaPO 4. FoГ крупномасштабных лентивирусные Preps, мы рекомендуем использовать CaPO4 для трансфекции из-за более низкой стоимости.
1,6 поколения клональных клеточных линий
Un-концентрированного сырья вирусные частицы имеют относительно низкий титр (10 6 вирусных частиц / мл), и журналист выражение в преобразованных клетках низка. Хотя это достаточно для большинства приложений, таких как LumiCycle записи, яркие журналисты часто необходимы, например, в высокой пропускной анализов с использованием менее чувствительных записывающее устройство. Репортер выражение может быть увеличена за счет использования более титр вирусных Preps. Чтобы сделать это, мы рекомендуем использовать более крупные суда культуры, такие AS15 блюда см для трансфекции, а также сбор средств массовой информации два раза в день 4 и 5-й день. Для 10x концентрации (10 7 вирусных частиц / мл), выполнить фильтрации с использованием центробежного фильтра устройств (Millipore). Для 100x или больше концентрации (≥ 10 8 вирусных частиц / мл), выполнить ультрацентрифугирования, как описано ранее
2. Применение Cell-автономных моделей Reporter Часы
В отличие от ткани или модели на животных, клеточных моделях поддаются генетических и фармакологических возмущения, и, при необходимости, а также использовать в форматах HTS. Возмущение функции гена может быть достигнуто путем чрезмерной экспрессии РНК-интерференции или опосредованной нокдаун. Селективный малых молекул могут быть использованы вмешиваться в функции белка. Здесь мы кратко Discuss некоторые виды клеточных автономных моделей часов в суточный исследований.
2,1 Исследование механизмов тактовой
Cell-автономных моделей часов значительно способствовало механистические исследования. Hogenesch и его коллеги использовали 3T3 модель, чтобы показать, что обратная связь репрессий кристаллов необходимы для функции часов 16, а U2OS модель для исследования уровня системы свойств функции часов 11. Мы использовали Cry1-/ -: Cry2-/ - фибробласты, полученные из модели мышей, чтобы показать, что задержка репрессий обратная связь необходима для функции часов 13, а BMAL1-/ - фибробластов модель, чтобы показать, что Rev-erbα и β играет роль в избыточных регулирующей RRE-опосредованной ритмической экспрессии генов, и что BMAL1 ритм не является критически необходимой для основной функции часов 9. Кроме того, химический скрининг в клетках репортер позволил выявить и / или уточнение функций GSK-3 β (период сокращения, когда возмущенная) 19, CK1σ и ε (удлинение периода, когда возмущенная) 49, и CK1α 12. Как будет показано ниже, эти модели также способствовать выявлению дополнительных компонентов часов. Стратегически эти клеточные модели более сговорчивым для быстрого открытия основных механизмов, которые затем предоставляют новые точки входа в естественных проверки и исследования.
2,2 Определение факторов часов
В дополнение к обратной связи ядра, часовой механизм также объединяет разнообразные сигнальные и регуляторные факторы. Для идентификации дополнительных компонентов, часы и модификаторы, клеточно-автономные модели часов имеют преимущество над генетического скрининга у мышей из-за присущего летальности, плейотропным эффектов и развития генетической компенсации, связанные с мутантным животных моделях 50. Клеточная экранов в сочетании с функциональной геномики соответствуюболи, были эффективно осуществляется с использованием высокопроизводительных систем записи на экране генома миРНК и ShRNA библиотек для идентификации новых факторов часов 10,28. Кроме того, можно использовать химические и биологические подходы и экрана для различных малых молекул для изучения их влияния на функции часов 12,19,34,49. Хотя основные гены часы и их функции были определены, эти экраны были определены дополнительные компоненты или модификаторы, которые участвуют в регуляции или модуляции часов. Многие из этих модификаторов представлять конкретные механизмы интеграции передачи сигнала синхронные или асинхронные сигналы (часы входов).
2,3 изучение часы выходы
Хотя практически все клетки в естественных условиях имеют циркадных часов, клетки культивировали в пробирке не обязательно показывать открыто циркадные ритмы. В этом контексте, репортер подход обеспечивает полезный инструмент для проверкиЧасовой механизм существует в конкретном типе клеток. Наличие клеточных механизмов часов автономной гарантирует исследования часы выходов в этих клетках, а также в тканях в естественных условиях, в том числе транскриптом по микрочипов или РНК последовательности 51,52, транскрипционных регуляторных сетей, протеома, и метаболом. Эти исследования изучения генома РНК и моделей экспрессии белка и, таким образом будет дополнять клеточной люминесценции репортер анализов, которые не обязательно отражают эндогенный выражение.
3. Значение Cell-автономных моделей часов
Координация циркадных функции в SCN и в различных клеток и тканей типа является важнейшим аспектом нормальной физиологии 30. Центральный SCN и периферической часы все важнейшие части общего суточного организации. SCN получает свет ввод непосредственно от сетчатки к увлекают в цикле свет / темнота, и выступает в качестве координаторасинхронизации часов через периферические как нейронные и гормональные соединения. В дополнение к внутренней синхронизации, молекулярный часовой механизм в периферических тканях и клетках также организует множество транскрипционных сетей вывод, что в конечном итоге управлять открытой циркадные ритмы в физиологии и поведения.
Таким образом, обе системные и местные сигналы регулировать циркадные физиологии, и нет необходимости, чтобы раскрыть циркадных генов напрямую регулируется клеточной автономных часов по сравнению с теми косвенно регулируется системных сигналов, исходящих из SCN. Роль периферических часы могут быть изучены в клеточных автономных моделей часов, в которых системным воздействиям удаляются. В случае печень, тканеспецифические регуляторных сетей генерировать ритмы в физиологии местных 51,53. Сравнивая в пробирке и в естественных суточных ритмов, мы сможем различать клетки-автономные и системные кия управляемых функций часов. Действительно, recenт исследования начали раскрывать существенную роль для печени часы в печеночной экспрессии генов 6,51,52. Будущие исследования в области развития ордера на различные ткани и клетки определенного типа часы моделей, представляющих различные физиологические выходов.
Предыдущие исследования биохимии и клеточной биологии часового механизма в значительной степени полагаются на ограниченное число клеточных и тканевых типов, включая, в частности 3T3, U2OS, фибробластов мыши и печени. Неявное предположение в большинстве суточного исследования является то, что часы работают одинаково во всех клеточных и тканевых типов и функции генов определяется в одной клетке или ткани типа обычно считается универсально применяться во всех клетках 7. Тем не менее, путем создания и характеризующие более сотовых автономных моделей часов, будущие исследования должны выявить специфические свойства ткани часы, лежащие в основе местного циркадных биологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального научного фонда (IOS-0920417) (ACL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | HyClone | SH30243FS | For regular cell growth |
| DMEM | Invitrogen | 12100-046 | For luminometry |
| FBS | HyClone | SH3091003 | |
| Pen/Strep/Gln(100x) | HyClone | SV3008201 | |
| B-27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| D-Luciferin | Biosynth | L-8220 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| All other chemicals | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Tissue culture incubator | 5% CO2 at 37 °C | ||
| Tissue culture hood | BSL-2 certified | ||
| Light & fluorescent microscope | Phase contrast optional | ||
| LumiCycle | Actimetrics | ||
References
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Hastings, M. H., Reddy, A. B., Maywood, E. S. A clockwork web: circadian timing in brain and periphery, in health and disease. Nat. Rev. Neurosci. 4, 649-661 (2003).
- Nagoshi, E. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119, 693-705 (2004).
- Welsh, D. K. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr. Biol. 14, 2289-2295 (2004).
- Liu, A. C. Intercellular coupling confers robustness against mutations in the SCN circadian clock network. Cell. 129, 605-616 (2007).
- Kornmann, B. System-driven and oscillator-dependent circadian transcription in mice with a conditionally active liver clock. PLoS Biol. 5, e34 (2007).
- Hogenesch, J. B., Herzog, E. D. Intracellular and intercellular processes determine robustness of the circadian clock. FEBS Lett. 585, 1427-1434 (2011).
- DeBruyne, J. P., Weaver, D. R., Reppert, S. M. Peripheral circadian oscillators require CLOCK. Curr. Biol. 17, 538-539 (2007).
- Liu, A. C. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4, e1000023 (2008).
- Zhang, E. E. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139, 199-210 (2009).
- Baggs, J. E. Network features of the mammalian circadian clock. PLoS Biol. 7, e52 (2009).
- Hirota, T. High-throughput chemical screen identifies a novel potent modulator of cellular circadian rhythms and reveals CKIalpha as a clock regulatory kinase. PLoS Biol. 8, e1000559 (2010).
- Ukai-Tadenuma, M. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- Yamazaki, S., Takahashi, J. S. Real-time luminescence reporting of circadian gene expression in mammals. Methods Enzymol. 393, 288-301 (2005).
- Welsh, D. K., Imaizumi, T., Kay, S. A. Real-time reporting of circadian-regulated gene expression by luciferase imaging in plants and mammalian cells. Methods Enzymol. 393, 269-288 (2005).
- Sato, T. K. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nat. Genet. 38, 312-319 (2006).
- Ueda, H. R. System-level identification of transcriptional circuits underlying mammalian circadian clocks. Nat. Genet. 37, 187-192 (2005).
- Brown, S. A. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLoS Biol. 3, e338 (2005).
- Hirota, T. A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20746-20751 (2008).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat. Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Ueda, H. R. A transcription factor response element for gene expression during circadian night. Nature. 418, 534-539 (2002).
- Zufferey, R., Donello, J. E., Trono, D., Hope, T. J. Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances expression of transgenes delivered by retroviral vectors. J. Virol. 73, 2886-2892 (1999).
- Buhr, E. D., Yoo, S. H., Takahashi, J. S. Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators. Science. 330, 379-385 (2010).
- Balsalobre, A., Damiola, F., Schibler, U.A serum shock induces circadian gene expression in mammalian tissue culture cells. Cell. 93, 929-937 (1998).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A., Lundkvist, G. B. S. Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus. J. Vis. Exp. (48), e2439 (2011).
- Akashi, M., Ichise, T., Mamine, T., Takumi, T. Molecular mechanism of cell-autonomous circadian gene expression of Period2, a crucial regulator of the mammalian circadian clock. Mol. Biol. Cell. 17, 555-565 (2006).
- Ohno, T., Onishi, Y., Ishida, N. A novel E4BP4 element drives circadian expression of mPeriod2. Nucleic Acids Res. 35, 648-655 (2007).
- Maier, B. A large-scale functional RNAi screen reveals a role for CK2 in the mammalian circadian clock. Genes Dev. 23, 708-718 (2009).
- Yoo, S. H. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 5339-5346 (2004).
- Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets. Nat. Chem. Biol. 3, 630-639 (2007).
- Ko, C. H. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8, e1000513 (2010).
- Izumo, M., Johnson, C. H., Yamazaki, S. Circadian gene expression in mammalian fibroblasts revealed by real-time luminescence reporting: temperature compensation and damping. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 16089-16094 (2003).
- Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput. Biol. 2, e136 (2006).
- Chen, Z. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 101-106 (2011).
- Yamaguchi, S. Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Akashi, M., Hayasaka, N., Yamazaki, S., Node, K. Mitogen-activated protein kinase is a functional component of the autonomous circadian system in the suprachiasmatic nucleus. J. Neurosci. 28, 4619-4623 (2008).
- Hoshino, H., Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Luciferase-YFP fusion tag with enhanced emission for single-cell luminescence imaging. Nat. Methods. 4, 637-639 (2007).
- Asai, M. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr. Biol. 11, 1524-1527 (2001).
- Wilsbacher, L. D. Photic and circadian expression of luciferase in mPeriod1-luc transgenic mice in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 489-494 (2002).
- Yamazaki, S. Resetting central and peripheral circadian oscillators in transgenic rats. Science. 288, 682-685 (2000).
- Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Imaging: A Laboratory Manual. Yuste, R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 369-385 (2011).
- Nakajima, Y. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, e10011 (2010).
- Guilding, C. A riot of rhythms: neuronal and glial circadian oscillators in the mediobasal hypothalamus. Mol. Brain. 2, 28 (2009).
- O'Neill, J. S. cAMP-dependent signaling as a core component of the mammalian circadian pacemaker. Science. 320, 949-953 (2008).
- Fuller, P. M., Lu, J., Saper, C. B. Differential rescue of light- and food-entrainable circadian rhythms. Science. 320, 1074-1077 (2008).
- Mukherjee, S. Knockdown of Clock in the ventral tegmental area through RNA interference results in a mixed state of mania and depression-like behavior. Biol. Psychiatry. 68, 503-511 (2010).
- Saijo, K. A Nurr1/CoREST pathway in microglia and astrocytes protects dopaminergic neurons from inflammation-induced death. Cell. 137, 47-59 (2009).
- Elias, G. M. Synapse-specific and developmentally regulated targeting of AMPA receptors by a family of MAGUK scaffolding proteins. Neuron. 52, 307-320 (2006).
- Isojima, Y. CKIepsilon/delta-dependent phosphorylation is a temperature-insensitive, period-determining process in the mammalian circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15744-15749 (2009).
- Bucan, M., Abel, T. The mouse: genetics meets behaviour. Nat. Rev. Genet. 3, 114-123 (2002).
- Hughes, M. E. Harmonics of circadian gene transcription in mammals. PLoS Genet. 5, e1000442 (2009).
- Atwood, A. Cell-autonomous circadian clock of hepatocytes drives rhythms in transcription and polyamine synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 18560-18565 (2011).
- Panda, S. Coordinated transcription of key pathways in the mouse by the circadian clock. Cell. 109, 307-320 (2002).
