Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l'expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Summary

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c'est à dire qu'ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d'horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l'étude de la biologie circadienne.

Abstract

Chez les mammifères, de nombreux aspects du comportement et de la physiologie comme cycles veille-sommeil et le métabolisme du foie sont régis par horloges circadiennes endogènes (revu ^1,2). Le rythme circadien garde-temps est un système hiérarchique multi-oscillateur réseau, avec l'horloge centrale située dans le noyau suprachiasmatique (NSC) la synchronisation et la coordination des horloges extra-SCN et périphérique ailleurs ^1,2. Les cellules individuelles sont des unités fonctionnelles pour la production et l'entretien des rythmes circadiens ^3,4, et ces oscillateurs de différents types de tissus de la part d'un organisme remarquablement semblable mécanisme biochimique rétroaction négative. Toutefois, en raison des interactions au niveau du réseau neuronal dans le SCN et à travers rythmiques, les indices systémiques au niveau organismique, les rythmes circadiens au niveau organismique ne sont pas nécessairement cell-autonomous ^5-7. Par rapport aux études traditionnelles de l'activité locomotrice in vivo et ex vivo d'explants SCN, cell-fondé des tests in vitro permettent la découverte de cellules autonomes défauts circadiens ^5,8. Stratégiquement, à base de cellules modèles sont plus dociles expérimentalement pour la caractérisation phénotypique et la découverte rapide des mécanismes d'horloge de base ^5,8-13.

Parce que les rythmes circadiens sont dynamiques, les mesures longitudinales avec une haute résolution temporelle sont nécessaires pour évaluer la fonction horloge. Ces dernières années, l'enregistrement bioluminescence en temps réel en utilisant la luciférase de luciole en tant que journaliste est devenu une technique courante pour étudier les rythmes circadiens chez les mammifères ^14,15, car elle permet l'examen de la persistance et de la dynamique moléculaire des rythmes. Pour surveiller des cellules autonomes rythmes circadiens de l'expression des gènes, les journalistes luciférase peut être introduit dans les cellules par transfection transitoire ^13,16,17 ou transduction stable ^5,10,18,19. Nous décrivons ici un protocole de transduction stable à l'aide de gènes médié par lentivirus. Te système de vecteur lentiviral est supérieur aux méthodes traditionnelles telles que la transfection transitoire et la transmission germinale en raison de son efficacité et la polyvalence: il permet l'exécution efficace et une intégration stable dans le génome de l'hôte à la fois la division et non les cellules en division ^20. Une fois une lignée cellulaire journaliste est établie, la dynamique de la fonction d'horloge peut être examiné à travers l'enregistrement de bioluminescence. Nous décrivons d'abord la génération de P (Per2)-d lignes journaliste Luc, puis présentent les données de cette étude et d'autres journalistes circadiens. Dans ces essais, les fibroblastes de souris 3T3 et U2OS cellules d'ostéosarcome humains sont utilisés comme modèles cellulaires. Nous discutons également de multiples façons d'utiliser ces modèles dans les études d'horloge circadienne. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à une grande variété de types de cellules pour étudier les bases cellulaires et moléculaires des horloges circadiennes, et peut s'avérer utile dans la résolution des problèmes dans d'autres systèmes biologiques.

Protocol

1. Construction de Lentiviral Reporters luciférase

Une construction reporter mammifère circadien contient généralement une cassette d'expression dans lequel un promoteur circadien est fusionné avec le gène de la luciférase. Les deux stratégies de ligature et la recombinaison basée sont couramment utilisés pour le clonage d'ADN. A titre d'exemple, nous décrivons ici une méthode basée sur la passerelle de recombinaison pour produire un clonage P (Per2)-Luc rapporteur d lentiviral, dans lequel la luciférase déstabilisé (d Luc) est sous le contrôle du promoteur de la souris Per2.

1. Clonage de Per2 promoteur. Utiliser la PCR pour amplifier le fragment d'ADN de promoteur Per2 526 pb en amont du site d'initiation de la transcription à partir d'un clone BAC ^9-13 Per2 souris, en utilisant une amorce sens (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') et une amorce anti-sens (5' -CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC TTGG-3 '), et clone dans pENTR5'-TOPO vecteur (Invitrogen) pour générerpENTR5'-P (PER2).
2. Clonage de Luc d. Le Luc d contient le gène de la luciférase de luciole et une séquence PEST C-terminal de la dégradation rapide des protéines comme décrit précédemment ^21. Utilisez PCR pour amplifier le fragment d'ADN d Luc, et clone dans pENTR / D-TOPO vecteur (Invitrogen) pour générer pENTR / Dd Luc.
3. Construction du vecteur rapporteur. Mélanger les deux plasmides pENTR, pENTR5'-P (Per2) et pENTR / Dd Luc, avec le vecteur lentiviral destination pLV7-Bsd (Bsd, gène de résistance blasticidine), et d'effectuer la réaction de recombinaison utilisant clonase pour générer un pLV7-Bsd-P (Per2)-d journaliste Luc (Figure 1). pLV7-BSD est une version modifiée (faite dans notre laboratoire) de pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen) dans lequel le virus hépatite de la marmotte post-régulation de la transcription des éléments (WPRE) séquences ²² ont été insérés immédiatement en aval de l'expression ca ssette pour améliorer l'expression des gènes.

2. Production de Particules Lentivirales

1. Cellules 293T semences (jour 1)

1. Cultivez rein embryonnaires humaines (HEK) 293T jusqu'à la confluence 90-100% pour l'appui régulier DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1x pénicilline-streptomycine-Glutamine (PSG) sur 10 cm boîtes de culture. (Rapidement les cellules en croissance avec un nombre faible passage sont essentiels pour la transfection efficace.)
2. Avant de semer les cellules pour les plaques de transfection, manteau culture à 6 puits en ajoutant 1 ml de 0,001% de poly-L-lysine dans du PBS dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 20 min. Aspirer la solution et rincer une fois avec du PBS 1x avant l'utilisation.
3. Dissocier les cellules 293T avec de la trypsine et de graines 0,75 x 10 ⁶ cellules sur chaque puits des plaques pré-enduites avec 2 ml de DMEM régulière. Les plaques de fond de turbulence afin d'obtenir une répartition uniforme des cellules dans chaque puits. Croître les cellules dans l'incubateur à 37 ° C pendant la nuit.

tep "> 2. transfection transitoire Via Capo ₄ / précipitation de l'ADN (jour 2)

1. Respecter les cellules ensemencées du jour 1. Cellule doit atteindre la confluence de 80-90%.
2. Préparer le mélange de transfection plasmidique dans un tube de 1,5 ml par addition de 2 ug d'un ADN plasmidique lentiviral journaliste (par exemple, pLV7-P (Per2)-d Luc, Liu laboratoire) et les 3 vecteurs d'encapsidation (1,3 mg Gag / Pol, 0,5 pg VSVG mg Rev, et 0,7; Invitrogen). En tant que commande à la fois pour la transfection et infection subséquente, on comprend généralement un puits supplémentaire dans la transfection d'un vecteur d'expression de la GFP lentiviral, pLV156-CMV-EGFP (figure 1A), hébergeant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) sous le contrôle du promoteur CMV ²⁰ comme décrit précédemment.
3. Ajouter 100 ul de 0,25 M CaCl ₂ (dilué avec de la DNase / RNase-free ddH ₂ O de 2,5 stock M) au mélange plasmide à l'étape 2 et bien mélanger. Puis ajouter 100 ul de 2x BBS solution (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 6,95) et mélanger doucement mais à fond. Incuber le mélange d'ADN à température ambiante pendant 15 min.
4. En attendant, aspirer moyen de cellules 293T et passer à 2 ml de milieu frais. Retourner la plaque à l'étuve pendant au moins 10 min pour équilibrer le pH du milieu avant la transfection.
5. Ajouter le mélange de transfection de l'étape 3 à 293T goutte à goutte cellules. Swirl doucement la plaque et d'observer la formation de particules sous un microscope. Incuber à 5% de CO _2, 37 ° C pendant la nuit. (Formation de particules fines de Capo ₄ précipité / ADN est essentiel pour la transfection efficace.)

3. Particules virales récolte (jours 3-4)

1. Environ 16 heures après la transfection (jour 3) par lequel les cellules de temps devrait atteindre 100% de confluence, aspirer moyen de cellules et la remplacer par 2 ml de DMEM frais réguliers. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
2. Au jour 4, d'évaluer l'efficacité de transfection en observant expression de l'EGFP dans les trancellules témoins (sfection efficacité de la transfection de 90-100% avec haute expression de l'EGFP est un prédicteur fiable d'une bonne préparation virale).
3. Recueillir le milieu contenant sécrétées, des particules virales infectieuses. Centrifuger à> 2,000 xg pendant 5 minutes pour éliminer les résidus des cellules 293T et recueillir le surnageant contenant le virus. Alternativement, le support peut être effacé par un filtre de 0,45 um membrane. Les particules virales sont prêts à être utilisés dans l'infection.

3. Infection de cellules 3T3

1. Cellules 3T3 semences (jour 3)

Split et le nombre de graines appropriée (~ 12.000) de cellules 3T3 sur une plaque à 12 puits pour obtenir la confluence de 20-30% par jour suivant. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.

2. Infecter les cellules 3T3 (jour 4)

1. Respecter les cellules ensemencées. Confluence de 20-30% (moins de 50%) est nécessaire pour l'infection.
2. Ajouter polybrène à une concentration finale de 5 pg / ml dans le milieu recueilli contenant viraleparticules. Bien mélanger par pipetage.
3. Aspirer moyen de cellules 3T3, et ajouter 1 ml du mélange ci-dessus virale par puits. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. (Polybrene est utilisé pour améliorer l'efficacité de l'infection, mais n'est pas absolument nécessaire. Comme il peut être toxique pour certaines cellules, le test préalable est recommandé.)

3. Sélectionnez les cellules infectées (jour 5 et au-delà)

1. Vingt-quatre heures après l'infection, aspirer un milieu contenant des virus et des cellules infectées polybrène, laver une fois avec du PBS 1x, et changer de milieu frais. Incuber à 37 ° C pendant la nuit pour la reprise et la croissance.
2. Lorsque confluente (habituellement 1-2 jours plus tard), diviser les cellules et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
3. Le lendemain, moyen aspiration des cellules (confluent <50% est souhaitée) et le remplacer par du milieu frais contenant 10 pg / ml blasticidine pour sélectionner des cellules transduites de manière stable. (Blasticidine tuer la courbe doit être déterminée empiriquement pour une lignée cellulaire donnée.)

4. Enregistrement bioluminescence de cellules Reporter

1. Cellules reporters de semences

Propager les cellules reporters blasticidine résistant et fendu sur des boîtes de culture de 35 mm. Incuber à 37 ° C jusqu'à confluence. Nous avons l'habitude de préparer ≥ 3 plats pour chaque lignée cellulaire rapporteur sous chaque condition pour le phénotypage circadien.

2. Synchronisation et de changement de support d'enregistrement

1. Aspirer moyen de cellules confluentes journaliste, laver une fois avec du PBS, et le remplacer par du DMEM contenant 10 uM (ou 200 nM de dexaméthasone) forskoline. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure pour synchroniser les cellules. (Alternativement, les cellules peuvent être synchronisés par ²³ cycles de température ou des chocs sérum ^24.)
2. En attendant, préparez dossiertion moyen pour les cellules 3T3 comme suit: 1x DMEM (HyClone) contenant 10% de FBS, 1x Pen / Strep / Gln, 1 uM de forskoline, 1 mM de luciférine, HEPES 25 mM, pH 7,4. Sérum et la concentration de forskoline peut être déterminée empiriquement. Pour les cellules très sombres, le rouge de phénol milieu exempt peuvent être utilisés.
3. À la fin du traitement forskoline, aspirer à moyen et à le remplacer par support d'enregistrement fraîchement préparé.

3. D'enregistrement bioluminescence de cellules reporters

1. Suite à changement de milieu, couvrir des boîtes de culture de 40 mm lamelles stériles et le joint en place avec de la graisse à vide pour éviter l'évaporation.
2. Charger la vaisselle sur le luminomètre LumiCycle, qui est maintenu à l'intérieur d'un incubateur réglé à 36 ° C sans H ₂ O ou CO _2.
3. Démarrez l'enregistrement en temps réel bioluminescence. Nous avons l'habitude d'enregistrer des rythmes pendant 1 semaine, puis changement de milieu et d'enregistrement en continu pour une deuxième semaine (voir Savelyev et al. Pour plus de détails) ^25. (Pour l'enregistrement de 96-nousll plaques, Synergy SL2 a été utilisé comme dispositif d'enregistrement, voir Discussion 1.1 pour les détails).

5. Analyse des données et présentation

Cellules Reporter faciliter enregistrement haute résolution de luminescence quantitative, critique pour la détermination des effets phénotypiques sur la fonction horloge circadienne. Pour obtenir les paramètres circadiens, y compris la phase, durée de la période, l'amplitude du rythme, et le taux d'amortissement, nous utilisons le programme d'analyse LumiCycle (Actimetrics) pour analyser les données de bioluminescence ^5,14. En bref, les données brutes sont équipés de base d'abord, et de lignes de base de données soustraites sont équipés d'une onde sinusoïdale, dont les paramètres sont déterminés. Pour les échantillons qui montrent des rythmes persistants, qualité de l'ajustement de> 90% est habituellement réalisé. En raison de la bioluminescence transitoire élevée lors de changement de milieu, nous avons l'habitude d'exclure le premier cycle de données de l'analyse.

Pour la présentation des données, nous avons l'habitude de représenter des données brutes (bioluminescence, coups / sec) contre time (jours). Lorsque cela est nécessaire, les données de base-soustraites peuvent être tracées pour comparer l'amplitude et la phase.

6. Les résultats représentatifs

1. Phase spécifiques journalistes circadiens

L'horloge circadienne est basé sur un mécanisme de rétroaction négative biochimique ^1. La boucle de rétroaction de base se compose d'activateurs transcriptionnels BMAL1 et CLOCK, et répresseurs pers et cristallisation, qui agissent sur ​​les éléments circadiens enhancer E / E'-box pour produire l'expression du gène rythmique (matin avec la phase, par exemple, Rev-erb α). Le noyau de boucle régule et intègre au moins deux autres éléments cis circadiens, l'élément de liaison DBP/E4BP4 (D-box; jour pour la phase, par exemple, PER3) et l'élément de ROR / Rev-erb liaison (RRE; pour la phase nocturne, par exemple, BMAL1) ^17. Réglementation combinatoire par plusieurs éléments circadien peuvent générer de nouveaux phases intermédiaires. Par exemple, Cry1 transcriptiontion est médiée par les trois éléments circadiens (c.-à-éléments, E / E 'et D-box-box dans le promoteur et RREs dans le premier intron du gène Cry1), donnant lieu à l'distincte Cry1 soir-temps de phase ^13.

Sur la base de ces mécanismes de régulation des gènes, nous avons généré des quatre constructions rapporteurs différents: P (Per2)-d-Luc et P (Cry1)-D journalistes Luc contenant à la fois E / E'-boîte et D-box éléments dans la région de régulation ^{17, 26,27;} P (Cry1) - Intron-Luc représentant d combinatoire réglementation par les trois éléments (c.-à-E / E'-boîte, D-box, et RRE) ^13,17, et P (BMAL1)-Luc d réglementé exclusivement par RRE ^9,17,19,21. Nous avons introduit ces journalistes dans les cellules 3T3 de produire des phases distinctes d'expression prévus journaliste (figure 2).

2. Inactivation génique par interférence ARN et pharmacologiquement active composés

Lorsque l'efficacité de transfection est élevé, siARN synthétiques peuvent être transfectées de façon transitoire dans les cellules d'abattre l'expression des gènes. Lorsque la transfection est techniquement difficile, un vecteur d'expression peut être shRNA manière stable dans les cellules transduites par infection lentivirale, de sorte que shRNA produite par la cellule est traitée de siRNA pour effet de choc gène (KD). Nous présentons ici les effets de KD Cry1 et Cry2 gènes en utilisant des siRNA dans des cellules U2OS (figure 3A) et shRNA dans des cellules 3T3 en utilisant un vecteur d'expression pLL3.7 passerelle ⁹ (figure 3B). En plus des cellules 3T3, le modèle U2OS est devenu un autre modèle d'horloge prééminent cellulaire en grande partie parce qu'il répond aux exigences essentielles de criblage à haut débit disponibles dans le commerce siRNA à l'homme (par exemple, l'origine de l'homme, capable de générer des rythmes circadiens robustes, la fonction de validation tous les gènes de l'horloge sont connus, et qui se prêtent à une transfection très efficace etd'enregistrement luminescence quantitative). Dans les deux types cellulaires, l'ARNi médiée KD entraîné phénotypes d'horloge en conformité avec la souris knock-out précédente (KO) et cellulaires études KD ^5,10,11,28. Par exemple, Cry1 KD durée de la période se raccourcit et réduit la persistance rythme, tandis que Cry2 KD allonge la période. En outre, certaines petites molécules peuvent être utilisées pour pharmacologiquement cible et la fonction des protéines perturbent (figure 3C).

Figure 1. Le système de lentivirus gène à médiation livraison. (A) Représentation schématique de deux lentiviral P (Per2)-d vecteurs rapporteurs Luc et un CMV-EGFP construire. Seule la région à l'intégration dans le génome de la cellule hôte est représenté. Dans les deux constructions rapporteurs, la transcription de Luc d est sous le contrôle direct du promoteur Per2. Dans le pLV7-Bsd-P (Per2)-vecteur d Luc (recombinaison basée sur le clonage), un gène de résistance coexprimé blasticidine (BSD) facilite la sélection des cellules infectées. Dans le pLV156-P (Per2)-Luc vecteur d (ligature à base de clonage), traduction EGFP est médiée par un site d'entrée interne du ribosome (IRES) en aval de Luc d, permettant l'observation visuelle et tri par FACS des cellules infectées. En outre, un promoteur SV40 / terminaison (P / T) est utilisé comme isolant (voir la discussion 1.3). Dans le vecteur CMV-EGFP contrôle, expression EGFP est sous le contrôle d'un promoteur fort CMV. (B) des images fluorescentes de la GFP-exprimant les cellules transfectées et infectées. En règle générale, nous obtenons une grande efficacité à la fois dans la transfection transitoire de cellules 293T et l'infection lentiviral de lignées cellulaires de notre intérêt, comme indiqué par l'expression de GFP dans ces cellules. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Phase expression spécifique des journalistes bioluminescence dans les cellules 3T3 Les vecteurs rapporteurs lentiviraux utilisés dans cette expérience sont pLV7-Bsd-P (Per2)-d-Luc, P (Cry1)-d-Luc, P (Cry1) -. Intron-d-Luc, et P (BMAL1)-d-Luc. Chaque rapporteur présente une phase distincte de l'oscillation, comme indiqué par les flèches. Alors que le Per2 et Cry1 bioluminescence disque promoteurs pic à jour phases matin et le promoteur BMAL1 à la phase nuit, la régulation par la combinatoire P (Cry1) - Intron héberger E-box, D-box, et les éléments RRE confère phase de soirée de la bioluminescence de pointe . Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Perturbation génétique et pharmacologique des rythmes circadiens bioluminescence dans les cellules rapporteurs. (A) Les effets de Cry1 et Cry2 knockdown par des siRNA sur les rythmes cellulaires de cellules reporters U2OS. Le luminomètre LumiCycle a été utilisé pour l'enregistrement bioluminescence de cellules dans des boîtes de 35 mm. Figure adaptée de référence n ° 10, avec la permission d'Elsevier (2009). (B) Effets de Cry2 knockdown par shRNA sur les rythmes cellulaires de cellules 3T3 journaliste. Un vecteur pLL3.7 passerelle contenant une cassette U6-shRNA a été utilisé pour Cry2 inactivation génique. shRNA2 a une meilleure efficacité que knockdown shRNA1 tel que déterminé par analyse par Western blot (données non présentées). Un luminomètre Synergy a été utilisé pour l'enregistrement bioluminescence de cellules dans une plaque de 96 puits. Les réglages d'enregistrement sont les suivantes: température de l'incubateur., 33 ° C, le temps d'intégration, 15 sec; intervalle de temps, 30 min (C) Effets des inhibiteurs de petites molécules sur celrythmes lume de cellules reporters U2OS. Chir99021 et roscovitine sont des inhibiteurs dirigés contre GSK-3 et CDK, respectivement. Le système ViewLux (Chir99021 dosage) et un luminomètre Tecan (roscovitine dosage) ont été utilisés pour les enregistrements de bioluminescence de cellules en plaques de 384 puits. Figure adaptée de la référence # 19 (Copyright 2008 National Academy of Sciences, États-Unis). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

1. Modifications au Protocole actuel

1,1 appareils d'enregistrement et de considérations débit

En raison de sa disponibilité commerciale, la LumiCycle (Actimetrics) est devenu l'appareil le plus couramment utilisé luminomètre automatisé pour enregistrement en temps réel ^{4,5,9,19,29-31.} Le LumiCycle emploie des tubes photomultiplicateurs (PMT) en tant que détecteurs de lumière, qui offrent une extrême sensibilité et faible bruit ^14, et est donc particulièrement adapté pour l'acquisition de données extrêmement faible luciférase basé sur la bioluminescence. D'autres similaires PMT à base de dispositifs (par exemple, Kronos, Atto Co. et Polarstar Optima, BMG Labtech Inc) ont également été utilisés dans de nombreuses études ^32,33.

Le test à l'aide LumiCycle boîtes de 35 mm peut être adapté à 96 -, 384 - ou même les formats de plaques 1152 puits pour criblage à haut débit (HTS) des expériences. HTS test de développement se concentre principalement sur les deux aspects suivants: 1Cellules) rapporteur luciférase mieux avec plus brillant et d'expression journaliste / ou supérieur (voir ci-dessous), et 2) appareils d'enregistrement très sensibles qui peuvent accueillir plaques multi-puits. Nous et d'autres avons utilisé plusieurs lecteurs de microplaques Synergy tels que SL2 (BioTek), Infinite M200 (Tecan) ^19, TopCount (PerkinElmer) ^28, et EnVision (Perkin Elmer) ^34. Dans notre laboratoire, à la fois le LumiCycle et des dispositifs de Synergy sont placés dans une température contrôlée et étanche à la lumière incubateur. En variante, si les ressources le permettent, les unités d'enregistrement peuvent être placés dans une chambre à température contrôlée. Pour HTS, les paramètres critiques tels que l'intégration / temps d'exposition et l'intervalle entre les points dans le temps doit être déterminée empiriquement pour un journaliste donné et le dispositif d'enregistrement.

Le test LumiCycle ne fournit pas l'information spatiale à la résolution cellule unique. Yamaguchi et al. ³⁵ et Welsh et al. ^4,5 pionnière imagerie par bioluminescence en temps réel par integrating un microscope spécialement conçu avec une grande sensibilité, à faible bruit caméra CCD ¹⁵ pour obtenir une résolution cellule unique. Ces dernières années, les systèmes d'imagerie les plus sensibles sont devenus disponibles dans le commerce, y compris LV200 (Olympus) et CellGraph (AB3000-B, Atto), avec une refroidi ultrasensible et rétro-éclairé de multiplication d'électrons filtres CCD et multicolore ^36,37. Imaging a également été utilisé dans des expériences HTS plus sophistiquées, par exemple, un ViewLux imageur CCD (Perkin-Elmer) en combinaison avec le système automatisé GNF robotique (Systèmes GNF). Ce système a permis à grande échelle des écrans pour de nouveaux gènes et de petites molécules qui affectent ^10,12,19 fonction d'horloge.

1,2 journalistes luciférase

Luciférases ont d'abord été utilisé dans l'enregistrement de luminescence en temps réel de l'expression des gènes circadiens dans les années 1990 dans les usines et les cyanobactéries, et ont été couramment utilisée dans le système mammifère depuis 2000 ^29,35,38-40 (unlso voir les commentaires ^14,15). Journalistes luciférase sont généralement moins toxiques et plus sensible que les reporters fluorescents tels que la GFP, en raison de fond beaucoup plus faible ^41. Le reporter le plus couramment utilisé est bioluminescent luciole (Photinus pyralis) luciférase (Luc +) construite dans le vecteur pGL3 série (Promega), dans lequel la région codante de la native Luc a été modifiée pour optimiser la transcription et de la traduction. La combinaison de la luciférase de luciole et son substrat très stable et cellule-perméable, D-luciférine, est idéal pour un enregistrement longue durée. d Luc est une version modifiée de Luc + avec une séquence PEST fusionnée à son extrémité C-terminale pour permettre à la dégradation rapide des protéines. Une version améliorée, Luc2, est disponible dans la série pGL4 vecteur (Promega) avec une expression plus élevée et moins anormale. Cependant, nous n'avons pas observé de différence significative de performance entre Luc et + Luc2 en transfectées de façon transitoire Cellules 3T3 et U2OS (données non présentées). Dans un récent rapport, le Brésilien taupin luciférase (Luc E) a été montré pour présenter un signal beaucoup plus lumineux que Luc +, adapté pour l'imagerie cellulaire unique ^42.

Plusieurs études récentes ont profité de la mPER2 :: LUC fusion knock-in ^{4,5,9,19,25,29-31,43} souris journaliste. Ce système rapporteur permet phénotypage circadien des cellules et des explants de tissus, y compris le SCN. Dans nos études précédentes, nous avons traversé cette lignée de souris journaliste avec beaucoup de KO comportemental caractérisés gènes d'horloge et examiné la dynamique des rythmes bioluminescence au SCN, le foie et les explants pulmonaires cultivés ex vivo, et dans les neurones dissociés du RCS et les fibroblastes cultivés in vitro ^{4, 5,9,31.} Ces études nous ont permis d'obtenir des informations importantes dans les détails moléculaires de fonctionnement de l'horloge au niveau des cellules et des organismes.

1.3 Méthodes de livraison Gene

e_content "journalistes d'horloge> vectoriels offrir une grande polyvalence, car ils peuvent être introduits dans divers types de cellules par transfection transitoire ^11,13,16,17 ou la transduction lentivirale ^5,9,18. Même si lourdes et moins reproductible, les cellules transfectées de façon transitoire peut également être cultivées en présence continue d'antibiotiques pour générer des lignées cellulaires stables. vecteurs lentiviraux sont toujours préféré en raison de leur intégration stable dans le génome de la cellule, ainsi qu'une plus grande efficacité et la polyvalence. Outre le vecteur pLV7 présenté ci-dessus dans lequel les cellules infectées peuvent être sélectionné avec des antibiotiques, nous avons utilisé d'autres vecteurs. Par exemple, le pLV156-P (Per2)-d Luc vecteur contient un P (Per2)-d cassette d'expression de Luc-IRES-EGFP dans lequel la traduction EGFP est médiée par une entrée interne du ribosome site (IRES) en aval de Luc d, permettant l'observation visuelle et le tri de cellules activé par fluorescence (FACS) des cellules avec integratvecteurs ed ⁵ (figure 1) (voir ci-dessous). Pour protéger le journaliste de l'intégration des effets de site, un promoteur constitutif et de terminaison (P / T) peut être présenté comme un isolant ou leurre immédiatement en amont de la position P (Per2)-d cassettes Luc expression du rapporteur (par exemple, en bas de construire sur la figure 1A ), tel que rapporté par Brown et al. ¹⁸ et Liu et al. ⁵

Des études antérieures établi les bases d'une exploration de tissu-spécifique perturbation génétique in vivo et / ou ex vivo ^44-48. Par exemple, les particules virales peuvent être injectés dans la région SCN suivie par la préparation tranche SCN. Comme une alternative à cette in vivo suivie par un test ex vivo, des tranches de SCN peuvent être disséqués premier et cultivées ex vivo, suivie d'une incubation avec haut titre viral. Toutefois, en raison de l'efficacité des infections de bas de tranches de tissu relativement épais,un ex vivo très cohérente protocole reste à développer.

1.4 Choix des lignées cellulaires et des conditions d'enregistrement

Une grande partie de ce que nous savons au sujet de la biochimie et de la biologie cellulaire du mécanisme d'horloge est basée sur trois modèles cellulaires: fibroblastes de souris 3T3 ^16,17, les cellules d'ostéosarcome humain U2OS ^10,11,19,28 et des fibroblastes de souris provenant de souris ^{9,13 , 34.} Le système de vecteur lentiviral permet fourniture efficace et une intégration stable dans le génome de l'hôte à la fois de la division et de la non-séparation des cellules de mammifères, et n'est donc pas limitée à certains types de cellules, comme dans transfection transitoire. Compte tenu des rôles des horloges circadiennes dans la régulation d'une large gamme de réponses cellulaires et physiologiques, les études futures seront certainement s'étendre à une grande variété de types de cellules, soit des lignées cellulaires disponibles dans le commerce ou des cellules primaires provenant de souris. Ces études horloge cellules autonomes aidera à découvrir des tissus ubiquItous, ainsi que des tissus spécifiques, les propriétés des horloges circadiennes.

Il est intéressant de noter que la génération de cellules reporters peuvent nécessiter des tests empiriques de journalistes différents (par exemple, différents types de vecteurs et promoteur), et parfois une optimisation plus poussée. Pas tous les types de cellules ont des cellules autonomes rythmes. Pour améliorer la santé des cellules et la persistance des rythmes cellulaires, l'optimisation du support d'enregistrement est souvent nécessaire. Par exemple, comme une alternative au support d'enregistrement 3T3, le support d'enregistrement utilisé pour les cellules U2OS est la suivante: 1x DMEM (Invitrogen), 2% de B-27, 1 pM 1 mM forskoline, la luciférine, 14,5 mM de NaHCO3, 10 mM d'HEPES (pH 7,2). 1 mM de luciférine est généralement suffisant, mais une concentration finale (0,1-1 mM) peut être déterminée pour chaque type de cellule / journaliste. La forskoline peut-être pas nécessaire et sa concentration peut être déterminée empiriquement pour chaque type de cellule.

1.5 L'efficacité de transfection in prep lentiviral

Haut trl'efficacité ansfection de cellules 293T est essentiel pour une bonne préparation virale. Considérations importantes comprennent la santé des cellules 293T et le choix d'un réactif de transfection. Des cellules 293T sont très affirmés et nécessitent une manipulation attentive. Ainsi, le taux de croissance des cellules et la morphologie doit être soigneusement contrôlée. Par souci de cohérence, nous recommandons que le sérum de tester d'abord et même lot testé utilisée par la suite pour maintenir les cellules. Nous avons toujours tester de nouvelles BBS 2x et solutions de CaCl actions ₂ et optimiser concentration de travail de CaCl ₂ 0,25 M. Les cellules autour de nombre de passage élevée et / ou l'affichage faible taux de croissance ne doit pas être utilisé. Des cellules 293T sont facilement transfectables avec un certain nombre de réactifs de transfection. En plus de CaPO _4, nous avons également réalisé une excellente efficacité de la transfection avec Fugene 6 (Roche ou Promega) ou la Lipofectamine-2000 (Invitrogen). Ces transfection à base de lipides (lipofection) réactifs sont plus chers, mais de donner une consistance meilleure transfection de CaPO _4. For à grande échelle preps lentiviraux, nous vous recommandons d'utiliser CaPO4 pour la transfection en raison d'un faible coût.

1.6 Génération de lignées cellulaires clonales

Non concentrés bruts particules virales sont de titre relativement faible (10 ⁶ particules virales / ml), et expression du rapporteur dans les cellules transduites est faible. Bien que cela soit suffisant pour la plupart des applications telles que l'enregistrement LumiCycle, brillantes journalistes sont souvent nécessaires, par exemple dans des tests à haut débit en utilisant un appareil d'enregistrement moins sensible. Reporter expression peut être augmentée en utilisant des préparations virales de titrage plus élevées. Pour ce faire, nous vous recommandons d'utiliser des récipients de culture plus ces plats AS15 cm pour la transfection et la collecte des médias deux fois au jour 4 et le jour 5. Pour la concentration 10x (10 ⁷ particules virales / ml), effectuer une filtration à l'aide centrifuges dispositifs de filtration (Millipore). Pour une concentration 100 fois ou plus (≥ 10 ⁸ particules virales / ml), procédez comme décrit précédemment ultracentrifugation 5,18 longueur de la période. Si une population homogène de cellules est désiré, des lignées cellulaires clonales peuvent être obtenus par FACS à base de cellules du même tri dans des plaques 96 puits. Cependant, il est impératif que ces cellules clonales être soigneusement examinée; la morphologie des cellules doit être distinguée de cellules parentales, et les propriétés d'horloge tels que durée de la période et l'amplitude doit être représentatif de la population cellulaire infectée.

2. Application de cellules autonomes Modèles Horloge Reporter

Contrairement aux modèles de tissus ou animale, à base de cellules modèles se prêtent à des perturbations génétiques et pharmacologiques et, si nécessaire, également utiliser des formats HTS. La perturbation de la fonction du gène peut être réalisée par une sur-expression ou ARNi médiée par effet de choc. Sélectifs de petites molécules peuvent être utilisés pour interférer avec la fonction des protéines. Ici, nous avons brièvement Discuss certaines utilisations des modèles d'horloge cellules autonomes dans les études circadiens.

2.1 Étude des mécanismes d'horloge de base

Modèles d'horloge cellules autonomes ont grandement facilité les études mécanistiques. Hogenesch et ses collègues ont utilisé le modèle 3T3 de montrer que la répression des commentaires par Crys est nécessaire pour ¹⁶ fonction d'horloge, et le modèle U2OS de sonder les propriétés au niveau du système de ¹¹ fonction d'horloge. Nous avons utilisé le Cry1-/ -: Cry2-/ - modèle de fibroblastes provenant de souris pour afficher les informations que le refoulement retardé est nécessaire pour la fonction horloge ^13, et la BMAL1-/ - modèle de fibroblastes de montrer que Rev-erbα et β jouent un rôle dans redondants régulation RRE médiée par l'expression des gènes rythmique, et que le rythme BMAL1 n'est pas critique nécessaire pour la fonction d'horloge de base ^9. Par ailleurs, le dépistage chimique dans les cellules reporters a permis l'identification et / ou la clarification des fonctions de GS(Raccourcissement période où perturbé) K-3 β ^19, CK1σ et ε (période de prolongation lors perturbé) ^49, et CK1α ^12. Comme on le verra ci-dessous, ces modèles facilitent l'identification des composants d'horloge supplémentaires. Stratégiquement, ces modèles cellulaires sont plus docile pour la découverte rapide des mécanismes de base, qui fourniraient alors des nouveaux points d'entrée pour la validation in vivo et d'exploration.

2.2 Identification des facteurs d'horloge

En plus de la boucle de rétroaction de base, le mécanisme de l'horloge intègre également diverses signalisation et la réglementation. Pour l'identification des composants d'horloge supplémentaires et des modificateurs, des modèles d'horloge cellules autonomes sont plus avantageux que le dépistage génétique chez la souris en raison de la létalité inhérente, effets pléiotropes, et le développement de rémunération génétique associée à des modèles animaux mutants ^50. Basées sur les cellules écrans, en combinaison avec de génomique fonctionnelle appromaux ont été effectivement réalisée à l'aide de systèmes d'enregistrement à haut débit de criblage du génome entier siRNA et shRNA bibliothèques pour l'identification des facteurs d'horloge de nouveaux ^10,28. De même, on peut utiliser des approches biologiques et chimiques d'écran pour diverses petites molécules pour étudier leurs effets sur la fonction horloge ^12,19,34,49. Bien que les principaux gènes de l'horloge et de leurs fonctions ont été identifiées, ces écrans ont identifié des composants supplémentaires ou des modificateurs qui sont impliqués dans la régulation ou la modulation de l'horloge. Beaucoup de ces modificateurs représentent des modalités particulières d'intégration de la transduction du signal des signaux synchrones ou asynchrones (entrées d'horloge).

2.3 Étude des sorties d'horloge

Bien que pratiquement toutes les cellules in vivo ont des horloges circadiennes, les cellules cultivées in vitro ne présentent pas nécessairement manifestes rythmes circadiens. Dans ce contexte, l'approche journaliste constitue un outil utile pour vérifier si laMécanisme d'horloge existe dans un type cellulaire particulier. Présence de mécanismes d'horloge de cellules autonomes justifient des études de sorties d'horloge par ces cellules, ainsi que dans les tissus in vivo, y compris le transcriptome par puces à ADN ou de l'ARN ^51,52, réseaux de régulation de la transcription, le protéome et le métabolome. Ces études portent sur l'ensemble du génome ARN et les modes d'expression des protéines et donc viendrait compléter les tests cellulaires reporter luminescence qui ne reflètent pas nécessairement l'expression endogène.

3. Importance des modèles d'horloge Cell-autonomes

Coordination de la fonction circadienne au sein du SCN et à travers la cellule et des types de tissus est un aspect essentiel de la physiologie normale ^30. Le SCN centrale et horloges périphériques sont tous des éléments essentiels de l'organisation générale du rythme circadien. Le SCN reçoit l'entrée de la lumière directement sur la rétine pour entraîner le cycle lumière / obscurité, et sert en tant que coordonnateur desynchroniser les horloges périphériques via des connexions à la fois neuronaux et hormonaux. En plus de la synchronisation interne, l'horloge moléculaire dans les tissus périphériques et les cellules orchestre aussi une myriade de réseaux transcriptionnels de sortie, ce qui en définitive, gouvernent ouvertement rythmes circadiens dans la physiologie et le comportement.

Ainsi, les deux signaux systémiques et locales règlementent la physiologie circadienne, et il est nécessaire de découvrir des gènes circadiens directement régis par des cellules autonomes par rapport à ceux des horloges indirectement régulée par des signaux systémiques émanant du SCN. Le rôle des horloges périphériques peuvent être étudiés dans des modèles d'horloge cellules autonomes, dans lequel les influences systémiques sont supprimés. Dans le cas du foie, le tissu-spécifiques des réseaux de régulation générer des rythmes locaux physiologie ^51,53. En comparant in vitro et in vivo rythmes circadiens, nous serons capables de distinguer les cellules autonomes et systémique fonctions d'horloge cue-motrices. En effet, recent des études ont commencé à révéler un rôle important pour l'horloge du foie dans l'expression génique hépatique ^6,51,52. Les recherches futures dans le domaine garantit le développement de modèles de tissus et de cellules différentes d'horloge spécifiques d'un type représentant les différentes sorties physiologiques.

Des études antérieures sur la biochimie et la biologie cellulaire du mécanisme d'horloge ont largement reposé sur un nombre limité de types de cellules et de tissus, y compris en particulier 3T3, U2OS, les fibroblastes de souris, et le foie. Une hypothèse implicite dans la plupart des études circadiens, c'est que l'horloge fonctionne de la même façon dans tous les types de tissus et de cellules et la fonction du gène déterminé dans une cellule ou un type de tissu est généralement considéré comme universellement applicables dans toutes les cellules ^7. Toutefois, en établissant et en caractérisant plus de modèles d'horloge cellules autonomes, les études futures devraient découvrir les propriétés des tissus sous-jacents spécifiques horloge locale biologie circadienne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	HyClone	SH30243FS	For regular cell growth
DMEM	Invitrogen	12100-046	For luminometry
FBS	HyClone	SH3091003
Pen/Strep/Gln(100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-Luciferin	Biosynth	L-8220
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
All other chemicals	Sigma
Equipment
Tissue culture incubator			5% CO2 at 37 °C
Tissue culture hood			BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope			Phase contrast optional
LumiCycle	Actimetrics