Summary
Descriviamo un metodo per modificare geneticamente primarie cellule T umane con un transgene utilizzando il non virale
Abstract
Il sistema piggyBac trasposoni è naturalmente attivo, originariamente derivato dal 1,2 cavolo crochet falena. Questo non virale sistema è basato plasmide, più comunemente utilizzando due plasmidi con uno esprimere l'enzima piggyBac trasposasi e un trasposone plasmide ospitare il gene (s) di interesse tra elementi ripetute invertite che sono necessarie per l'attività di trasferimento genico. PiggyBac trasferimento genico media attraverso un meccanismo "taglia e incolla" che la trasposasi integra il segmento trasposoni nel genoma della cellula bersaglio (s) di interesse. PiggyBac è dimostrato efficace attività consegna del gene in una vasta gamma di 1,2 insetto, mammifero 3-5, e umano cells6 inclusione dei linfociti T umani 7,8. Recentemente, un trasposasi iperattivo piggyBac è stata generata migliorare l'efficienza di trasferimento genico 9,10.
Linfociti T umani sono di intere clinicast per l'immunoterapia adottiva del cancro 11. Da segnalare, il primo studio clinico che ha coinvolto la modifica trasposone delle cellule T umane che utilizzano il sistema di trasposoni Sleeping Beauty è stato approvato 12. Abbiamo precedentemente valutato l'utilità della piggyBac come non virale metodologia per modificazione genetica di cellule T umane. Abbiamo trovato piggyBac essere efficiente una modificazione genetica di cellule T con un gene reporter e un non immunogeno gene suicida inducibile 7. Analisi dei siti di integrazione genomica ha rivelato una mancanza di preferenza per l'integrazione in zona di noti proto-oncogeni 13. Abbiamo usato piggyBac per modificare gene-linfociti T citotossici per trasportare un antigene recettore chimerico diretto contro l'antigene tumorale HER2, e trovato che geni modificati cellule T mediato mirata uccisione delle cellule tumorali HER2-positivi in vitro e in vivo in un modello di topo ortotopico 14. Abbiamo anche utilizzato piggyBacper generare cellule T resistenti alla rapamicina, che dovrebbero essere utili nelle terapie del cancro in cui è utilizzato rapamicina 15.
Qui, si descrive un metodo per utilizzare piggyBac modificare geneticamente primarie cellule T umane. Questo include isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da sangue umano seguita dalla cultura, modificazione genetica, e l'attivazione di cellule T. Ai fini della presente relazione, le cellule T sono state modificate con un gene reporter (eGFP) per l'analisi e la quantificazione dell'espressione genica mediante citometria a flusso.
PiggyBac può essere utilizzato per modificare cellule T con una varietà di geni di interesse. Anche se abbiamo usato piggyBac per dirigere le cellule T ad antigeni tumorali 14, abbiamo usato anche piggyBac per aggiungere un interruttore di sicurezza inducibile per eliminare cellule gene modificato se necessario 7. La capacità di carico di grandi dimensioni di piggyBac ha anche permesso di trasferimento genicoun grande rapamicina mTOR molecola resistente (15 kb) 15. Pertanto, presentiamo una non virale metodologia stabile gene-modifica di cellule T umane primarie per una varietà di scopi.
Protocol
Giorno 0
1. Isolamento di PBMC da sangue umano
- Raccogliere 20 ml di sangue umano fresco con prelievo venoso in Na-eparina vacutainer.
- Mix sangue e Advanced RPMI 1640 in 1:1 (v / v) rapporto.
- Aggiungere 20 ml di mezzo Lymphoprep un tubo da centrifuga da 50 ml (25 ° C). Lentamente strato 25-30 ml di sangue RPMI-1640 mix sopra il Lymphoprep.
- Centrifugare a 400 xg per 40 min senza freni.
- Raccogliere sia strati distinti e fuzzy utilizzando una pipetta monouso in 10 ml di PBS 1x (25 ° C) e portare il volume a 50 ml con PBS 1x.
- Centrifugare a 450 xg per 10 min.
- Aspirare il surnatante completamente e aggiungere 20 ml di RPMI 1640 Avanzata.
- Centrifugare a 400 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante. Aggiungere 10 ml di mezzi completi cellule T integrato con 5 ng / ml rhIL-15 preriscaldato a 37 ° C.
- Contare il numero di cellule e la piastra in un cappotto coltura tissutale a 24 pozzettipiastra ed a 2 x 10 6 cellule / pozzetto in completo supporto delle cellule T integrato con 5 ng / ml rhIL-15 Aggiungi acqua sterile per pozzi circostanti. Incubare per una notte in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 1
2. Piastre con rivestimento anti-CD28 e anti-CD3 per stimolare le cellule T
- Diluire anti-CD28 e anti-CD3 anticorpi in acqua sterile alla concentrazione di 1 ug / ml ciascuno.
- Aggiungere 500 ul di soluzione ogni anticorpo a 5 pozzetti marcati di un non-rivestito coltura di tessuti 24 pozzetti.
- Aggiungere acqua sterile a riposo dei pozzetti. Avvolgere la piastra in termoretraibile e mettere in un 4 ° C frigorifero.
3. Nucleofection di non stimolato cellule T
- Preriscaldare supporti delle cellule T a 37 ° C e con supplemento di 5 ng / ml di rhIL-15. Preparare soluzione completa Nucleofector con l'aggiunta di 500 microlitri del Supplemento Nucleofector 1-2,25 ml di soluzione Nucleofector.
- Laliquot 5 pg ognuno di trasposoni (Zeo-pT-CMV-eGFP) e transposasi (pCMV-piggyBac) in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Nota: potrebbe essere necessario ottimizzare la quantità e trasposasi DNA trasposone per il trasferimento genico ottimale e per minimizzare tossicità cellulare. I plasmidi possono essere ottenuti da autori richiesta.
- PBMC raccolta dalla piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti in un tubo da 50 ml. Contare il numero di cellule. Salvare 2 x 10 6 cellule per uso come controllo durante citometria a flusso.
- Aggiungere 7-10 x 10 6 cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 400 xg, 5 min, Aspirare il surnatante e finger-flick il pellet.
- Aggiungere 100 ml di soluzione di cellule T nucleofection completo al pellet allentato.
- Aggiungere la soluzione di cellule miscela nella provetta contenente i plasmidi.
- Aggiungere la soluzione-cellula-plasmide miscela al fondo della cuvetta nucleofection. Fare attenzione a non introdurre bolle.
- Nucleofect le cellule che utilizzano programmo U-014 (non stimolate le cellule T, umane, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Immediatamente aggiungere 500 microlitri di media preriscaldata con rhIL-15 alla cuvetta. Trasferire le cellule ad un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con 1,5 ml di mezzo preriscaldata con rhIL15.
- Incubare per una notte in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 2
4. La stimolazione non specifica delle cellule T
- Harvest cellule e determinare il numero di cellule. Annullare 0,5 x 10 6 cellule per citometria a flusso per determinare la frequenza di cellule GFP-positive. Utilizzare i non transfettate PBMC come controlli.
- Aspirare la soluzione di anticorpi CD3/28 dalla piastra di coltura tissutale non rivestito e lavare ogni pozzetto con supporto di cellule T.
- Risospendere le cellule nucleofected a 0,5 x 10 6 cellule per ml in mezzi completi CTLsupplementato con 5 ng / ml rhIL-15. Aggiungere 2,0 ml ciascuna delle celle nucleofected in 4 pozzetti della piastra non coltura tissutale. Aggiungere 0,5 x 10 6 cellule non nucleofected al 5 bene.
- Incubare per 3 giorni in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2.
Giorno 5
- Raccogliere le cellule T stimolate dalla non rivestita piastra di coltura tissutale.
- Contare e replate le cellule in una piastra a 24 tessuto ben ricoperto coltura a 0,7 x 10 6 cellule / ml in mezzi di cellule T con 5 ng / ml di IL-15.
7 ° giorno
7. L'analisi dell'espressione genica
- Cellule Harvest e macchia con anti-umano CD8 (potrebbe anche usare anti-CD3 e anti-CD4) e analizzare con citometria a flusso per l'espressione% GFP.
8 ° giorno (opzionale)
8. L'espansione delle cellule T
- Il giorno 8 dopo la trasfezione, le cellule T possono essere saltuariamente a T-Cellule supporto con IL-15 ad una densità di 0,7 x 10 6 cellule per pozzetto per un'ulteriore espansione 16.
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Representative Results
Uno schema dimostrando i passaggi modificare geneticamente linfociti T umani con un gene reporter (eGFP) è mostrato in Figura 1. Questi plasmidi sono disponibili su richiesta presso gli autori. Un schemtic dimostrando i passaggi geneticamente modificati linfociti T umani con un gene reporter (eGFP) è showin in Figura 2. È necessario attivare le cellule T in modo da farli dividere, espandere e diffondere nella cultura. Modificati cellule umane T sono state poi coltivate ed analizzate in citometria a flusso per l'espressione genica il giorno 1 e il giorno 7. Vengono mostrati i risultati di un donatore in Figura 3. Cellule sono state colorate con alloficocianina (APC)-coniugato anti-CD8, analizzati per eGFP (transgene) e APC fluorescenza da una FACSCalibur equipaggiato con il set di filtri per 4 segnali di fluorescenza usando un software Quest cellulare (Becton Dickinson). Abbiamo già osservato modificazione genetica di entrambi i CD4 e CD8 T positivi e demone quistrare cellule CD8 positivi come esempio 7. Anche se abbiamo analizzato qui per singola espressione del transgene, piggyBac è stato utilizzato anche per il trasferimento genico multi-gene (o multiplex) in cellule umane 17. La riduzione di espressione eGFP tra il giorno 1 e il giorno 7 è probabilmente dovuto al fatto che non tutte le cellule trasfettate subiscono integrazione stabile di DNA trasposone.
Figura 1. Schematica dei plasmidi utilizzati per piggyBac modificazione genetica mediata di cellule T umane. CMV, promotore del citomegalovirus, introni, SV40 introne per la stabilizzazione mRNA; piggyBac, trasposasi cDNA; SV40 pA, sito di poliadenilazione, pUC, origine di replicazione, b-lattamasi, gene di resistenza all'ampicillina, PB3'IR, piggyBac 3 'ripetizione invertita; PB5' IR, piggyBac.. Ripetizione invertita 5 '; ZeoR, gene di resistenza zeocin; R6K Ori, origine di replicazione, IVS, sequenza intermedio; eGFP, gene reporter fluorescente Nota: gli antibiotici sono stati utilizzati per la selezione di batteri e la crescita, ma non sono stati utilizzati in colture di cellule T Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Schema descrive la modifica di cellule T umane primarie utilizzando il sistema trasposone piggyBac.
Figura 3. Espressione del transgene in cellule T Stabile modificato con il trasposone piggyBac system. I pannelli a sinistra: l'espressione eGFP al giorno 1. Pannelli di destra:. Espressione eGFP il giorno 7 Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Il metodo qui descritto consente la modifica stabile del transgene primari linfociti T umani. Abbiamo precedentemente testato l'utilizzo del sistema piggyBac trasposone per modificare le cellule T per esprimere un gene reporter (per più di 4 settimane), un non immunogeno gene suicida, un recettore antigene chimerico per immunoterapia adottiva (per più di 100 giorni), e per progettare la resistenza ai farmaci immunosoppressivi 7,13-15. Non virale modifica di cellule T per l'immunoterapia adottiva e altre applicazioni dovrebbe essere molto meno costoso e quindi più ampiamente utilizzato di trasduzione retrovirale. L'uso di nuovi elementi piggyBac iperattivi dovrebbe aumentare la fattibilità della produzione di transgene stabile modificato cellule T 9. Anche se non descritti, si può ottenere numeri necessari di cellule trasfettate stabilmente T per potenziale applicazione clinica. Utilizzando una combinazione di piggyBac trasferimento genico mediato e aK562 (antigene artificiale presentazione) cellule feeder, un rendimento iniziale di circa 2 x 10 6 cellule stabilmente trasfettate T può essere espansa 4-5 registri a oltre 10 10 cellule trasdotte in T 4 a 5 settimane e 10 12 in 6-7 7 settimane. Analisi dei siti di integrazione piggyBac a cellule T non ha mostrato alcuna propensione proto-oncogeni, tuttavia, ha mostrato una predilezione per l'integrazione in geni altamente espressi nelle cellule T attivate quando si utilizza la tecnologia nucleofection cui sopra 13. PiggyBac rappresenta un metodo promettente per stabile modificazione genetica di cellule T per una varietà di applicazioni.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
SS è sostenuto in parte dal Med HHMI in Grad formazione di sovvenzione attraverso il Programma TBMM. MHW è sostenuto in parte da un premio alla carriera sviluppo dal Department of Veterans Affairs e il generoso sostegno del Dr. Harold e la signora M. Selzman. Questo lavoro è stato supportato anche in parte da linfoma NIH SPORE concessione P50CA126752 e NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
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References
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