Summary
我々は、遺伝的に非ウイルスを用いて導入遺伝子を持つプライマリヒトT細胞を変更する方法を説明します
Abstract
piggyBacトランスポゾンシステムはもともとキャベツルーパー蛾1,2から派生した、自然にアクティブになります。この非ウイルス系は、最も一般的に1はpiggyBacトランスポサーゼ酵素と遺伝子導入活性に必要な逆方向反復要素の間に目的の遺伝子（複数可）を保有するプラスミド、トランスポゾンを発現する2つのプラスミドを利用して、ベースのプラスミドである。PiggyBacを媒介遺伝子転移は通っトランスポザーゼは、目的の標的細胞（S）のゲノムにトランスポゾンセグメントを統合することにより"カット＆ペースト"メカニズムは。PiggyBacは 3-5哺乳類昆虫1,2、多種多様で効率的な遺伝子送達活性を示した、としているプライマリーヒトT細胞を含むヒトの7,8 cells6。最近では、非常に活発piggyBacのトランスポザーゼは、遺伝子導入効率を向上させる9,10生成されました。
ヒトTリンパ球は、臨床intereであるがん11の養子免疫療法のst。注目すべきは、 眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いて、ヒトT細胞のトランスポゾンの修正を含む最初の臨床試験は、12を承認されています。我々は以前に、ヒトT細胞の遺伝子改変のための非ウイルス性の方法論としてpiggyBacの有用性を評価した。我々は、レポーター遺伝子と非免疫原性誘導自殺遺伝子7とヒトT細胞の遺伝子改変で効率的であることがpiggyBac発見。ゲノム組み込み部位の解析では、既知の癌原遺伝子13内又はその付近の統合のための好みの欠如を明らかにした。我々は、腫瘍抗原、HER2に対して向けられたキメラ抗原受容体を運ぶために細胞傷害性Tリンパ球の遺伝子変更するpiggyBac使用され、遺伝子改変T細胞は、同所性マウスモデルにおいて、in vitroおよび in vivo でのHER2陽性腫瘍細胞の死滅標的媒介ことがわかった14。我々はまた、piggyBacを使用していたラパマイシンは15を利用されている癌治療に有用であるはずであるラパマイシンに耐性のヒトT細胞を生成します。
ここで、我々は、遺伝的に一次ヒトT細胞を変更するpiggyBacを使用するための方法を説明します。これは、文化、遺伝子改変し、T細胞の活性化に続いてヒト血液から末梢血単核細胞（PBMC）の単離を含む。このレポートの目的は、T細胞は、フローサイトメトリーによる遺伝子発現の解析と定量化のためのレポーター遺伝子（EGFP）で修飾した。
PiggyBacは、関心のある遺伝子の様々なヒトT細胞を変更するために使用することができます。我々は腫瘍抗原14〜T細胞に指示するpiggyBac使用しましたが、我々はまた、7を必要に応じて遺伝子改変された細胞を排除するために、誘導の安全スイッチを追加するpiggyBac使用しています。 piggyBacの大型貨物の容量も遺伝子導入が可能になりました大ラパマイシン耐性のmTOR分子（15キロバイト）15。したがって、我々は様々な目的のための主要なヒトT細胞の安定した遺伝子改変のための非ウイルス性の方法論を提示する。
Protocol
0日目
1。ヒト血液由来のPBMCの分離
- Na型ヘパリンバキュテイナチューブに静脈穿刺を用いて新鮮なヒト血液20mlを採取します。
- 1:1（v / v）の割合でミックス血液およびAdvanced RPMI 1640。
- 50ml遠心チューブ（25℃）に20ミリリットルlymphoprep媒体を追加します。 lymphoprepの上に血のRPMI 1640ミックスのゆっくり層25〜30ミリリットル。
- ブレーキなしで40分間、400×gで遠心分離します。
- 1X PBSを10ml（25℃）に使い捨てのピペットを用いてはっきりとファジー層の両方を収集し、1×PBSで50mlにボリュームを上げます。
- 10分間、450×gで遠心分離します。
- 完全に上清を吸引除去し、高度なRPMI 1640 20mlを加える。
- 5分間400×gで遠心分離します。
- 上清を吸引します。 5 ng / mlでのrhIL-15を補充した完全なT細胞の培地10mlを加え、37℃に温め
- 24ウェルの組織培養コート内の細胞とプレートの数を数える5 ng / mlでのrhIL-15周囲のウェルに滅菌水を追加で補充完了し、T細胞培地で2×10 6細胞/ウェルでEDプレート。 37℃加湿インキュベーターで一晩インキュベート℃、5％CO 2で 。
1日目
2。 T細胞を刺激するための抗CD28および抗CD3抗体でコーティングプレート
- 1μg/ mlの各濃度の滅菌水に抗CD28および抗CD3抗体を希釈します。
- 非コート組織培養24ウェルプレートの5とマークウェルへ500μlの各抗体溶液を追加します。
- 井戸の残りの部分に滅菌水を追加します。 4℃の冷蔵庫でシュリンクラップと場所でプレートを包みます。
3。未刺激T細胞のヌクレオ
- のrhIL-15の5 ng / mlで37℃のとサプリメントでPrewarm T細胞メディア。ヌクレオの溶液2.25ミリリットルにヌクレオ補足1 500μLを加えることによって、完全なヌクレオ溶液を調製します。
- Aliquot5μgのトランスポゾン（ZEO-PT-CMV-EGFP）と1.5 mlのマイクロチューブ内のトランスポザーゼ（のpCMV-piggyBac）の各注：それが最適な遺伝子送達のためのトランスポザーゼ及びトランスポゾンDNA量を最適化し、最小限にする必要があるかもしれません細胞毒性。プラスミドは、要求によって著者から入手することができます。
- 50 mlチューブに、24ウェル組織培養プレートから収穫のPBMCs。細胞数をカウントします。フローサイトメトリー中にコントロールとして使用するために2×10 6個の細胞を保存します。
- 400×gで15 mlのチューブと遠心分離機に7から10×10 6個の細胞を、5分間、上澄みと指フリックを吸引し、ペレットを追加します。
- 緩んで細胞ペレットにT細胞の完全なヌクレオ溶液100μlを添加します。
- プラスミドを含むチューブに溶液 - 細胞混合物を追加します。
- クレオキュベットの底に溶液セルプラスミド混合物を追加します。任意の気泡を導入しないように注意してください。
- プロを用いて細胞をNucleofectグラム、U-014（未刺激T細胞、ヒト、 http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ）。
- すぐにキュベットにのrhIL-15で温めておいたメディアの500μlを添加する。 rhIL15で温めておいた培地1.5mlで24ウェルプレートの各ウェルに細胞を移します。
- 37℃加湿インキュベーターで一晩インキュベート℃、5％CO 2で 。
2日目
4。 T細胞の非特異的刺激
- 細胞を回収し、細胞数を決定します。 GFP陽性細胞の頻度を決定するために、フローサイトメトリー用の0.5×10 6個の細胞を脇に置きます。コントロールとして、非トランスフェクトPBMCを使用します。
- 非組織培養コーティングされたプレートからCD3/28抗体溶液を吸引除去し、T細胞のメディアで各ウェルを洗浄してください。
- 完全なCTLのメディアでミリリットルあたり0.5×10 6個の細胞でnucleofected細胞を再懸濁5 ng / mlでのrhIL-15を補充した。 2.0ミリリットルの非組織培養プレートの4ウェル中のnucleofectedの各セルを追加します。よく5 回目に0.5×10 6非nucleofectedセルを追加します。
- 37℃加湿インキュベーターで3日間インキュベート℃、5％CO 2で 。
5日目
- 非コート組織培養プレートから刺激されたT細胞を採取。
- 5 ng / mlのIL-15とT細胞培地で0.7×10 6細胞/ mlで24ウェルコート組織培養プレート中の細胞を数え、replate。
7日目
7。遺伝子発現の分析
- 細胞を回収し、抗ヒトCD8抗体（抗CD3および抗CD4を使用することができます）で染色し、％GFP発現についてフローサイトメトリーで分析する。
8日目（オプション）
8。 T細胞の増殖
- トランスフェクション後8日目に、T細胞は、Tで再播種することができますセルの更なる拡大のために16ウェル当たり0.7×10 6細胞の密度で、IL-15を持つメディア。
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Representative Results
遺伝的にレポーター遺伝子（EGFP）を有するヒトTリンパ球を変更するの手順を示す模式図を図1に示します。これらのプラスミドは、著者からのリクエストも承ります。レポーター遺伝子（EGFP）を遺伝的に改変されたヒトTリンパ球の手順を実演schemticは、 図2のshowinです。それは彼らが、分割展開し、文化に伝播するように取得するために、T細胞を活性化することが必要である。修正されたヒトT細胞は、その後、培養し、1日目及び7日目の遺伝子発現についてフローサイトメトリーを用いて分析した。示され、 図3のドナーからの結果である。細胞は細胞クエスト·ソフトウェアを使用してアロフィコシアニン（APC）コンジュゲート抗CD8、4蛍光信号用のフィルターセットを装備したFACSCaliburによってEGFP（導入遺伝子）およびAPC蛍光について分析を用いて染色した（Becton Dickinson社製）。我々は以前に、遺伝子CD4とCD8陽性T細胞の両方の修正および本明細書中で鬼を観察している実施例7とCD8陽性細胞を戦略。我々は、単一の導入遺伝子の発現により本明細書の分析を行っていますが、piggyBacはまた、17のヒト細胞における多遺伝子（または多重化）遺伝子導入のために使用されてきました。 1日目と7日目の間にeGFPの発現の減少は、おそらくすべてではないトランスフェクトされた細胞は、トランスポゾンのDNAの安定した統合を受けるという事実によるものです。
図1：ヒトT細胞のpiggyBac媒介遺伝子改変のために使用されるプラスミドの模式図。 CMVプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、イントロンは、mRNAの安定化のためのSV40イントロン; piggyBac、トランスポザーゼのcDNA、SV40のPA、ポリアデニル化部位、pUC系、複製起点と、b-ラクタマーゼは、アンピシリン耐性遺伝子; PB3'IR、piggyBac 3 '逆方向反復; PB5' IR、piggyBac。。5 '逆方向反復; ZeoR、ゼオシン耐性遺伝子; R6Kオリ、複製起点、IVS、介在配列、EGFP、蛍光レポーター遺伝子注：抗生物質は細菌の選択と成長のために使用されたが、T細胞培養で使用されていなかったが、ここをクリックしてください拡大図を表示する 。
（2）回路図piggyBacトランスポゾンシステムを用いた初代ヒトT細胞の変形例を説明する図 。
図3 piggyBacトランスポゾンの体系で変性されたT細胞の安定した導入遺伝子の発現メートル。左のパネル：1日目のeGFP発現。右のパネル：7日目にeGFPの発現が大きい図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
本明細書に記載の方法は、一次ヒトTリンパ球の安定した導入遺伝子の改変を可能にします。我々は以前に、レポーター遺伝子（4週間以上）、非免疫原性の自殺遺伝子、養子免疫療法のためのキメラ抗原受容体（100日以上）を発現するT細胞を変更するpiggyBacトランスポゾンシステムの使用をテストしたと免疫抑制薬7,13-15に対する耐性をエンジニアに。養子免疫療法と他のアプリケーションのためのT細胞の非ウイルス性の修正は、レトロウイルス形質導入よりもはるかに少ない高価なため、より広く利用されるべきである。新しい機能亢進piggyBac要素の使用は、安定した導入遺伝子改変ヒトT細胞9の製造の実現可能性を増やす必要があります。本明細書に記載されていませんが、人は潜在的な臨床応用に向けて安定的にトランスフェクトされたT細胞の必要な数値を達成することができます。 piggyBac媒介遺伝子転移とAKの組み合わせを使用して562（人工抗原提示）フィーダー細胞は、約2×10 6安定にトランスフェクトされたT細胞の初期収量が6から7に10 10の上に4〜5週間でT細胞を形質導入すると10〜12の4から5ログが拡張することができ週7。ヒトT細胞におけるpiggyBac組み込み部位の解析は、癌原遺伝子に向かって偏りは認められなかった、しかし、それは13上で概説クレオテクノロジーを使用したときに活性化したT細胞で高度に発現している遺伝子に統合するための偏愛を示した。PiggyBacは、安定のための有望な方法論を表し多種多様なアプリケーションのためのヒトT細胞の遺伝子改変。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
SSはTBMMプログラムを通じて卒業生のトレーニンググラントにHHMIメッドによって部分的にサポートされています。厚生省は、退役軍人省からキャリア開発賞と博士夫妻ハロルド·M·Selzmanの寛大な支援によって部分的にサポートされています。この作品はまた、NIHリンパ腫SPORE助成P50CA126752とNIH R01 DK093660によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
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References
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