Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

Published: November 5, 2012 doi: 10.3791/4235
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,6, 2, 4,5,7, 1,2,4,8
1Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine, 3Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, 4Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 6Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine, 7Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 8Michael E. DeBakey VA Medical Center

Summary

우리는 유전자 비 바이러스를 사용하여 transgene과 기본 인간의 T 세포를 수정하는 방법을 설명

Abstract

piggyBac transposon 시스템은 원래 양배추 자벌레 나방의 1,2에서 파생, 자연적으로 활성화됩니다. 이 비 바이러스 시스템은 가장 일반적으로 하나가 piggyBac transposase 효소 및 유전자 전달 활동에 필요한 역 반복 요소 사이에 관심의 유전자를 (들) 숨겨 플라스미드 transposon을 표현으로 두 plasmids을 활용, 기반 플라스미드입니다. PiggyBac의 mediates 유전자 전송을 통해 transposase 관심의 대상 셀 (들)의 게놈에 transposon 세그먼트를 통합된다 "잘라 내기 및 붙여 넣기"메커니즘이 있습니다. PiggyBac 3-5 포유류의 곤충 1,2의 다양한 효율적인 유전자 전달 활동을 시연하고있다 7,8 차 인간의 T 세포를 포함 cells6 인간. 최근 활동적인 piggyBac의 transposase는 유전자 전달 효율을 향상 9,10 생성되었습니다.

인간 T 림프구는 임상 intere의 역할암 (11)의 입양 immunotherapy에 대한 ST. 참고 중, 잠자는 숲속의 미녀의 transposon 시스템을 사용하여 인간의 T 세포의 transposon 수정을 포함한 첫 번째 임상 실험은 12을 승인했습니다. 우리는 이전에 인간의 T 세포의 유전자 변형에 대한 비 바이러스 성 방법으로 piggyBac의 유틸리티를 평가하고 있습니다. 우리는 리포터 유전자와 비 immunogenic inducible 자살 유전자 7 인간의 T 세포의 유전자 변형에 효율이 piggyBac 발견했다. 게놈 통합 사이트의 분석은 13로 또는 알려진 proto-oncogenes 근처 통합 환경의 부족을 공개했다. 우리는 종양 항원 HER2에 대한 감독 키메라 항원 수용체를 수행하는 유전자 - 수정 세포 독성 T 림프구에 piggyBac 사용하고, 유전자 수정 된 T 세포가 orthotopic 마우스 모델에서 체외 및 생체 내 HER2-양성 종양 세포의 살인을 대상으로 중재 것을 발견 14. 우리는 또한 piggyBac을 사용한rapamycin은 15 활용 암 치료에 도움이 될 것 rapamycin에 강한 인간의 T 세포를 생성 할 수 있습니다.

여기, 우리는 유 전적으로 인간의 기본 T 세포를 수정 piggyBac을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 문화, 유전자 수정, 및 T 세포의 활성화에 이어 인간의 피에서 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연을 포함하고 있습니다. 이 보고서의 목적을 위해, T 세포는 유동 세포 계측법에 의한 유전자 발현의 분석 및 정량화를위한​​ 리포터 유전자 (eGFP)로 수정되었습니다.

PiggyBac는 관심 유전자의 다양한 인간의 T 세포를 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 우리가 종양 항원 14 T 세포를 직접 할 수 piggyBac 사용했지만, 우리는 또한 7 필요한 경우 유전자 변형 세포를 제거하기 위해 inducible 안전 스위치를 추가 할 수 piggyBac 사용했습니다. piggyBac의 대형화물 용량은 유전자 전송을 사용하고 있습니다큰 rapamycin의 방지를 mTOR 분자 (15 KB) 15. 따라서, 우리는 목적으로 다양한 종류의에 대한 일차적 인간의 T 세포의 안정적인 유전자 변형에 대한 비 바이러스 방법론을 제시한다.

Protocol

일 0

1. 인간의 피에서 PBMCs의 절연

  1. 오세영 - 헤파린 vacutainer 튜브에 venipuncture를 사용하여 신선한 인간의 피 20 ML를 수집합니다.
  2. 믹스의 피와 1시 1분의 고급 RPMI 1640 (V / V) 비율입니다.
  3. 50 ML의 원심 분리기 튜브 (25 ° C) 20 ML lymphoprep 매체를 추가 할 수 있습니다. lymphoprep 상단에 혈액 RPMI 1640 믹스 천천히 층 25-30 ML.
  4. 브레이크없이 40 분 400 XG에 원심 분리기.
  5. 1X PBS (25 ° C)의 10 ML에 일회용 피펫을 사용하여 독특하고 퍼지 레이어를 모두 수집하고 1X PBS있는 50 ML에 볼륨을 가져.
  6. 10 분에 450 XG에 원심 분리기.
  7. 완전히 표면에 뜨는을 대기음 및 고급 RPMI 1640의 20 ML를 추가합니다.
  8. 5 분 400 XG에 원심 분리기.
  9. 표면에 뜨는을 대기음. 5 NG / ML rhIL-15과 보충 완전한 T 세포 미디어 10 ML를 추가 37 ° C.에 prewarmed
  10. 24 잘 조직 문화 코트에서 세포와 판의 수를 카운트/ 잘 완전한 T 세포 미디어 2 X 10 6 세포에서 에드 판은 5 NG / ML rhIL-15는 주변 우물에 멸균 물을 추가로 보충. 37 humidified 인큐베이터에서 하루 아침에 길러 ° C, 5 % CO 2.

1 일

2. T 세포를 자극을위한 안티 CD28 및 안티 3 번 CD 항체로 코팅 플레이트

  1. 1 μg / ML 각각의 농도에서 살균 물에 안티 CD28 및 안티 3 번 CD 항체를 희석.
  2. 비 코팅 조직 문화 24 잘 플레이트의 5 표시 우물 500 μl 각 항체 솔루션을 추가합니다.
  3. 우물의 휴식 멸균 물을 추가합니다. 4 ° C 냉장고에서 수축 랩과 장소에 판을 넣어.

3. Unstimulated T 세포의 Nucleofection

  1. 37 번 Prewarm T 세포 미디어 ° C와 rhIL-15 5 NG / ML로 보충. Nucleofector 솔루션의 2.25 ML에 Nucleofector 보충 한 500 μl를 추가하여 완벽한 nucleofector 솔루션을 준비합니다.
  2. liquot 5 μg transposon (Zeo-PT-CMV-eGFP)와 1.5 ML의 microfuge 관 transposase (pCMV-piggyBac)의 각. 참고 :이 최적의 유전자 전달을위한 transposase와 transposon의 DNA 금액을 최적화하고 최소화하기 위해 필요할 수 있습니다 세포 독성. plasmids 요청에 의해 저자에서 얻을 수 있습니다.
  3. 50 ML 튜브에 24 잘 조직 배양 플레이트에서 수확 PBMCs. 셀의 개수를 계산합니다. 유동 세포 계측법 동안 제어 등의 사용이 X 10 6 세포를 저장합니다.
  4. 400 XG, 5 분에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 7-10 X 10 6 세포를 추가 표면에 뜨는 및 손가락 제스처 펠릿 대기음.
  5. 느슨하게 세포 펠렛에 대한 T 세포 완벽한 nucleofection 솔루션 100 μl를 추가합니다.
  6. plasmids를 포함하는 관에 솔루션 세포 혼합물을 추가합니다.
  7. nucleofection 큐벳의 맨 아래에 솔루션 휴대 플라스미드 혼합물을 추가합니다. 모든 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.
  8. 프로를 사용하여 셀을 Nucleofectg U-014 (Unstimulated T 세포, 인간, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
  9. 즉시 큐벳에 rhIL-15 prewarmed 미디어 500 μl를 추가합니다. rhIL15과 prewarmed 미디어의 1.5 ML과 24 잘 접시의 우물에 세포를 전송합니다.
  10. 37 humidified 인큐베이터에서 하루 아침에 길러 ° C, 5 % CO 2.

2 일

4. T 세포의 특이 현상 자극

  1. 수확 셀 및 셀 번호를 결정합니다. GFP 양성 세포의 빈도를 결정하는 유동 세포 계측법 0.5 X 10 6 세포를 따로 설정합니다. 컨트롤로 비 transfected PBMCs을 사용합니다.
  2. 비 조직 배양 코팅 플레이트에서 CD3/28 항체 솔루션을 기음과 T 세포 미디어와 각 잘 씻어.
  3. 전체 CTL 미디어 ML 당 0.5 X 10 6 세포에서 nucleofected 세포를 Resuspend5 NG / ML rhIL-15 보충. 2.0 ML 이외의 조직 문화 판의 4 우물에 nucleofected 셀의 각을 추가합니다. 잘 5 일에 0.5 X 10 6 비 nucleofected 셀을 추가합니다.
  4. 37 humidified 인큐베이터에서 3 일 동안 배양 ° C, 5 % CO 2.

5 일

  1. 비 코팅 조직 문화 판에서 자극 T 세포를 수확.
  2. 0.7에서 24도 코팅 조직 배양 판에있는 셀을 카운트하고 replate X 10 5 NG / ML IL-15 6 세포 / T 세포 미디어 ML.주세요

7 일

7. 유전자 발현 분석

  1. 수확 세포와 반 인간 CD8 항체와 얼룩은 (또한 반에는 3 번 CD 및 안티 CD4를 사용할 수)와 %의 GFP 발현을위한 유동 세포 계측법을 분석합니다.

일 8 (선택 사항)

8. T 세포의 확장

  1. transfection 후 일 8 일, T 세포는 T에 replated 할 수 있습니다더 확장 16도 당 0.7 X 10 6 세포 밀도에 IL-15과 셀은 미디어.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

유전자 리포터 유전자 (eGFP)와 인간의 T 림프구를 수정의 단계를 보여주는 도식은 그림 1에 표시됩니다. 이러한 plasmids은 작성자의 요청시 이용 가능합니다. 리포터 유전자 (eGFP)와 유전자 변형 인간 T 림프구의 단계를 보여주는 schemtic은도 2의 바바리 수 있습니다. 그것은 그들에게, 분할 확장하고 문화에 전파하게하기 위해 T 세포를 활성화 할 필요가 있습니다. 수정 인간의 T 세포는 이후 배양 및 일 1 일 7 일 유전자 발현에 대한 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 표시는 그림 3에서 한 기증자의 결과입니다. 셀 셀 퀘스트 소프트웨어를 사용하여 allophycocyanin (APC) 복합 항 CD8, 4 형광 신호에 대한 필터 세트가 마련되어 FACSCalibur에 의해 eGFP (transgene)와 APC 형광에 대한 분석 물들되었습니다 (Becton 디킨슨). 우리는 이전에 유전자 CD4와 CD8 양성 T 세포 모두의 수정 및 본 악마를 관찰 한예를 들어 7로 CD8 양성 세포를 strate. 우리가 하나의 transgene 표현 여기를 분석했지만, piggyBac는 또한 17 개의 인간의 세포에서 다중 유전자 (또는 멀티플렉싱) 유전자 전달에 사용되었습니다. 일 1 일 7 사이의 eGFP 표현의 감소 가능성이 모든 transfected 세포가 transposon의 DNA의 안정적인 통합을 받아야한다는 사실 때문입니다.

그림 1
그림 1. 인간의 T 세포의 piggyBac 인한 유전자 변형에 사용 plasmids의 도식. CMV, 사이토 메갈로 바이러스 프로모터, 인트론, mRNA 안정화를위한 SV40 인트론, piggyBac, transposase cDNA, SV40 파, polyadenylation 사이트, pUC 복제의 기원, B-lactamase, 암피실린 저항 유전자, PB3'IR, piggyBac 3 '역 반복, PB5' IR, piggyBac.. 5 '역 반복, ZeoR, zeocin 저항 유전자, R6K 오라이 복제 기원, IVS, 개입 순서, eGFP, 형광등 기자 유전자가 참고 : 항생제는 박테리아 선택과 성장을 위해 사용했지만 T 세포 배양에 사용되지 않은이 여기를 클릭하십시오 더 큰 그림을 볼 수 있습니다 .

그림 2
그림 2. piggyBac의 transposon 시스템을 사용하여 기본 인간의 T 세포의 수정을 설명하는 도식.

그림 3
그림 3. T 세포의 안정적인 transgene 표현은 piggyBac transposon syste와 수정m. 왼쪽 패널 : 1 일에 eGFP의 표현. 오른쪽 패널 :. 일 7 eGFP 표현은 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기에 설명 된 방법은 기본 인간 T 림프구의 안정적인 transgene의 수정이 가능합니다. 우리는 이전에 리포터 유전자 (4 개 이상의 주), 비 immunogenic 자살 유전자 입양 immunotherapy에 대한 키메라 항원 수용체를 (100 개 이상의 일), 표현하는 T 세포를 수정하는 piggyBac transposon 시스템의 사용을 테스트 한 그리고 면역 억제 약물 7,13-15에 대한 내성을 처리합니다. 입양 immunotherapy 및 기타 응용 프로그램을위한 T 세포의 비 바이러스 성 수정은 retroviral 전달보다 훨씬 저렴하기 때문에 더 많은 활용해야합니다. 새로운 활동적인 piggyBac 요소의 사용은 인간의 T 세포에게 9 수정 안정적인 transgene의 제조의 가능성이 높아집니다. 여기에 설명되지 않았지만, 하나는 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 안정적 transfected T 세포의 필요한 숫자를 얻을 수 있습니다. piggyBac로 인한 유전자 전송 및 AK의 조합을 사용562 (인공 항원이 제시) 피더 세포, 2 × 10 6 안정적으로 transfected T 세포의 초기 수율은 6-7에 10 10 이상 4~5주에 T 세포를 transduced에 10 12 to 4-5 로그가 확장 될 수있다 주 7. 인간의 T 세포에 piggyBac 통합 사이트 분석 proto-oncogenes에 대한 더 편견을 보여주지 그러나, 13 위의 설명 nucleofection 기술을 사용할 때 활성 T 세포의 높은 표현 유전자에 통합하는 데 대한 취향을 표시 했어요. PiggyBac은 안정을위한 유망 방법론을 나타냅니다 응용 프로그램의 다양한 인간의 T 세포의 유전자 변형.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

SS는 TBMM 프로그램을 통해 그라드 교육 교부금에 HHMI 메드에 의해 부분적으로 지원됩니다. MHW는 재향 군인의 담당 부서에서 경력 개발 상 박사 부부 해롤드 M. Selzman의 관대 한 지원에 의해 부분적으로 지원됩니다. 이 작품은 NIH 림프종 포자 부여 P50CA126752와 NIH R01 DK093660에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lympholyte Cedarlane CL5015
Advanced RPMI 1,640 LifeTechnologies 12633020
Hyclone Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3008803
GlutaMAX-I Supplement LifeTechnologies 35050-061
Human IL-15 Recombinant Protein eBioscience 14-8159
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S
Human T Cell Nucleofector Kit Lonza VPA-1002
CD8-APC Southern Biotech 9536-11
Anti-Human CD3 eBioscience 16-0037-81
Anti-Human CD28 BD Pharmingen 555725
24 Well Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 353047
24 Well Non Tissue Culture Treated Plate BD Falcon 351147
Complete T cell media composition
1x Advanced RPMI 1,640
5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum
2 mM GlutamaxIM-I

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
  2. Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
  3. Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
  4. Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
  5. Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
  6. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
  7. Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
  8. Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
  9. Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
  10. Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
  11. Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
  12. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
  13. Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
  14. Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
  15. Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
  16. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
  17. Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).

Tags

면역학 문제 69 분자 생물학 의학 유전학 세포 생물학 바이러스학 인간 T 세포 Transposons, transgene
기본 인간 T 세포 <em>piggyBac</em> Transposon 시스템 변경
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., … More

Saha, S., Nakazawa, Y., Huye, L. E., Doherty, J. E., Galvan, D. L., Rooney, C. M., Wilson, M. H. piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells. J. Vis. Exp. (69), e4235, doi:10.3791/4235 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter