Summary
Vi beskriver en metode for å genetisk modifisere primære humane T-celler med et transgen hjelp av ikke-virale
Abstract
Den piggyBac transposon systemet er naturlig aktiv, opprinnelig stammer fra kål Looper møll 1,2. Dette ikke-viral systemet er plasmid basert, oftest benytte to plasmider med en uttrykker piggyBac transposase enzym og en transposon plasmid harboring genet (er) av interesse mellom inverterte gjenta elementer som er nødvendig for genoverføring aktivitet. PiggyBac medierer genoverføring gjennom en "cut and paste" mekanisme hvorved transposase integrerer transposon segment inn i genomet av målcellen (r) av interesse. PiggyBac har demonstrert effektiv genet levering aktivitet i et bredt utvalg av insekt 1,2, pattedyr 3-5, og humant cells6 inkludert primære humane T-celler 7,8. Nylig ble en hyperaktiv piggyBac transposase generert forbedre genoverføring effektivitet 9,10.
Humane T-lymfocytter er av klinisk interest for adoptiv immunterapi av kreft 11. Av notatet, har den første kliniske studie med transposon modifisering av humane T-celler ved hjelp av Sleeping beauty transposon system er godkjent 12. Vi har tidligere evaluert nytten av piggyBac som en ikke-viral metodikk for genetisk modifisering av humane T-celler. Vi fant piggyBac å være effektiv i genetisk modifisering av humane T-celler med en reporter-genet og et ikke-immunogent induserbart selvmord genet 7. Analyse av genomisk integrering områder avdekket mangel på preferanse for integrering i eller i nærheten av kjente proto-onkogener 13. Vi brukte piggyBac til gen-endre cytotoksiske T-lymfocytter til å bære et kimært antigen reseptoren rettet mot tumor antigen HER2, og funnet ut at gen-modifisert T-celler mediert målrettet dreping av HER2-positive tumorceller in vitro og in vivo i en orthotopic musemodell 14. Vi har også brukt piggyBacå generere humane T-celler som er resistente mot rapamycin, som bør være nyttige i kreft terapier hvor rapamycin er utnyttet 15.
Heri, beskriver vi en fremgangsmåte for å bruke piggyBac å genmodifisere primære humane T-celler. Dette inkluderer isolering av perifert blod mononukleære celler (PBMC) fra humant blod etterfulgt av kultur, genmodifikasjon, og aktivering av T-celler. For hensikten med denne rapporten, ble T-celler modifisert med et rapportørgen (eGFP) for analyse og kvantifisering av genekspresjon ved strømningscytometri.
PiggyBac kan brukes til å modifisere humane T-celler med en rekke gener av interesse. Selv om vi har benyttet piggyBac å dirigere T-celler til tumorantigener 14, har vi også brukt piggyBac å legge et induserbart sikkerhetsbryter for å eliminere genmodifiserte celler hvis nødvendig 7. Den store lastekapasitet piggyBac har også gjort det mulig genoverføring aven stor rapamycin motstandsdyktig mTOR molekyl (15 kb) 15. Derfor presenterer vi en ikke-viral metodikk for stabil gen-modifisering av primære humane T-celler for en lang rekke formål.
Protocol
Dag 0
1. Isolasjon av PBMC fra humant blod
- Samle 20 ml friskt humant blod ved hjelp venepunksjon inn Na-heparin Vacutainer-rør.
- Mix blod og Advanced RPMI 1640 i 1:1 (v / v) forhold.
- Tilsett 20 ml Lymphoprep medium til en 50 ml sentrifugerør (25 ° C). Langsomt sjikt 25-30 ml blod-RPMI 1640 blanding oppå Lymphoprep.
- Sentrifuger ved 400 xg i 40 min uten brems.
- Samle både tydelig og krusete lag ved hjelp av en engangspipette inn 10 ml 1x PBS (25 ° C) og bringe volumet opp til 50 ml med 1x PBS.
- Sentrifuger ved 450 xg i 10 min.
- Aspirer supernatanten helt og legge til 20 ml Advanced RPMI 1640.
- Sentrifuger ved 400 xg i 5 minutter.
- Aspirer supernatanten. Tilsett 10 ml av komplette T celle medier supplert med 5 ng / ml rhIL-15 forvarmet ved 37 ° C.
- Tell antall celler og plate i en 24 godt vevskultur beleggeed plate på 2 x 10 6 celler / brønn i komplett T celle medier supplert med 5 ng / ml rhIL-15 Legg sterilt vann til omkringliggende brønner. Inkuber over natten i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 1
2. Belegg Plater med anti-CD28 og anti-CD3 antistoff for å stimulere T-celler
- Fortynn anti-CD28 og anti-CD3-antistoffer i sterilt vann ved en konsentrasjon på 1 ug / ml hver.
- Tilsett 500 pl hver antistoff løsning 5 merket brønner av en ikke-belagt vevskultur 24 brønns plate.
- Legg sterilt vann til resten av brønnene. Pakk platen i krympeplast og plasser i en 4 ° C kjøleskap.
3. Nucleofection av unstimulated T celler
- Prewarm T celle medier ved 37 ° C og supplere med 5 ng / ml av rhIL-15. Forbered komplett nucleofector løsning ved å tilsette 500 ul Nucleofector Supplement 1 til 2,25 ml Nucleofector løsning.
- Aliquot 5 ug hver av transposon (Zeo-pt-CMV-eGFP) og transposase (pCMV-piggyBac) i et 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Merk: Det kan være nødvendig for å optimalisere transposase og transposon DNA mengde for optimal genet levering og minimere cellulær toksisitet. Plasmidene kan fås fra forfatterne ved forespørsel.
- Høste PBMC fra 24 godt vevskulturplaten til en 50 ml rør. Telle antall celler. Spare 2 x 10 6 celler for bruk som kontroll under strømningscytometri.
- Legg 7-10 x 10 6 celler til et 15 ml rør og sentrifuger ved 400 xg, 5 min, aspirer supernatant og finger-flick pelleten.
- Legg 100fil av T-celle komplett nucleofection løsning løsnet cellepellet.
- Legg løsningen-celleblanding til røret som inneholder plasmider.
- Legg løsningen-celle-plasmid blanding til bunnen av nucleofection kyvetten. Vær forsiktig så du ikke å innføre noen bobler.
- Nucleofect cellene ved hjelp program U-014 (unstimulated T-celler, humane, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Umiddelbart tilsett 500 pl av forvarmet medier med rhIL-15 til kyvetten. Overfør cellene til en brønn av en 24 brønns plate med 1,5 ml forvarmet medier med rhIL15.
- Inkuber over natten i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 2
4. Uspesifikke Stimulering av T-celler
- Høste celler og bestemmer celle tall. Avsatt 0,5 x 10 6 celler for strømningscytometri for å bestemme frekvensen av GFP-positive celler. Bruk ikke-transfekterte PBMC som kontroller.
- Aspirer CD3/28 antistoff løsningen fra ikke vevskultur belagt plate og skyll hver brønn med T-celle-medier.
- Resuspender nucleofected cellene på 0,5 x 10 6 celler pr ml i komplette CTL mediasupplert med 5 ng / ml rhIL-15. Legg 2,0 ml hver av de nucleofected cellene i 4 brønner av ikke vevskulturplaten. Legg 0.5 x 10 6 ikke nucleofected celler til 5 th godt.
- Inkuber i 3 dager i en fuktet inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2.
Dag 5
- Høste de stimulerte T-celler fra den ikke-belagte vevskulturplaten.
- Telle og replate cellene i en 24 godt belagt vevskulturplaten ved 0,7 x 10 6 celler / ml i T-celle-media med 5 ng / ml IL-15.
Dag 7
7. Analyse av genuttrykk
- Høste celler og flekken med anti-human CD8 antistoff (kan også bruke anti-CD3 og anti-CD4) og analysere med flowcytometri for% GFP uttrykk.
Dag 8 (valgfritt)
8. Utvidelse av T-celler
- På dag 8 etter transfeksjon, kan T-cellene kan replated i T-Celle medier med IL-15 med en tetthet på 0,7 x 10 6 celler per brønn for videre ekspansjon 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk demonstrerer fremgangsmåten i genetisk modifisere humane T-lymfocytter med et rapportørgen (eGFP) er vist i Figur 1. Disse plasmider kan fås ved henvendelse til forfatterne. En schemtic demonstrerer fremgangsmåten i genetisk modifiserte humane T-lymfocytter med et rapportørgen (eGFP) er showin i figur 2.. Det er nødvendig å aktivere T-celler for å få dem til å dele, utvide og forplante i kultur. Modifiserte humane T-celler ble deretter dyrket og analysert ved hjelp av strømningscytometri for genekspresjon på dag 1 og dag 7.. Vist er resultater fra en giver i figur 3.. Celler ble farget med allophycocyanin (APC)-konjugert anti-CD8, analysert for eGFP (transgenet) og APC fluorescensen av en FACSCalibur utstyrt med filter satt for 4 fluorescence signaler ved hjelp Cell Quest Software (Becton Dickinson). Vi har tidligere observert genmodifikasjon av både CD4 og CD8-positive T-celler og heri demondemonstrere CD8-positive celler som eksempel 7. Selv om vi analysert for enkelt transgene uttrykk heri har piggyBac også blitt brukt for multi-genet (eller multiplekses) genoverføring i humane celler 17. Nedgangen i eGFP uttrykk mellom dag 1 og dag 7 er sannsynlig på grunn av det faktum at ikke alle transfektert celler gjennomgå stabil integrering av transposon DNA.
Figur 1. Skjematisk av plasmider som brukes for piggyBac mediert genmodifikasjon av humane T-celler. CMV, cytomegalovirus promoter, intron, SV40 intron for mRNA stabilisering, piggyBac, transposase cDNA, SV40 pA, polyadenylerings nettstedet; pUC, replikasjonsorigo, b-laktamase, ampicillinresistens genet; PB3'IR, piggyBac 3 'invertert gjenta; PB5' IR, piggyBac.. 5 'invertert gjenta; ZeoR, zeocin motstand genet; R6K Ori, replikasjonsorigo, IVS, intervenere sekvens, eGFP, fluorescent reporter genet Merk: antibiotika ble brukt for bakteriell utvalg og vekst, men ble ikke brukt i T cellekulturer Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Skjematisk beskriver modifikasjon av primære humane T-celler ved hjelp av piggyBac transposon systemet.
Figur 3. Stabil transgene uttrykk i T-celler endret med piggyBac transposon system. Venstre paneler: eGFP uttrykk på dag 1. Høyre panel:. EGFP uttrykk på dag 7 Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden beskrevet heri muliggjør stabil transgenet modifisering av primære humane T-lymfocytter. Vi har tidligere testet bruken av piggyBac transposon systemet å modifisere T-celler til å uttrykke et rapportørgen (i mer enn 4 uker), en ikke-immunogent selvmord gen, et chimerisk antigen reseptor for adoptiv immunterapi (i mer enn 100 dager), og til ingeniør motstand mot immunsuppressive medisiner 7,13-15. Ikke-virale modifikasjon av T-celler for adoptiv immunterapi og andre programmer bør være mye mindre kostbart og derfor mer allment brukt enn retroviral transduksjon. Bruken av nye hyperaktive piggyBac elementer bør øke mulighetene for produksjon av stabil transgenet endret humane T-celler 9. Selv om ikke beskrevet her, kan en oppnå nødvendige antall stabilt transfekterte T celler for potensielle kliniske anvendelse. Ved hjelp av en kombinasjon av piggyBac-mediert genoverføring og AK562 (kunstig antigenpresenterende) mater celler, en innledende utbytte av ca 2 x 10 6 stabilt transfektert T-celler kan bli utvidet med 4-5 loggene til over 10 10 transduced T-cellene i 4-5 uker og til 10 12 i 6-7 uker 7. Analyse av piggyBac integrering områder i humane T-celler viste ingen bias mot proto-onkogener, men gjorde det vise en forkjærlighet for å integrere i svært uttrykte gener i aktiverte T-celler ved bruk av nucleofection teknologi skissert over 13. PiggyBac representerer en lovende metode for stabil genetisk modifisering av humane T-celler for en rekke bruksområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
SS støttes delvis av HHMI Med i Grad Training Grant gjennom TBMM Program. MHW støttes delvis av en karriereutvikling pris fra Department of Veterans Affairs og sjenerøs støtte fra Dr. og Mrs. Harold M. Selzman. Dette arbeidet ble også støttet delvis av NIH lymfom SPORE tilskudd P50CA126752 og NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
