Summary
Descreve-se um método para modificar geneticamente células T primárias humanas com um transgene, utilizando o não-viral
Abstract
O piggyBac sistema transposon é naturalmente ativo, originalmente derivado da 1,2 repolho traça looper. Este sistema não-viral é o plasmídeo com base, mais comumente utilizando dois plasmídeos com uma expressão da enzima transposase piggyBac e um transposon plasmídeo que alberga o gene (s) de interesse entre os elementos de repetição invertidos, que são necessários para a actividade de transferência de genes. PiggyBac medeia a transferência de genes através um "corta e cola" o mecanismo através do qual se integra o segmento transposase do transposão no genoma da célula alvo (s) de interesse. piggyBac demonstrou actividade a entrega eficiente de genes em uma ampla variedade de 1,2 insectos, mamíferos 3-5, e humana cells6 incluindo células T primárias humanos 7,8. Recentemente, uma transposase piggyBac hiperactivo foi gerada a melhoria da eficiência de transferência de genes 9,10.
Os linfócitos T humanos são de intere clínicoª para a imunoterapia adoptiva de câncer 11. De nota, o primeiro ensaio clínico envolvendo transposon modificação de células T humanas utilizando o sistema de transposon Sleeping beauty foi aprovado 12. Temos anteriormente avaliaram a utilidade de piggyBac como metodologia não virais para a modificação genética de células T humanas. Encontrámos piggyBac ser eficientes na modificação genética de células T humanas com um gene repórter e um não-imunogénico gene suicida induzível 7. Análise de locais de integração genómicos revelou uma falta de preferência para integração em ou perto de proto-oncogenes conhecidos 13. Usamos a piggyBac gene-modificam linfócitos T citotóxicos para transportar um receptor do antigénio quimérico dirigido contra o antigénio de tumor HER2, e descobriram que as células T modificadas gene-alvo mediada por morte de HER2-positivos de células tumorais in vitro e in vivo num modelo de rato ortotópico 14. Temos também utilizado piggyBacpara gerar células T humanas resistentes a rapamicina, que devem ser úteis em terapias de cancro em que a rapamicina é utilizada 15.
Relata-se um método para utilizar piggyBac para modificar geneticamente células T primárias humanas. Isto inclui o isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) a partir de sangue humano, seguido por cultura, a modificação do gene, e a activação das células T. Para efeitos do presente relatório, as células T foram modificados com um gene repórter (eGFP), para análise e quantificação da expressão de genes através de citometria de fluxo.
PiggyBac pode ser usado para modificar células T humanas com uma variedade de genes de interesse. Apesar de termos usados piggyBac para dirigir as células T a antigénios de tumor 14, também foram utilizados piggyBac para adicionar um interruptor de segurança induzível de modo a eliminar as células de genes modificados, se necessário 7. A capacidade de carga de grande piggyBac também permitiu a transferência de genes deuma grande molécula de rapamicina mTOR resistente (15 kb) 15. Por conseguinte, apresenta-se uma metodologia não-viral para estável gene modificação de células T primárias humanas para uma grande variedade de finalidades.
Protocol
Dia 0
1. Isolamento de PBMCs a partir de Sangue Humano
- Recolher 20 ml de sangue humano fresco, utilizando a punção venosa em tubos Vacutainer Na-heparina.
- Mix de sangue e Avançado RPMI 1640 em 01:01 (v / v) a relação.
- Adicionam-se 20 ml de meio de Lymphoprep num tubo de centrifugação de 50 ml (25 ° C). Lentamente camada 25-30 ml de RPMI-1640 de sangue mistura no topo da Lymphoprep.
- Centrifugar a 400 xg durante 40 min sem freios.
- Recolher as duas camadas distintas e difusa utilizando uma pipeta descartável, em 10 ml de PBS 1x (25 ° C) e perfazer o volume até 50 ml com PBS 1x.
- Centrifugar a 450 xg durante 10 min.
- Aspirar o sobrenadante completamente e adicione 20 ml de RPMI 1640 Avançado.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante. Adicionar 10 mL de meio de células T completo suplementado com 5 ng / ml de rhIL-15 pré-aquecido a 37 ° C.
- Contar o número de células e a placa de cultura de uma camada de tecido de 24 poçosed placa a 2 x 10 6 células / cavidade em meios completos de células T suplementado com 5 ng / ml de rhIL-15 Adiciona-se água estéril para poços adjacentes. Incubar durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% CO 2.
Dia 1
2. Placas de revestimento com anticorpo anti-CD28 e anti-CD3 para estimular as células T
- Diluir os anticorpos anti-CD28 e anti-CD3 em água estéril a uma concentração de 1 ug / ml cada um.
- Adicionar 500 ul de solução de anticorpo a cada 5 poços marcados de uma cultura de tecido não revestido 24 placa bem.
- Adicionar água estéril para descansar dos poços. Enrole a placa no envoltório do psiquiatra e coloque na geladeira a 4 ° C.
3. Nucleofection de não estimuladas Células T
- Pré-aquecer media de células T a 37 ° C e com suplemento de 5 ng / ml de rhIL-15. Preparar a solução de Nucleofector completa por adição de 500 ul de suplemento Nucleofector 1-2,25 ml de solução de Nucleofector.
- Aug liquot 5 cada um dos transposões (Zeo-pT-CMV-eGFP) e transposase (pCMV-piggyBac) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Nota:. pode ser necessário optimizar a transposase e transposon quantidade de ADN para entrega do gene óptima e para minimizar toxicidade celular. Os plasmídeos podem ser obtidos a partir dos autores, a pedido.
- PBMCs de colheita a partir da placa de cultura de tecido 24 bem para um tubo de 50 ml. Contar o número de células. Salvar 2 x 10 6 células para utilização como controlo durante a citometria de fluxo.
- Adicionar 7-10 x 10 6 células para um tubo de 15 ml e centrifugar a 400 xg, 5 min, o sobrenadante aspirado e dedo-flick o sedimento.
- Adicionar 100 ul de solução de T nucleofection célula completa para afrouxado pellet celular.
- Adicionar a mistura de solução de células para o tubo contendo os plasmídeos.
- Adicionar a mistura de solução de células-plasmídeo para a parte inferior da tina nucleofection. Tenha cuidado para não introduzir quaisquer bolhas.
- Nucleofect as células utilizando program U-014 (células não estimuladas, T humanos, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Imediatamente adicionar 500 ul de meio pré-aquecido com rhIL-15 para a cuvete. Transferir as células para um poço de uma placa de 24 poços com 1,5 ml de meio pré-aquecido com rhIL15.
- Incubar durante a noite numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% CO 2.
Dia 2
4. Estimulação não específica das células T
- Colheita de células e determinar o número de células. Separe 0,5 x 10 6 células por citometria de fluxo para determinar a frequência de células positivas para GFP-. Use as CMSPs não transfectadas como controlo.
- Aspirar a solução de anticorpo a partir do CD3/28 placa de cultura de tecido não revestido e lave cada cavidade com meio de células T.
- Ressuspender as células em nucleofected 0,5 x 10 6 células por ml em meio de CTL completassuplementado com 5 ng / ml de rhIL-15. Adicionar 2,0 ml de cada uma das células nucleofected em quatro cavidades da placa de cultura de tecido não. Adicionar 0,5 x 10 6 células não nucleofected para o dia 5 de bem.
- Incubar durante 3 dias numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% CO 2.
Dia 5
- Colheita das células T estimuladas a partir da placa de cultura de tecido não revestido.
- Contagem e replate as células numa placa de cultura de 24 poços revestidos com tecido menos 0,7 x 10 6 células / ml em meio de células T com 5 ng / ml de IL-15.
Dia 7
7. Análise da Expressão do Gene
- Células de colheita e coram com anti-anticorpo humano CD8 (poderia também usar anti-CD3 e anti-CD4) e análise por citometria de fluxo para a expressão de GFP%.
Dia 8 (Opcional)
8. Expansão de células T
- No dia 8 após a transfecção, as células T podem ser novamente plaqueadas em T-Cell media com IL-15 a uma densidade de 0,7 x 10 6 células por poço de uma nova expansão 16.
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Representative Results
Um diagrama esquemático mostrando as etapas na modificação genética de linfócitos T humanos com um gene repórter (eGFP) é mostrado na Figura 1. Estes plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação dos autores. A schemtic demonstrando as etapas geneticamente modificados linfócitos T humanos com um gene repórter (eGFP) é showin na Figura 2. É necessário para activar as células T, a fim de levá-los a dividir, expandir e propagar em cultura. Modificados células T humanas foram então cultivados e analisados utilizando citometria de fluxo para a expressão do gene no Dia 1 e Dia 7. São mostrados os resultados de um doador na Figura 3. As células foram coradas com aloficocianina (APC) conjugada com anti-CD8, analisadas para eGFP (o transgene) e fluorescência de APC por um FACSCalibur equipado com o conjunto de filtro para 4 sinais de fluorescência utilizando software da Quest celular (Becton Dickinson). Observamos anteriormente modificação do gene de CD4 e CD8 das células T positivas e demon aquitrar células CD8 positivas como exemplo 7. Apesar de termos aqui analisadas para a expressão do transgene único, piggyBac também tem sido usada para a transferência de genes de multi-gene (ou multiplexados) em células humanas 17. A diminuição da expressão eGFP entre o dia 1 e no dia 7 é provavelmente devida ao facto de que nem todas as células transfectadas sofrem integração estável de ADN transposon.
Figura 1. Esquemática dos plasmídeos utilizados para a modificação de genes mediada piggyBac de células T humanas. CMV, promotor de citomegalovirus; intron, SV40 intron para a estabilização do mRNA; piggyBac, transposase cDNA; pA de SV40, o local de poliadenilação; pUC, origem de replicação; b-lactamase, gene de resistência à ampicilina; PB3'IR, 'repetição invertida; PB5' piggyBac 3 IR, piggyBac.. Repetição invertida 5 '; ZeoR, gene de resistência à zeocina; R6K ori, origem de replicação; IVS, sequência interveniente; eGFP, gene repórter fluorescente Nota: os antibióticos foram utilizados para a selecção e crescimento bacteriano, mas não foram utilizadas em culturas de células T clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Esquemático descrevendo a modificação de células T primárias humanas utilizando o sistema de transposão piggyBac.
Figura 3. Expressão transgene estável em células T modificado, com o transposon piggyBac system. Painéis da esquerda: eGFP expressão no Dia 1. Painéis da direita:. EGFP expressão no dia 7 Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
O método aqui descrito permite a modificação de transgene estável primárias linfócitos T humanos. Temos anteriormente testado o uso do sistema de transposon piggyBac para modificar as células T para expressar um gene repórter (por mais de 4 semanas), um gene suicida não imunogénica, um receptor do antigénio quimérico para uma imunoterapia adoptiva (por mais de 100 dias), e de projetar a resistência a medicamentos imunossupressores 7,13-15. Non-viral modificação de células T para a imunoterapia adoptiva e outras aplicações deve ser muito menos dispendioso e, por conseguinte, mais amplamente utilizada do que a transdução retroviral. A utilização de novos elementos piggyBac hiperactivas deve aumentar a viabilidade de produção de transgene estável modificado de células humanas T 9. Embora não seja descrito aqui, pode-se obter o número necessário de estavelmente transfectadas células T para a aplicação clínica potencial. Usando uma combinação de piggyBac transferência de genes mediada e aK562 células (antigénio apresentando artificial) de alimentação, um rendimento inicial de cerca de 2 x 10 6 estavelmente transfectadas células T podem ser expandidas por 4-5 logs para mais de 10 10 transduzidas células T em 4 a 5 semanas e a 10 12 em 6-7 semana 7. Análise de sítios de integração piggyBac em células T humanas mostrou nenhuma tendência para os proto-oncogenes, contudo, mostrou uma predilecção para a integração em genes altamente expressos nas células T activadas quando se utiliza a tecnologia descrita acima nucleofection 13. PiggyBac representa uma metodologia promissora para estável a modificação genética das células T humanas para uma ampla variedade de aplicações.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
SS é apoiado em parte pela Med HHMI em Grad Formação Grant através do Programa TBMM. MHW é suportado, em parte, por um prêmio de desenvolvimento de carreira do Departamento de Assuntos de Veteranos eo generoso apoio do Dr. Harold e Sra. M. Selzman. Este trabalho também foi apoiado em parte por linfoma NIH SPORE concessão P50CA126752 e R01 NIH DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
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References
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