Summary
Se describe un método para modificar genéticamente las células T humanas primarias con un transgén mediante el no viral
Abstract
El sistema de transposón piggyBac es naturalmente activo, originalmente derivado del 1,2 falso medidor polilla. Este sistema no viral es el plásmido basada, más comúnmente utilizando dos plásmidos con uno que expresa la enzima transposasa piggyBac y un transposón plásmido que alberga el gen (s) de interés entre los elementos de repetición invertida que se requieren para la actividad de transferencia génica. PiggyBac media la transferencia de genes a través un "cortar y pegar" mecanismo por el que la transposasa integra el segmento de transposón en el genoma de la célula diana (s) de interés. PiggyBac ha demostrado actividad eficiente de suministro de genes en una amplia variedad de 1,2 insectos, mamíferos 3-5, y humano cells6 incluyendo células T humanas primarias 7,8. Recientemente, una transposasa hiperactiva piggyBac fue generado mejorar la eficiencia de transferencia génica 9,10.
Los linfocitos T humanos son de intere clínicast para la inmunoterapia adoptiva del cáncer 11. Es de destacar que el primer ensayo clínico que incluyó la modificación transposón de células T humanas mediante el sistema transposón Sleeping beauty ha aprobado 12. Anteriormente hemos evaluado la utilidad de piggyBac como una metodología no viral para la modificación genética de las células T humanas. Hemos encontrado piggyBac ser eficaz en la modificación genética de las células T humanas con un gen informador y un gen inducible no inmunogénica suicida 7. Análisis de los sitios de integración genómica reveló una falta de preferencia para la integración en o cerca de conocidos proto-oncogenes 13. Se utilizó piggyBac para modificar genes linfocitos T citotóxicos para llevar a un receptor de antígeno quimérico dirigido contra el antígeno tumor HER2, y encontraron que las células modificadas con gen-T mediada asesinato selectivo de HER2-positivas las células tumorales in vitro e in vivo en un modelo de ratón ortotópico 14. También hemos utilizado piggyBacpara generar las células T humanas resistentes a la rapamicina, que debe ser útil en terapias para el cáncer donde la rapamicina se utilizaron 15.
En este documento, se describe un método para utilizar piggyBac para modificar genéticamente células T humanas primarias. Esto incluye el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de sangre humana seguido de cultivo, modificación del gen, y la activación de las células T. Para el propósito de este informe, las células T fueron modificados con un gen reportero (eGFP) para el análisis y la cuantificación de la expresión génica mediante citometría de flujo.
PiggyBac se puede utilizar para modificar las células T humanas con una variedad de genes de interés. Aunque hemos utilizado piggyBac dirigir a las células T a antígenos tumorales 14, también hemos utilizado piggyBac para añadir un interruptor de seguridad inducible con el fin de eliminar las células de genes modificados si es necesario 7. La gran capacidad de carga de piggyBac también ha permitido la transferencia de genes deuna gran resistencia rapamicina moléculas mTOR (15 kb) 15. Por lo tanto, se presenta una metodología no viral para estable de genes modificación de células T humanas primarias para una amplia variedad de propósitos.
Protocol
Día 0
1. Aislamiento de PBMC de la sangre humana
- Recoger 20 ml de sangre humana fresca mediante punción venosa en tubos vacutainer con heparina Na-.
- Mezcla de sangre y avanzada RPMI 1.640 en 1:1 (v / v).
- Añadir 20 ml de medio de Lymphoprep a un tubo de centrífuga de 50 ml (25 ° C). Lentamente capa de 25-30 ml de sangre-RPMI 1.640 mezcla en la parte superior de la Lymphoprep.
- Centrifugar a 400 xg durante 40 min sin frenos.
- Recoge los dos capas distintas y difusa utilizando una pipeta desechable en 10 ml de PBS 1x (25 º C) y llevar el volumen hasta 50 ml con PBS 1x.
- Centrifugar a 450 xg durante 10 min.
- Aspirar el sobrenadante completamente y añadir 20 ml de RPMI avanzada 1.640.
- Centrifugar a 400 xg durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante. Añadir 10 ml de medios completos de células T suplementado con 5 ng / ml de rhIL-15 precalentado a 37 ° C.
- Contar el número de células y la placa 24 en una capa de cultivo de tejidosed placa a 2 x 10 6 células / pocillo en medio de células T completos suplementado con 5 ng / ml rhIL-15 Añadir agua estéril a los pozos circundantes. Incubar durante una noche en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2.
Día 1
2. Las placas de revestimiento con anti-CD28 y anti-CD3 Anticuerpo para la estimulación de las células T
- Diluir los anticuerpos anti-CD28 y anti-CD3 en agua estéril a una concentración de 1 mg / ml cada uno.
- Añadir 500 l solución de cada anticuerpo a 5 pozos marcados de un cultivo de tejido no recubierto de 24 pocillos de la placa.
- Añadir agua estéril para descansar de los pozos. Envuelva la placa de plástico de embalar y colocar en un refrigerador a 4 º C.
3. Nucleofection de células T estimuladas
- Precaliente los medios de células T a 37 ° C y el suplemento con 5 ng / ml de rhIL-15. Preparar la solución de nucleofector completa mediante la adición de 500 l de Nucleofector Suplemento 1 a 2,25 ml de la solución de Nucleofector.
- Laliquot 5 g de cada uno de transposón (Zeo-PT-CMV-EGFP) y transposasa (pCMV-piggyBac) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml Nota:. puede ser necesario para optimizar la transposasa y la cantidad transposón de ADN para la administración de genes y óptima para minimizar toxicidad celular. Los plásmidos se pueden obtener de los autores por solicitud.
- PBMCs Cosecha del 24 placa de cultivo de tejidos en un tubo de 50 ml. Contar el número de células. Guardar 2 x 10 6 células para su uso como control durante la citometría de flujo.
- Añadir 7-10 x 10 6 células a un tubo de 15 ml y se centrifuga a 400 xg, 5 min, aspirar el sobrenadante y el dedo de golpe de la pastilla.
- Añadir 100 l de solución de células T nucleofection completa a células aflojado pellet.
- Añadir la mezcla de la solución de células para el tubo que contiene los plásmidos.
- Añadir la mezcla de solución de células plásmido a la parte inferior de la cubeta nucleofection. Tenga cuidado de no introducir burbujas.
- Nucleofect las células por medio de programo de U-014 (células T estimuladas, humanos http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Añadir inmediatamente 500 l de los medios precalentados con rhIL-15 a la cubeta. Transferir las células a un pocillo de una placa de pocillos 24 con 1,5 ml de medio precalentado con rhIL15.
- Incubar durante una noche en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2.
Día 2
4. La estimulación no específica de células T
- Cosecha de células y determinar el número de células. Ponga a un lado 0,5 x 10 6 células para citometría de flujo para determinar la frecuencia de las buenas prácticas agrarias de células positivas. Usa los PBMCs no transfectadas como controles.
- Aspirar la solución de anticuerpo CD3/28 de la placa de cultivo de tejido recubierto no y enjuagar cada pocillo con medio de células T.
- Resuspender las células en nucleofected 0,5 x 10 6 células por ml en medios completos de CTLsuplementado con 5 ng / ml de rhIL-15. Añadir 2,0 ml de cada una de las células nucleofected en 4 pocillos de la placa de cultivo de tejidos no. Añadir 0,5 x 10 6 células nucleofected no a la 5 ª también.
- Incubar durante 3 días en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2.
Día 5
- Recoger las células T estimuladas de la placa de tejido no recubierto de la cultura.
- Contar y replate las células en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillo recubierto a 0,7 x 10 6 células / ml en medio de células T con 5 ng / ml de IL-15.
Día 7
7. Análisis de la Expresión Génica
- Cosecha células y tinción con anti-CD8 humana de anticuerpos (también podría usar anti-CD3 y anti-CD4) y analizar con citometría de flujo para la expresión de GFP%.
Día 8 (Opcional)
8. La expansión de las células T
- El día 8 después de la transfección, las células T pueden ser resembradas en T-Medios de comunicación celulares con IL-15 a una densidad de 0,7 x 10 6 células por pocillo para una mayor expansión 16.
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Representative Results
Un esquema que demuestra los pasos en la modificación genética de los linfocitos T humanos con un gen reportero (eGFP) se muestra en la figura 1. Estos plásmidos están disponibles a petición de los autores. Un schemtic demostrando los pasos en modificados genéticamente linfocitos T humanos con un gen reportero (eGFP) es showin en la Figura 2. Es necesario activar las células T con el fin de conseguir que se dividen, se expanden, y se propagan en cultivo. Humanas modificadas células T se cultivaron entonces y se analizó mediante citometría de flujo para la expresión génica en el Día 1 y el Día 7. Se muestran los resultados de un donante, en la Figura 3. Las células fueron teñidas con aloficocianina (APC)-conjugado anti-CD8, analizado para eGFP (el transgen) y la fluorescencia de APC por un FACSCalibur equipado con el conjunto de filtro para 4 señales de fluorescencia utilizando el software Cell Quest (Becton Dickinson). Hemos observado previamente la modificación genética de células CD4 y CD8 células T positivas y demonio en este documentotrar las células CD8 positivas como ejemplo 7. Aunque se analizaron para la expresión del transgen en la presente memoria solo, piggyBac también se ha utilizado para la transferencia génica de genes múltiples (o multiplexada) en células humanas 17. La disminución en la expresión eGFP entre 1 día y 7 días es probablemente debido al hecho de que no todas las células transfectadas se someten integración estable de ADN transposón.
Figura 1. Esquema de los plásmidos utilizados para la modificación piggyBac génica mediada de células T humanas. CMV, promotor de citomegalovirus; intrón, SV40 intrón para la estabilización del mRNA; piggyBac, transposasa cDNA; SV40 pA, sitio de poliadenilación; pUC, origen de replicación, b-lactamasa, el gen de resistencia a ampicilina; PB3'IR, 'repetición invertida; PB5' piggyBac 3 IR, piggyBac.. Repetición invertida 5 '; ZeoR, gen de resistencia a zeocina; R6K ori, origen de replicación; IVS, secuencia de intervención; eGFP, gen indicador fluorescente Nota: se usaron antibióticos para la selección bacteriana y el crecimiento, pero no se utiliza en cultivos de células T clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. Esquemático que describe la modificación de células T humanas primarias utilizando el sistema de transposón piggyBac.
Figura 3. Expresión del transgén estable en células T modificadas con el syste transposón piggyBacm. Paneles de la izquierda: expresión eGFP en el Día 1. Paneles de la derecha:. EGFP expresión en el día 7 Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Discussion
El método descrito en la presente memoria permite la modificación transgén estable de linfocitos T primarios humanos. Anteriormente hemos probado el uso del sistema de transposón piggyBac para modificar las células T para expresar un gen reportero (por más de 4 semanas), un gen suicida no inmunogénico, un receptor de antígeno quimérico para la inmunoterapia adoptiva (durante más de 100 días), y para diseñar la resistencia a los medicamentos inmunosupresores 7,13-15. No viral modificación de las células T para inmunoterapia adoptiva y otras aplicaciones debería ser mucho menos costoso y por lo tanto utilizada más ampliamente que la transducción retroviral. El uso de nuevos elementos piggyBac hiperactivos debe aumentar la viabilidad de la fabricación de transgén estable modificada por las células T humanas 9. Aunque no se describe en la presente memoria, se puede conseguir número necesario de células transfectadas establemente T para la aplicación clínica potencial. Usando una combinación de la transferencia de genes mediada por piggyBac y aK562 (antígeno artificial que presenta) células de alimentación, con un rendimiento inicial de aproximadamente 2 x 10 6 células T transfectadas de forma estable se puede ampliar de 4 a 5 logs a más de 10 10 transducidas células T en 4 a 5 semanas y a 10 12 en 6 a 7 semana 7. Análisis de los sitios de integración piggyBac en las células T humanas no mostró sesgo hacia los proto-oncogenes, sin embargo, mostró una predilección para la integración en genes altamente expresados en las células T activadas cuando se utiliza la tecnología nucleofection descrito anteriormente 13. PiggyBac representa una metodología prometedora para estable modificación genética de las células T humanas para una amplia variedad de aplicaciones.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
SS es apoyado en parte por el Mediterráneo HHMI en Grad formación de subvención a través del Programa TBMM. MHW es apoyado en parte por un premio de desarrollo de carrera en el Departamento de Asuntos de Veteranos y el generoso apoyo del Dr. y la Sra. Harold M. Selzman. Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH subvención SPORE linfoma P50CA126752 y NIH R01 DK093660.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
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References
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