Summary
Bu genetik olarak non-viral kullanılarak bir transgen ile primer insan T-hücreleri değiştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır
Abstract
PiggyBac transpozon sistemi başlangıçta lahana lüper güve 1,2 türetilen, doğal olarak aktiftir. Bu non-viral bir sistem en sık bir piggyBac transposase enzim ve gen transfer aktivitesi için gerekli olan ters çevrilmiş tekrar elemanları arasında ilgi gen (ler) i barındıran bir transpozon plazmid ifade ile plazmitler kullanılarak, plazmid bazlı olup. PiggyBac aracılık gen transferi yoluyla transposase ilgi hedef hücre (ler) in genom içine entegre transpozon bölüm vasıtasıyla bir "kesme ve yapıştırma" mekanizması. piggyBac 3-5 memeli böcek 1,2, geniş bir çeşitlilik içinde verimli gen dağıtım aktivite göstermiş, ve etmiştir 7,8 primer insan T-hücreleri de dahil olmak üzere insan cells6. Son zamanlarda, bir hiperaktif piggyBac transposase gen aktarım verimliliği 9,10 geliştirmeye oluşturuldu.
İnsan T lenfositleri klinik Intere taşımaktadırKanser 11 evlatlık immünoterapi için st. Unutmayın ki, Sleeping beauty transpozon sistemi kullanılarak insan T hücrelerinin transpozon değişiklik içeren ilk klinik deneme 12 onaylandı. Biz daha önce insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu için bir non-viral metodoloji olarak piggyBac yararlılığını değerlendirdik. Bir raportör gen ve bir imünojenik olmayan indüklenebilir intihar geni 7 ile insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu olarak etkin olduğu piggyBac bulundu. Genomik entegrasyon siteleri Analizi 13 içine veya bilinen proto-onkogenler yakın entegrasyon için tercih eksikliği saptandı. Bu tümör antijen HER2 karşı yöneltilmiş bir kimerik antijen reseptörü taşımak için gen değiştirme sitotoksik T lenfositleri üzerinde piggyBac kullanılır ve gen ile modifiye edilmiş T hücreleri ortotopik bir fare modelinde in vitro ve in vivo HER2-pozitif tümör hücre öldürme aracılı hedef olduğunu buldu 14. Ayrıca piggyBac kullanılmıştırrapamisinin 15 kullanılmaktadır kanser tedavilerinde yararlı olacaktır rapamisin karşı dirençli insan T-hücreleri, elde edilmektedir.
Burada, genetik olarak primer insan T-hücreleri değiştirmek için piggyBac kullanılması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu kültür, gen modifikasyonu, ve T hücrelerinin aktivasyonunu takiben insan kanı alınan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu içerir. Bu rapor amacı için, T-hücreleri akış sitometrisi ile gen ekspresyonu analizi ve ölçümü için bir raportör gen (eGFP) ile modifiye edildi.
PiggyBac ilgi genlerinin çeşitli insan T-hücreleri değiştirmek için de kullanılabilir. , Tümör antijenleri 14 ile T hücreleri yönlendirmek için piggyBac kullanılmış olmasına rağmen, aynı zamanda, gerekirse 7 geninin değiştirilmiş hücreleri ortadan kaldırmak için bir indüklenebilir emniyet şalteri eklemek için piggyBac kullanılmıştır. PiggyBac arasında büyük kargo kapasitesi de gen transferi sağladıBüyük bir rapamisin dirençli mTOR molekülü (15 kb) 15. Bu nedenle, bu amaç için çok çeşitli primer insan T-hücrelerinin kararlı gen değiştirme için bir non-viral bir yöntem sunulmaktadır.
Protocol
Gün 0
1. Insan kanından izole edilmesi PBMC'ler
- Na-heparin Vacutainer tüpler içine Damara kullanarak taze insan kanı 20 ml toplayın.
- Karışım kan ve 1:1 İleri RPMI 1640 (v / v) oranı kullanılmıştır.
- 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne (25 ° C) 20 ml Lymphoprep orta ekleyin. Lymphoprep üstüne kan RPMI 1.640 karışımı yavaşça tabakası 25-30 ml.
- Frensiz 40 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin.
- 1x PBS (25 ° C) 10 ml içine bir pipet kullanarak farklı ve bulanık katmanlar hem toplayın ve 1x PBS ile 50 ml hacim getirmek.
- 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüjleyin.
- Tamamen süpernatant aspire ve Gelişmiş RPMI 1.640 20 ml ekleyin.
- 5 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin.
- Süpernatant aspire. 5 ng / ml rhIL-15 ile desteklenmiş tam bir T-hücresi ortamı 10 ml 37 ° C sıcaklıkta önceden ısıtılmış
- 24 çukurlu bir doku kültür kat hücreleri ve plaka sayısını/ iyi tam T-hücresi medyada 2 x 10 6 hücre at ed plaka 5 ng / ml rhIL-15 Çevre kuyuları için steril su ekleyin ile desteklenmiş. 37 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde gece boyunca inkübe ° C,% 5 CO2.
1. Gün
2. T hücrelerinin uyarılması için anti-CD28 ve anti-CD3 antikoru ile kaplama levhaları
- 1 ug / ml her biri arasında bir konsantrasyonda steril su içinde anti-CD28 ve anti-CD3 antikorları ile seyreltilir.
- Olmayan bir kaplanmış doku kültür 24 kuyulu plakanın kuyularına 5 işaretli her bir 500 ul antikor solüsyonu eklenir.
- Kuyuların dinlenmek için steril su ekleyin. 4 ° C buzdolabında shrink wrap ve yerine plaka sarın.
3. Uyarılmamış T-hücrelerinin Nucleofection
- 37 Prewarm T-hücresi ortamı ° C ve rhIL-15 5 ng / ml ile takviyesi. Nucleofector çözelti 2,25 ml Nucleofector Ek 1 500 ul ekleyerek komple nucleofector çözeltisi hazırlayın.
- Aliquot 5, ug transpozon (Zeo-PT-CMV-eGFP) ve 1.5 ml mikrofüj tüpüne transposase (pCMV-piggyBac) her Not:. optimal gen aktarımı için transposase ve transpozon DNA miktarını optimize etmek için ve en aza indirmek gerekli olabilir hücresel toksisite. Plazmid isteğe göre yazarlar elde edilebilir.
- 50 ml'lik bir tüpe 24 gözlü doku kültür plakasının ikinci Hasat PBMC'ler. Hücrelerin say. Flow sitometri süresince kontrol olarak kullanılmak üzere 2 x 10 6 hücre kaydedin.
- 400 xg, 5 dk bir 15 ml tüp ve santrifüj 7-10 x 10 6 hücre ekleme, süpernatant ve parmak hareketiyle pelet aspire.
- Gevşetilmiş hücre peleti, T hücre komple nucleofection çözelti 100 ul ekle.
- Plazmid içeren tüp çözüm hücre karışımı ekleyin.
- Nucleofection küvetin dibine çözüm hücre plazmid karışımı ekleyin. Kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olun.
- Pro yardımıyla hücreler NucleofectU-014 gram (uyarılmamış T-hücreleri, insan, http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
- Hemen küvetine rhIL-15 ile önceden ısıtılmış medyanın 500 ul ekleyin. RhIL15 ile önceden ısıtılmış medya 1.5 ml içeren 24 kuyulu plakanın bir kuyu için hücre transfer edin.
- 37 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde gece boyunca inkübe ° C,% 5 CO2.
2. Gün
4. T hücreleri belirgin olmayan Uyarım
- Hasat hücreleri ve hücre sayıları belirler. GFP pozitif hücrelerin sıklığını belirlemek için flow sitometri için 0.5 x 10 6 hücre kenara koyun. Kontrolleri gibi non-transfekte edilmiş PBMC'ler kullanın.
- Olmayan doku kültürü kaplı plaka CD3/28 antikor solüsyonu aspire ve T hücre ortamı ile her yıkayınız.
- Tam CTL medya ml başına 0.5 x 10 6 hücre de nucleofected hücreler süspanse5 ng / ml rhIL-15 ile desteklenmiş. 2.0 ml olmayan bir doku kültür plakasının 4 kuyu içinde nucleofected hücrelerinin her ekleyin. De 5 inci 0.5 x 10 6 sigara nucleofected hücreleri ekleyin.
- 37 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 3 gün süre ile inkübe ° C,% 5 CO2.
5. Gün
- Kaplı olmayan doku kültür plakasının ikinci uyarılmış T-hücreleri hasat etmek.
- 0.7 bir 24 iyi kaplı doku kültürü plaka hücreleri sayma ve replate x 10 5 ng / ml IL-15 ile 6 hücre / T hücre medya ml.
7. Gün
7. Gen Ekspresyon Analizi
- Hasat hücreleri, anti-insan CD8 antikor ile leke (aynı zamanda, anti-CD3 ve anti-CD4 kullanabilir) ve% GFP tanımı için akış sitometrisi ile analiz eder.
Gün 8 (İsteğe bağlı)
8. T hücrelerinin genişlemesi
- Transfeksiyondan sonra, 8. günde, T-hücreleri, T replated edilebilir16 daha fazla genişleme için çukur başına 0.7 x 10 6 hücre bir yoğunlukta IL-15 ile hücre ortamı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genetik olarak bir raportör gen (eGFP) ile insan T lenfositleri değiştirilmesinde adımları gösteren bir şematik Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu plazmid yazarların istek üzerine mevcuttur. Bir muhabir gen (eGFP) ile genetik olarak değiştirilmiş insan T lenfositlerinde adımları gösteren bir schemtic Şekil 2'de showin olduğunu. Onlara, bölmek genişletin ve kültürü yaymak için almak için T hücrelerini aktive etmek gereklidir. Modifiye insan T hücreleri daha sonra kültüre ve Gün 1 ve Gün 7 gen ekspresyonu için flow sitometri kullanılarak analiz edildi. Gösterilen Şekil 3 'de bir donörden sonuçlardır. Hücreler, hücre Görevi yazılımı kullanılarak allophycocyanin (APC)-konjuge anti-CD8, 4 floresan sinyalleri filtre seti ile donatılmış bir FACSCalibur ile eGFP (transgen) ve APC floresan için analiz ile boyandı (Becton Dickinson). Daha önce, gen CD4 ve CD8 pozitif T-hücrelerinin her iki modifikasyon ve burada şeytan gözlemledikÖrnek 7 gibi CD8 pozitif hücrelerin tedir. Bu tarifnamede tek bir transgen ekspresyonu için analiz olmasına rağmen, aynı zamanda piggyBac 17, insan hücrelerinde çok-geni (ya da çoklu) gen transferi için kullanılmıştır. Günde 1 ile 7 gün arasında eGFP ifade azalması olası tüm transfekte edilmiş hücrelerin transpozon DNA stabil entegrasyonunu tabi olmasından kaynaklanmaktadır.
Şekil 1. Insan T hücrelerinin piggyBac aracılı gen değiştirme için kullanılan plasmidlerin şematik. CMV, sitomegalovirüs organizatörü; intron, mRNA stabilizasyonu için SV40 intron; piggyBac, transposase cDNA; SV40 pA, poliadenilasyon yer; pUC, çoğaltma kökeni, b-laktamaz, ampisilin direnç geni; PB3'IR, piggyBac 3 'ters repeat; PB5' IR, piggyBac.. 5 'ters tekrarı; ZeoR, zeocin direnç geni; R6K Ori, çoğaltma kökeni; IVS, müdahale sırası; eGFP, floresan raportör gen Not: antibiyotiklerin bakteriyel seçimi ve büyümesi için kullanılan ancak T hücre kültürlerinde kullanılan değildi buraya tıklayın büyük bir rakam görmek için .
Şekil 2. PiggyBac transpozon sistemi kullanılarak primer insan T-hücrelerinin değişiklik açıklayan şematik.
Şekil 3,. T-hücrelerinde stabil transgen ekspresyonu piggyBac transpozon syste ile değiştirilmişm. Sol panel: 1. Gününde eGFP ifade. Sağ panel:. 7. günde eGFP ifade büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan yöntem, primer insan T hücrelerinin kararlı transgen değiştirilmesini sağlar. Biz daha önce bir muhabir gen (en fazla 4 hafta), olmayan bir immünojenik intihar gen, evlatlık immünoterapi için bir kimerik antijen reseptör (100 günden fazla) için, ifade T hücreleri değiştirmek için piggyBac transpozon sisteminin kullanımını test ettik ve immünsüpresif ilaçlar 7,13-15 direnç mühendisi. Evlatlık immünoterapi ve diğer uygulamalar için T hücrelerinin Sigara viral modifikasyonu retroviral transdüksiyon daha az pahalı ve bu nedenle daha yaygın kullanılan olmalıdır. Yeni bir hiperaktif piggyBac elemanların kullanımı, insan T-hücreleri 9 modifiye kararlı transgen imalat fizibilite arttırmak gerekir. Burada tarif edilmemekle birlikte, bir potansiyel klinik kullanım için stabil olarak transfekte edilmiş T hücreleri gerekli sayıda elde edilebilir. PiggyBac-aracılı gen transferi ve aK bir arada kullanma562 (yapay antijen sunan) besleyici hücreleri, yaklaşık 2 x 10 6 stabil olarak transfekte edilen T-hücrelerinde bir ilk verim 6-7 içinde 10 10 üzerinde 4-5 ay içinde T hücrelerinin transdük için 12 ve 10 to 4-5 log olarak genişletilebilir hafta 7. Insan T-hücrelerinde piggyBac bütünleşme siteleri analizi proto-onkojenler yönünde hiçbir eğilim göstermiştir, ancak, 13 yukarıda belirtilen nucleofection teknoloji kullanıldığında, aktif T-hücrelerinde son derece özel genlerin içine entegre etmek için bir istidadına yaptık. PiggyBac kararlı için umut verici bir metodoloji temsil eder geniş bir uygulama yelpazesi için insan T hücrelerinin genetik modifikasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
SS TBMM Programı aracılığıyla Grad Eğitimi Hibe içine HHMI Med tarafından kısmen desteklenmektedir. MHW Gazi İşleri Bakanlığı bir kariyer geliştirme ödülü ve Dr ve Bayan Harold M. Selzman ve cömert destek kısmen desteklenmektedir. Bu çalışma aynı zamanda NIH lenfoma SPORE hibe P50CA126752 ve NIH R01 DK093660 tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
|||
References
- Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156 (1989).
- Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397 (1995).
- Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473 (2005).
- Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115 (2009).
- Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707 (2010).
- Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139 (2007).
- Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826 (2009).
- Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427 (2010).
- Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
- Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531 (2011).
- Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
- Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531 (2010).
- Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837 (2009).
- Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133 (2011).
- Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239 (2011).
- Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305 (2010).
- Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343 (2010).
