测量抗体乳鼠心肌细胞对细胞功能的影响

Summary

所提出的方法提供了一种方法扩张型心肌病的患者血浆中的检测功能有效的心性自体抗体，不论特异性抗原，通过分析隔离病人免疫球蛋白对大鼠离体心肌细胞的缩短及细胞内钙瞬变的影响。

Abstract

扩张型心肌病（DCM）是在年轻的成年人¹心脏衰竭的主要原因之一。虽然遗传倾向和博览会的有毒物质被称为的起源DCM，约三分之一的患者对本病的原因，在很大程度上仍然不清楚。在这些患者中有相当多的，已经对心脏表位抗体检测和怀疑本病的发生和发展^2,3中发挥了举足轻重的作用。心脏自身抗体的重要性，强调消除自身抗体的免疫吸附^3-5后，在DCM患者血流动力学的改善。已经被确定各种特异性抗原^2,3和针对这些目标的抗体，可以通过免疫测定法检测。然而，这些方法不能区分刺激（及因此功能有效）和阻断自身抗体。有越来越多的evidenCE，这种区别是非常重要的^6,7。它也可以被假定，若干心性抗体的目标仍然是身份不明，因此不能检测由免疫测定法。因此，我们建立了功能活性的心性的抗体，独立的各自的抗原的检测方法。用于该方法的背景是通常观察到的功能区域心脏蛋白在哺乳动物^8,9之间的高同源性。这表明，心脏针对人的抗原的抗体与非人类的靶细胞，它允许测试从DCM患者对成年大鼠心肌细胞的IgG交叉反应。我们的方法包括3个步骤：第一，IgG抗体是从病人的血浆，使用琼脂糖凝胶偶联的抗-IgG抗体，从免疫吸附的列（德国，Teterow PlasmaSelect）得到分离。二，成人的心肌细胞分离胶原酶灌注在Langendorff灌流装置，使用AP议定修改以前的作品^10,11。将得到的心肌细胞的附着层粘连蛋白涂层的腔coverglasses和染色的Fura-2，钙的选择性荧光染料，该染料可以容易地进入细胞，观察细胞内钙（Ca ^{2 +）}含量^12。在最后一步中，病人的IgG的效果上的细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬变字段刺激心肌在线监视使用市售的细胞钙和收缩监测系统（IonOptix，弥尔顿，MA，USA）连接到一个标准的逆荧光显微镜。

Protocol

1。抗体从患者标本分离

1. 准备迷你免疫吸附柱填充3毫升2毫升病人EDTA血浆抗IgG琼脂糖每到一个空的Econo豆列。 IgG抗体隔离需要至少2毫升的病人血浆中。
2. 将抗-IgG琼脂糖凝胶的顶部上的过滤器，剖开列的前端下部，并按下的过滤器可达到约1滴/秒的流速。让保存液用完的列。
3. 洗柱用3倍体积的0.9％NaCl中，每体积的血浆。
4. 移液器的血浆列。当等离子体已完全沉浸在抗-IgG琼脂糖凝胶，用相同体积0.9％NaCl溶液洗。
5. 吸取1，pH值为2.8的0.2M甘氨酸盐酸血浆体积上的列，并让沉浸到琼脂糖。添加另一个卷甘氨酸盐酸列上。收集的流量，通过在一个15毫升的试管中，将pH调节至7.3，用0.5M的Tris-HCl，pH值8.0。
6. 若要重新列，用3个血浆容量甘氨酸盐酸。用2倍体积的0.9％NaCl的最终洗涤后，这个字段可以被用于下一个血浆样品。可替代地，列可以填充与保存溶液，并存储在4 - 8℃下进行最多达4周。
7. 对于心肌细胞上使用，所收集的IgG级分透析实验缓冲液（EB）。对于制备的EB，添加0.6毫摩尔MgCl _2，117 mM氯化钠，2.8 mM KCl中，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，1.2毫摩尔的CaCl _2，10mM HEPES和20mM葡萄糖的1升蒸馏水，在磁力搅拌器上，并调整pH值7.3。
8. 一种纤维素酯渗析膜管中填充的IgG级分，具有分子量100 kDa的切断。将管在1升的EB，并用磁力搅拌器缓慢搅拌，在4℃下8小时后，在透析管转移到3升的新鲜的EB和另一透析20小时，在4℃。
9. 经过透析，加热样品30分钟，在57℃下在水浴中以inactivatË补体因子。确定总IgG浓度，并准备含330微克的IgG各等份。当心肌细胞样品的测量（4.3），填补了EB的1毫升等分试样。可以存储未稀释的等分试样在-20℃直至进一步使用。

2。大鼠心肌细胞的分离

1. 对于制备的Ca ^{2 +}的隔离缓冲器（IB），添加110 mM氯化钠，2.6 mM KCl中，1.2 mM的用MgSO _4，1.2毫摩尔KH ₂ PO _4，20mM的HEPES，11mM葡萄糖1升蒸馏水中，使用磁力搅拌器。调节pH至7.4，在室温和过滤器通过0.2μm瓶顶过滤器进行灭菌。
2. 填充80毫升Langendorff灌流恒温系统上水库IB。调整恒温器设置，以保持在37℃的温度的缓冲和曝气用95％O _{2/5％CO 2的} 30分钟的缓冲区。
3. 称取约10,000 - 12,000 U的collagenase II型，175毫克无脂肪酸BSA和溶解在20毫升IB含有22.5微升的100mM CaCl _2的原液。控制隔离缓冲液的pH值在上水库和如果需要的话进行调整。
4. 只Wistar大鼠175 - 200克，375微克/公斤体重硫喷妥钠麻醉。 2500 IU肝素以硫喷妥钠解决方案。开胸手术后，切除心小心地用一个完整的主动脉弓，并将其转移到冰冷的0.9％的氯化钠。清洁对心脏的血液和周围组织和转移到新鲜的0.9％NaCl溶液中。暴露主动脉，打开节流的Langendorff系统，获得滴的速度2-3/sec的心脏的套管。
5. 最多3分钟，流速为1滴/秒，洗出剩余的血灌注心脏。开始流通的Langendorff系统中的IB。从上游水库中取出20毫升缓冲液，填补在的胶原酶溶液和填充的缓冲，需要达到80毫升。循环的c另一个27分钟ollagenase溶液。流速应周期性地控制和维持在1滴/秒使用节流。
6. 从套管分离的心，干净的心房和主动脉，切成小块。允许在的胶原酶溶液运行到下水库，降低音量到最大40毫升和进一步消化切碎的心室为10 - 15分钟，在连续曝气与95％O _{2/5％CO 2。}之后，过滤该细胞悬浮液通过200μm的筛目大小的纱布入50毫升的管。
7. 还原的Ca ^{2 +的}含量的细胞在3个步骤：在43×g离心2分钟，在室温和重悬细胞在10ml IB含有200μMCaCl _2的离心细胞悬浮液。再次离心，重悬细胞与500μM _氯化钙 10毫升IB。经过最后的离心重悬心肌在无菌过滤EB（见1.8），50000个细胞/ ml的密度。

e_title“> 3。Fura-2的染色中的心肌细胞

1. 大衣4腔室盖玻片，每孔10微克层粘连蛋白和等待，直到它完全干燥。
2. 导入各孔中，切割尖端用微量填充1毫升上述心肌细胞的悬浮液。允许在室温下的1小时的细胞附着。
3. 稀释10微升的1毫克/毫升的Fura-2 AM在5毫升的EB的原液。保持在黑暗中的染色溶液。
4. 脱掉缓冲液和未连接的细胞从盖玻片和吸移管0.5毫升到各孔中的染色溶液。 10分钟适度的摇晃下培养细胞。随后，起飞染色液，洗细胞一次，用1毫升EB终于填补0.5毫升的EB中，每孔。在染色过程中应避免直射阳光，并始终保持在黑暗中染色细胞。

4。细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬态记录

1. 将腔室盖玻片的倒数荧光米icroscope连接到一个心肌细胞的钙和收缩记录系统。一个定制的电极与第一井的流入和流出管的位置。 superfuse心肌细胞与1毫升/分钟的EB和开始电刺激（1赫兹，20伏，5毫秒的持续时间）。使细胞适应约2分钟的刺激。
2. 选择一个完整的棒状清晰的条纹和不断收缩的心肌细胞。的视场中的单元格的中心位置，并打开相机通道。取向的细胞内水平的视频区，通过旋转的小区成帧适配器和移动的显微镜载物台上。
3. 调整视频区域的边缘检测控制单元（ 图2），打开荧光通道和创纪录的10 - 15宫缩获得初始细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬态。
4. 关闭显微镜的光通道，以避免漂白的荧光染色。切换流过的样品从EB绕过了3路阀和superfuse心肌细胞用1ml的患者的IgG。停泵前空气达到良好。
5. 打开光通道，并记录10 - 15收缩获得的急性细胞反应。暂停录制，光通道再次关闭。 2和5分钟后重复记录。
6. 取出电极的阱。彻底清洁管，并继续与EB的下一个良好的腔室盖玻片。
7. 细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬变与IonWizard软件使用“Edge-Length/Length”和“呋喃-2 -数字/比例减去”窗口，分别分析。计算从初始细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬时用于急性称为基线（提单％峰值小时）的峰高，2分钟和5分钟响应的百分比变化。

Representative Results

两个例子为测量在该领域的蜂窝性收缩力刺激成人的心肌细胞（ 图2），使用下面给出的心肌细胞的Ca ^{2 +}和收缩记录系统， 图3给出了一个控制测量的印象，而在图4中的效果cardiodepressive抗体的病人，在DCM中所示。

在这两个例子中，初始细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬态期间灌流与EB表现出非常明确和一贯的山峰，这是一个先决条件的分析。我们从经验中知道，细胞表现出初始H的BL％的峰值为7 - 14％，西装最适合我们的应用程序，而较低或较高的初始收缩的心肌细胞往往容易出现无端的变化，细胞收缩。应用程序的控制抗体后， 即 IgG的孤立性收缩力的心肌细胞保持健康对照组，ün变更在整个测量（ 图3A）。相反，灌流含有cardiodepressive抗体与IgG其次是由细胞缩短（ 图4A），减少了伴随通过还原的Ca ^{2 +}瞬变通常是不太明显的（ 图4B）。通常，我们观察到新的稳定状态，建立细胞缩短两者，与Ca ^{2 +}瞬变，2分钟后是保守的，直到结束5分钟后，测量。给出的示例显示了一个非常明显的负性肌力作用，减少细胞缩短了54％和31％的Ca ^{2 +}瞬态5分钟后。然而，变化往往不太明显。因此，我们定义了一个上限和下限的阴性和阳性性收缩力为平均值±2SD控制，IgG的健康对照组，以避免假阳性结果。因此，细胞只考虑为负或正性肌力瓦特细胞缩短的的母鸡变化的超过此阈值，这是我们确定为约±10％。

图1。流程图自身抗体检测，测量心肌收缩力。首先，IgG的提取病人的样本，使用抗IgG Sepharose柱（黄色突出显示）。二，从大鼠心脏心肌细胞分离酶消化染色的Fura-2（蓝色高亮显示）。最后，细胞收缩和^钙瞬变在线监测，使用心肌细胞的钙和收缩录音系统（突出显示为绿色）。

图2。离体大鼠心肌细胞定位在视频区域中的心肌细胞的收缩力记录系统。下方的单元格中显示的曲线图计算出的强度用于边缘检测的痕迹。箭头指示边缘检测控制元件。 点击此处查看大图 。

图3。控制测量的典型例子。短暂的（B）在线监测前（初始），即时（急性），2分钟，5分钟后，灌流与IgG细胞的缩短（A）和Ca ^{2 +。}红色线表示暂停的测量。

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图4。例如测量细胞的缩短（A）和Ca ^{2 +} 的IgG样品cardiodepressive抗体。短暂的（B）在线测量之前（初始），即时（急性），2分钟，5分钟后，灌流与IgG。红色线表示暂停的测量。

Discussion

所提出的方法提供了一种合适的方法来检测自身抗体在DCM来源不明的患者的心脏功能有效。在与其他方法相比， 例如：对β1-肾上腺素能受体的功能活性的抗体的检测由他们影响cAMP水平^6，我们的方法是独立于一个特定的表位。当然也有其他的文献中描述的表位独立分析， 即计算跳动的乳鼠心肌细胞^13，在成人的心肌细胞钙电流测量膜片钳技术或孤立的浦肯野纤维的收缩率。优势，这些方法在这里介绍的是，该法耗时更少，并提供了增强的客观性由于标准化协议。此外，它允许在同一时间对收缩力和细胞内钙瞬变的检测的影响。

类似OT她在体外实验中，所提出的方法得到的结果可能会被质疑的人工条件下的细胞。新生大鼠心肌细胞报告附加优先与micropillars之间的距离为30微米或更小的比在平坦衬底上。连接到后者时，细胞被发现，显示肌动蛋白应力纤维和无序的肌纤维^15。然而，这里描述的收缩测定应力纤维的潜在影响可能是微不足道的，因为成年心肌只培养了很短的时间周期高达至6小时，这可能会降低形成的这样的纤维和细胞缩短和Ca ^{2 +}瞬时被称为的相应单元格的初始收缩性细胞之间的个体差异的影响减到最小。另一个限制是实验动物和时间的高要求。因此，该方法是不适合于高通量筛选巴蒂已废除。

进一步的实现是可以想象的方法。由于抗原独立它可以应用到其他的特发性心血管疾病，其中假定一种自身免疫性的影响。

此外，收缩性测量可以很容易地被调整，以研究的其他物质的功能性影响。这使得分析药物的心脏，它可能是有益的， 例如在药物开发和测试的潜在影响。除了 ​​细胞缩短和Ca ^{2 +}从基线的变化所提供的基本参数，以下方式获得进一步的信息可以从测量允许观察到的效应的更详细的定义。例如，可以计算出从出发和返回速度，这可能表明特定的收缩期和舒张期的药物或抗体的影响的细胞缩短事件。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunosorba preservation solution	Fresenius Medical Care	903609211
Collagenase type 2	Cell System	LS004176
BSA, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A6003
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
Fura-2 AM	Sigma-Aldrich	F0888	1 mg/ml in DMSO
Econo Pac Chromatography Columns	BioRad	732-1010
Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane	Spectrumlabs	131417
4 well Chambered Coverglass	Nunc	155383
Myocyte Calcium and Contractility Recording System	IonOptix
IonWizard 6.0 analysis software	IonOptix