Summary
I denne procedure giver det muligt at opdage funktionelle effektive cardiotropic autoantistoffer i plasmaet hos patienter med dilateret cardiomyopati, uanset det specifikke antigen, ved at analysere virkningen af isolerede patient immunoglobulin på cellulær afkortning og intracellulært calcium transienter i isolerede rotte cardiomyocytes.
Abstract
Dilateret kardiomyopati (DCM) er en af de vigtigste årsager til hjertesvigt hos yngre voksne 1. Selv om genetiske disposition og redegørelse for giftige stoffer er kendte årsager til denne sygdom i omkring en tredjedel af patienterne, oprindelsen af DCM er fortsat stort set uklar. I et betydeligt antal af disse patienter har autoantistoffer mod hjerte-epitoper blevet opdaget og er mistænkt for at spille en central rolle i opståen og progression af sygdommen 2,3. Betydningen af hjerte-autoantistoffer understreges af en hæmodynamisk bedring hos DCM patienter efter eliminering af autoantistoffer ved immunoadsorption 3-5. En række specifikke antigener er allerede blevet identificeret 2,3 og antistoffer mod disse mål kan påvises ved immunoassays. Imidlertid kan disse analyser ikke diskriminere mellem stimulere (og derfor funktionelt effektive) og blokere autoantistoffer. Der er stigende evidence, at denne skelnen er afgørende 6,7. Det kan også antages, at de mål for en række cardiotropic antistoffer er stadig ukendt og kan derfor ikke påvises ved immunoassays. Derfor har vi etableret en fremgangsmåde til påvisning af funktionelt aktive cardiotropic antistoffer, der er uafhængige af deres respektive antigen. Baggrunden for fremgangsmåden er den høje homologi sædvanligvis observeret for funktionelle regioner af kardiale proteiner i mellem pattedyr 8,9. Dette antyder, at hjerte-antistoffer rettet mod humane antigener vil krydsreagere med ikke-humane målceller, hvilket tillader test af IgG fra DCM patienter på voksne rotter cardiomyocytes. Vores fremgangsmåde består af tre trin: først bliver IgG isoleret fra patientplasma med Sepharose koblet anti-IgG-antistoffer opnået fra immunoadsorption søjler (PlasmaSelect, Teterow, Tyskland). For det andet voksne kardiomyocytter isoleres ved collagenaseperfusion i en Langendorff perfusion apparat under anvendelse af aprotocol modificeret fra tidligere arbejder 10,11. De opnåede kardiomyocytter er fastgjort til laminin-overtrukne kamre dækglasset og farvet med Fura-2, en calcium-selektivt fluorescerende farvestof, som let kan bringes ind i cellen at observere intracellulært calcium (Ca2 +) indhold 12. I det sidste trin, virkningen af patientens IgG på cellens afkortning og Ca2 +-transienter i felt stimulerede cardiomyocytes overvåges online ved hjælp af et kommercielt myocyt calcium og kontraktilitet overvågningssystem (IonOptix, Milton, MA, USA) forbundet til en standard omvendt fluorescerende mikroskop.
Protocol
1. IgG Isolering fra patientprøver
- Forbered mini-immunoadsorption kolonner ved at udfylde 3 ml anti-IgG sepharose per 2 ml patient EDTA plasma ind i en tom Econo Pac kolonne. IgG isolation kræver mindst 2 ml af patientens plasma.
- Placere et filter på toppen af anti-IgG sepharose, skar nedre spids af kolonnen og tryk på filteret for at nå en strømningshastighed på cirka 1 dråbe / sek. Lad bevarelse opløsning løber ud af søjlen.
- Søjlen vaskes med 3 volumener 0,9% NaCI pr mængde plasma.
- Pipetteres plasmaet på søjlen. Når plasmaet er fuldstændig nedsænket i anti-IgG sepharose, vaskes med det samme volumen 0,9% NaCl.
- Pipette en plasma volumen 0,2 M glycin-HCI, pH 2,8 på søjlen og lade nedsænke til sepharose. Tilføj endnu et bind af glycin HCI på søjlen. Opsaml strømmen gennem i et 15 ml rør, og pH justeres til 7,3 med 0,5 M Tris-HCI, pH 8,0.
- At regenerere kolonnen, Vaskes med 3 plasma volumen glycin HCI. Efter en endelig vask med 2 volumener 0,9% NaCI, kan kolonnen anvendes til den næste plasmaprøve. Alternativt kan søjlen være fyldt med konserverende opløsning og opbevaret ved 4 - 8 ° C i op til 4 uger.
- Til brug på cardiomyocytter, har indsamlet IgG-fraktionen kan fjernes ved dialyse mod eksperimentel puffer (EB). Til fremstilling af EB, tilsættes 117 mM NaCI, 2,8 mM KCI, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM CaCl2, 10 mM HEPES og 20 mM glucose til 1 L destilleret vand på en magnetisk omrører og justere pH til 7,3.
- Fyld IgG-fraktion til en celluloseester dialysemembran rør med en molekylvægtsgrænse på 100 kDa. Anbringes derefter i 1 L EB og omrøres langsomt med en magnetisk omrører ved 4 ° C. Efter 8 timer, overføres dialyserøret i 3 liter frisk EB og dialyseres i yderligere 20 timer ved 4 ° C.
- Efter dialyse, opvarmes prøven i 30 minutter ved 57 ° C i et vandbad for at inactivate komplementfaktorer. Bestemme total IgG koncentration og forberede alikvoter indeholdende 330 ug IgG hver. Ved tilsætning af prøven til kardiomyocytter til måling (trin 4.3), fylde alikvoter til 1 ml med EB. Ufortyndede prøver kan opbevares ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.
2. Isolering af rotte cardiomyocytes
- Til fremstilling af Ca2 +-fri isolation puffer (IB), der tilsættes 110 mM NaCI, 2,6 mM KCI, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES og 11 mM glucose til 1 L destilleret vand under anvendelse af en magnetisk omrører. PH justeres til 7,4 ved stuetemperatur og filtreres gennem et 0,2 um skruelåget filter for sterilisering.
- Fyld 80 ml IB i det øvre reservoir i en termostateret Langendorff perfusionssystem. Juster termostatindstillinger at opretholde en puffer temperatur på 37 ° C og luftes puffer med 95% O2 / 5% CO2 i 30 minutter.
- Afvejes omkring 10.000 - 12.000 U collagenase type II, 175 mg fedtsyrefrit BSA og opløses i 20 ml IB indeholdende 22,5 pi af en 100 mM CaCl2-stamopløsning. Regulere pH-værdien af isoleringen puffer i det øvre reservoir og juster, hvis nødvendigt.
- Bedøve en Wistar-rotte på 175 til 200 g med 375 ug / kg legemsvægt thiopental. Læg 2500 IU heparin til thiopental opløsning. Efter torakotomi, punktafgifter hjertet omhyggeligt med et intakt aortabuen og overføre det i iskold 0,9% NaCl. Rens hjertet fra blod og omgivende væv og overførsel til friske 0,9% NaCl. Udsætte aorta, åbne flow reducer af Langendorff-system til opnåelse af en faldende hastighed på 2-3/sec og fastgør hjertet til kanylen.
- Perfundere hjertet for op til 3 min med en strømningshastighed på 1 dråbe / sekund at udvaske resterende blod. Begynd at cirkulere IB i Langendorff-systemet. Fjern 20 ml buffer fra den øvre reservoir, udfylde collagenaseopløsning og refill så meget buffer, som kræves for at nå 80 ml. Cirkulere c ollagenase løsning for yderligere 27 min. Flow rate bør kontrolleres med jævne mellemrum og holdes ved 1 dråbe / sek ved hjælp af flow reducer.
- Tag hjertet fra kanylen, rene fra atrier og aorta og hak i små stykker. Tillade collagenaseopløsning for at løbe ind i det nedre reservoir, nedbringe antallet til maksimalt 40 ml og yderligere fordøje de hakkede ventrikler i 10 - 15 minutter under kontinuerlig beluftning med 95% O2 / 5% CO2. Derefter filtreres cellesuspensionen gennem en 200 um maskestørrelse gaze i et 50 ml rør.
- Gendanne Ca2 + indhold af cellerne i 3 trin: centrifugeres cellesuspensionen ved 43 x g i 2 minutter ved stuetemperatur og Resuspender cellerne i 10 ml IB indeholdende 200 uM CaCl2. Der centrifugeres igen og resuspender cellerne i 10 ml IB med 500 pM CaCI2. Efter en sidste centrifugering resuspenderes kardiomyocytter i sterilfiltreret EB (se 1.8) til en tæthed på 50.000 celler / ml.
- Coat en 4 godt kammer dækglas med 10 ug laminin per brønd og vente, indtil den er helt tørret.
- Fyld 1 ml af cardiomyocyte suspensionen i hver brønd under anvendelse af en mikropipette med et snit spids. Tillader cellerne at adhærere i 1 time ved stuetemperatur.
- Fortynd 10 ul af 1 mg / ml Fura-2:00 stamopløsning i 5 ml EB. Hold farvningsopløsningen i mørke.
- Start buffer og ikke-bundne celler fra dækglas og pipette 0,5 ml af farvningsopløsningen i hver brønd. Inkubér cellerne i 10 minutter under moderat omrystning. Derefter tag farvningsopløsning, vaskes cellerne en gang med 1 ml EB og endelig fyldes 0,5 ml EB i hver brønd. Undgå direkte lys under farvning proces og altid holde de farvede celler i mørke.
4. Registrering af Cell Afkortning og Ca 2 + Transienter
- Placer kammer dækglas på en invers fluorescens microscope forbundet til en myocyt calcium og kontraktionsevne registreringssystem. Placer en skræddersyet elektrode med en indstrømning og udstrømning rør i den første brønd. Superfuse kardiomyocytter med 1 ml / min EB og starte den elektriske stimulation (20 V, 1 Hz, 5 msek varighed). Tillader cellerne at tilpasse sig stimulering i ca 2 min.
- Vælg en intakt stavformet cardiomyocyte med klar stribedannelsesfri og konstant sammentrækning. Anbring cellen i midten af synsfeltet og åbne kameraet kanal. Orientere cellen horisontalt inden for videoområdet ved at dreje cellen udformningen adapter og bevæge objektbordet.
- Juster kant afsløre styre visse elementer på video-området (figur 2), skal du åbne den fluorescerende kanal og optage fra 10 til 15 sammentrækninger for at opnå den oprindelige celle afkortning og Ca 2 + forbigående.
- Luk mikroskopet lyskanal at undgå blegning af fluorescens pletten. Skift strømmen igennem fra EB til prøvenbypass med en 3-vejs ventil og superfuse kardiomyocytter med 1 ml af patientens IgG. Stop pumpen lige før luften når brønden.
- Åbn lyset kanal og optage en anden 10 til 15 sammentrækninger for at opnå den akutte celle respons. Pause optagelsen og lukker lyset kanal igen. Gentag optagelse efter 2 og 5 min.
- Tag elektroden af brønden. Rengør rørene grundigt med EB og fortsætte med den næste brønd i kammer dækglas.
- Analyser cellen afkortning og Ca 2 + forbigående med IonWizard software ved hjælp af "Edge-Length/Length" og "fura 2-Numerisk trækkes / Ratio" vinduet, hhv. Beregne den procentvise ændring fra den oprindelige celle afkortning og Ca2 + forbigående af den tophøjde henvist til Basislinie-(BL% peak h) til akut, 2 minutter, og 5 min respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
To eksempler til måling af cellulær inotropi i felt stimuleret voksne kardiomyocytter (fig. 2) ved hjælp af en myocyt Ca2 + og kontraktilitet registreringssystem er angivet nedenfor. Figur 3 giver et indtryk af en kontrolmåling, mens der i figur 4 virkningen af cardiodepressive antistoffer af en patient med DCM vises.
I begge eksempler, initial celle afkortning og Ca 2 + forbigående under superfusionsapparatet med EB udviser klare og konstante toppe, hvilket er en forudsætning for analysen. Vi ved af erfaring, at celler, der udviser en indledende bl% peak h i området fra 7 - 14% passer bedst til vores ansøgning, mens cardiomyocytter med lavere eller højere initial kontraktilitet ofte tendens til at udvise uprovokerede ændringer i celle afkortning. Efter påføring af kontrol IgG, isoleret, dvs IgG fra raske kontrolpersoner, inotropi af cardiomyocytes forbliver unændret hele målingen (figur 3A). I modsætning hertil er superfusionssystem med IgG indeholdende cardiodepressive antistoffer efterfulgt af et fald af celle shortening (figur 4A), en nedsættelse Ca2 +-transienter, som typisk er mindre udtalt (fig. 4B). Vi normalt konstatere, at en ny stabil tilstand er etableret både, cell afkortning og Ca2 +-transienter, og efter 2 min, som er konserveret indtil afslutningen af målingen efter 5 min. Det givne eksempel viser en meget klar negativ inotrop virkning med en reduktion af celle afkortning med 54% og af Ca2 +-transienter med 31% efter 5 min. Men forandringer er ofte mindre udtalte. Derfor definerede vi en øvre og nedre grænse for negativ og positiv inotropi som middelværdi ± 2SD for kontrol IgG af et sundt kontrolgruppe for at undgå falske positive resultater. Følgelig er celler kun betragtes som negativ eller positiv inotrop whøne ændringer i celle afkortning overskrider denne tærskel, som vi bestemt til at være ca ± 10%.
Figur 1. Flow diagram af autoantistof opdagelse ved at måle cardiomyocyte kontraktilitet. Først IgG ekstraheret fra patientprøver vha. anti-IgG sepharosesøjler (markeret med gult). For det andet er cardiomyocytter isoleret fra rottehjerter ved enzymatisk nedbrydning og farvet med Fura-2 (fremhævet med blåt). Endelig celle afkortning og Ca 2 + transienter overvåges online med et myocyt Calcium og kontraktilitet Recording System (fremhævet med grønt).
Figur 2. Isoleret rotte cardiomyocyte placeret i videoen område af myocyt Kontraktilitet Recording System. Nedenstående graf viser cellen de beregnede intensitet spor, der anvendes til kantdetektering. Pile angiver kant afsløre betjeningselementer. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Repræsentativt eksempel på en kontrolmåling. Cell afkortning (A) og Ca2 + forbigående (B) blev overvåget online før (oprindeligt), umiddelbart (akut), 2 minutter og 5 minutter efter superfusionssystem med IgG. Røde linjer angiver pause af målingen.
"Figur 4" fo: indhold-bredde = "4.5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg" />
Figur 4. Eksempel måling af en IgG prøve indeholdende cardiodepressive antistoffer. Cell afkortning (A) og Ca2 + forbigående (B) blev målt online før (oprindeligt), umiddelbart (akut), 2 minutter og 5 minutter efter superfusionssystem med IgG. Røde linjer angiver pause af målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den fremlagte metode giver en passende måde at opdage funktionelt effektive hjerte autoantistoffer hos patienter med DCM af uklar oprindelse. I sammenligning med andre metoder, påvisning af funktionelle aktive antistoffer mod β1-adrenoceptor fx ved deres virkning på cAMP-niveauer 6, vores metode er uafhængig af en specifik epitop. Selvfølgelig er der andre epitop uafhængige analyser er beskrevet i litteraturen, dvs tælle slaghastighed af neonatale cardiomyocytter 13, der måler calcium strømme i voksne cardiomyocytter ved patch clamp teknik eller kontraktilitet af isolerede Purkinjefibre 14. I fordel til disse fremgangsmåder, er assayet præsenteres her mindre tidskrævende og tilvejebringer forøget objektivitet grund af standardiseret protokol. Yderligere tillader det at detektere virkning på kontraktilitet og intracellulært calcium transienter på samme tid.
Svarende til othende in vitro-analyser, kan de opnåede resultater med den præsenterede metode blive udfordret af de kunstige forhold som gælder for cellerne. Dyrkede neonatal rotte cardiomyocytes blev rapporteret at fastgøre fortrinsvis mellem micropillars med en afstand på 30 um eller mindre end på flade substrater. Når de er fastgjort til sidstnævnte blev cellerne konstateret at vise actin stress fibre og uordnede myofibre 15. Den potentielle virkning af stress fibre i kontraktilitet assayet beskrevet her, kan være ubetydelig, voksne kardiomyocytter kun dyrkes i et meget kort tidsrum på op til 6 timer, som kan reducere dannelsen af sådanne fibre og celle afkortning og Ca2 + forbigående henvises til den oprindelige kontraktilitet af det pågældende celle for at minimere indflydelsen af individuelle forskelle mellem celler. En anden begrænsning er den store efterspørgsel på forsøgsdyr og tid. Metoden er derfor ikke egnet til high-throughput screening af patienser.
Yderligere implementeringer er mulige for fremgangsmåden. På grund af den antigen-uafhængige det kan anvendes på andre idiopatiske cardiovaskulære sygdomme, hvor en autoimmun virkning antages.
Desuden kan kontraktilitet målinger nemt justeres til at studere funktionelle virkninger af andre stoffer. Dette gør det muligt at analysere en potentiel indvirkning af narkotika på hjertet, som kan være gavnligt f.eks lægemiddeludvikling og afprøvning. Udover de grundlæggende parametre, som ændringerne i celle afkortning og Ca 2 + fra baseline, kan yderligere oplysninger indhentes fra de målinger, som muliggør en mere detaljeret definition af den observerede effekt. For eksempel kan og hjemrejse hastigheden beregnes ud fra celle forkortelse begivenheder, som kunne indikere en specifik systolisk og diastolisk virkning af et lægemiddel eller et antistof.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Sonderforschungsbereich Transregio 19 (SFB/TR19, C2) af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Forbundsministeriet for Økonomi og Teknologi projekt ZIM-KF 2727801MD0 og Center for Innovation Kompetence - humorale immunreaktioner i kardiovaskulære sygdomme ( ZIK-hike, BMBF FKZ 03Z2CN12) af Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning, Tyskland. Boliger og eksperimenter med dyr blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne fra Society for Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) og Federation of European Laboratory Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
