Summary
Il metodo proposto offre un modo per rilevare funzionali autoanticorpi cardiotropic efficaci nel plasma di pazienti con cardiomiopatia dilatativa, indipendentemente l'antigene specifico, analizzando l'impatto di immunoglobulina paziente isolato su accorciamento cellulare e transienti di calcio intracellulare in cardiomiociti isolati di ratto.
Abstract
Cardiomiopatia dilatativa (DCM) è una delle principali cause di insufficienza cardiaca nei giovani adulti 1. Sebbene predisposizione genetica ed esposizione a sostanze tossiche sono note cause per questa malattia in circa un terzo dei pazienti, l'origine di DCM rimane poco chiara. In un numero considerevole di questi pazienti, gli anticorpi contro epitopi cardiaci sono stati individuati e sono sospettati di svolgere un ruolo centrale nella insorgenza e la progressione della malattia 2,3. L'importanza di autoanticorpi cardiache è sottolineata da un miglioramento emodinamico osservato nei pazienti DCM dopo l'eliminazione di autoanticorpi da immunoassorbimento 3-5. Una varietà di antigeni specifici sono già stati individuati 2,3 e anticorpi contro tali obiettivi possono essere rilevati da immunosaggi. Tuttavia, questi test non può discriminare tra stimolante (e quindi funzionalmente efficaci) e bloccando autoanticorpi. Vi è una crescente evidence che questa distinzione è cruciale 6,7. Si può anche ritenere che gli obiettivi di un certo numero di anticorpi cardiotropic sono ancora da identificare e pertanto non può essere rilevato dal test immunologici. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo per la rilevazione di anticorpi funzionalmente attivi cardiotropic, indipendentemente dal loro rispettivo antigene. Lo sfondo per il metodo è l'alta omologia di solito osservata per le regioni funzionali di proteine cardiache nei mammiferi tra 8,9. Questo suggerisce che gli anticorpi diretti contro antigeni cardiaci umani reazione crociata con non umani cellule bersaglio, che permette prove di IgG da pazienti DCM su cardiomiociti di ratto adulto. Il nostro metodo si compone di 3 fasi: la prima, IgG è isolato dal plasma del paziente con sefarosio accoppiati anti-IgG anticorpi ottenuti da colonne immunoassorbimento (PlasmaSelect, Teterow, Germania). Secondo, cardiomiociti adulti sono isolati mediante perfusione con collagenasi in un apparato perfusione Langendorff utilizzando apROTOCOLLO modificato da lavori precedenti 10,11. I cardiomiociti ottenuti sono allegati alla laminina rivestite chambered vetrini colorati con Fura-2, un inibitore selettivo colorante fluorescente che può essere facilmente portato nella cella di osservare intracellulare di calcio (Ca 2 +) contenuti 12. Nell'ultimo passaggio, l'effetto del paziente IgG sulla riduzione delle cellule e Ca 2 + transitori di cardiomiociti campo stimolate è monitorato on-line utilizzando un calcio commerciale miociti e sistema di monitoraggio contrattilità (IonOptix, Milton, MA, USA) collegato ad una fluorescente standard di inversa microscopio.
Protocol
1. Isolamento IgG da campioni di pazienti
- Preparare mini-immunoassorbimento colonne di riempimento 3 ml di anti-IgG sepharose paziente per 2 ml di plasma EDTA in una colonna vuota Econo Pac. IgG isolamento richiede almeno 2 ml di plasma del paziente.
- Collocare un filtro sopra l'anti-IgG Sepharose, tagliare aprire l'estremità inferiore della colonna e premere il filtro per raggiungere una portata di circa 1 goccia / sec. Lasciare la soluzione di conservazione corto di colonna.
- Lavare la colonna con 3 volumi NaCl 0,9% per volume di plasma.
- Pipettare il plasma sulla colonna. Quando il plasma è completamente immerso nel anti-IgG Sepharose, lavare con lo stesso volume 0,9% NaCl.
- Pipetta un volume plasmatico di 0,2 M glicina HCl, pH 2,8 su colonna e lasciare immergere nel Sepharose. Aggiungere un altro volume di glicina HCl sulla colonna. Raccogliere il flusso attraverso un tubo 15 ml e regolare il pH a 7,3 con 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
- Per rigenerare la colonna, Lavare con 3 volumi di plasma glicina HCl. Dopo un lavaggio finale con 2 volumi 0,9% NaCl, la colonna può essere utilizzato per il campione di plasma successivo. In alternativa, la colonna può essere riempita di soluzione di conservazione e conservata a 4-8 ° C fino a 4 settimane.
- Per uso su cardiomiociti, la frazione IgG collezionati deve essere dializzato contro tampone sperimentale (EB). Per la preparazione della EB, aggiungere 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1.2 mM CaCl 2, 10 mM HEPES e 20 mM di glucosio ad 1 L di acqua distillata su un agitatore magnetico e regolare il pH a 7,3.
- Riempire la frazione IgG di un tubo estere di cellulosa membrana di dialisi con un peso molecolare tagliato di 100 kDa. Mettere il tubo in 1 L EB e mescolare lentamente con un agitatore magnetico a 4 ° C. Dopo 8 ore, trasferire il tubo di dialisi in 3 L di EB fresco e dializza per un'altra ora e 20 a 4 ° C.
- Seguendo la dialisi, il calore del campione per 30 min a 57 ° C in un bagno d'acqua a inactivatposta complemento fattori. Determinare la concentrazione totale di IgG e preparare aliquote di 330 mg ogni IgG. Quando si aggiunge il campione di cardiomiociti di misura (fase 4.3), riempire le aliquote di 1 ml con EB. Aliquote non diluiti possono essere conservati a -20 ° C fino ad ulteriore utilizzo.
2. Isolamento di cardiomiociti di ratto
- Per la preparazione di Ca 2 +-tampone privo di isolamento (IB), aggiungere 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES e 11 mM di glucosio ad 1 L di acqua distillata con un magnetico agitatore. Portare il pH a 7,4, a temperatura ambiente e filtrare attraverso un filtro 0,2 micron top bottiglia per la sterilizzazione.
- Riempire 80 ml di IB nel serbatoio superiore di un sistema di perfusione Langendorff termostatata. Regolare le impostazioni del termostato per mantenere una temperatura di buffer di 37 ° C e aerare buffer con 95% O 2/5% di CO 2 per 30 min.
- Pesare circa 10.000 - 12.000 U di collagenase tipo II, 175 mg di acidi grassi liberi BSA e si sciolgono in 20 ml contenenti IB 22,5 pl di una mm 100 CaCl2 soluzione madre. Controllare il pH del tampone di isolamento nel serbatoio superiore e regolare se necessario.
- Anestetizzare un ratto Wistar di 175 - 200 g con 375 mg / kg di peso corporeo tiopentale. Aggiungi 2500 UI di eparina alla soluzione tiopentale. Dopo toracotomia, accisa il cuore con cura con un arco aortico intatto e le trasferisce in gelata NaCl 0,9%. Pulire il cuore da sangue e tessuto circostante e trasferimento a fresco 0,9% NaCl. Esporre l'aorta, aprire il riduttore di flusso del sistema Langendorff per ottenere una velocità di gocciolamento di 2-3/sec e attaccare il cuore alla cannula.
- Perfondere il cuore fino a 3 minuti con una portata di 1 goccia / sec per lavare il sangue rimanente. Inizia a circolare le IB nel sistema Langendorff. Rimuovere 20 ml di tampone dal serbatoio superiore, caricare la soluzione collagenasi e riempire come buffer quanto necessario per raggiungere 80 ml. Far circolare il c ollagenase soluzione per un altro 27 min. Portata deve essere controllata periodicamente e mantenuta a 1 goccia / sec utilizzando il riduttore di flusso.
- Staccare il cuore dalla cannula, pulito da atri e aorta e tagliare in piccoli pezzi. Lasciare che la soluzione di collagenasi di scorrere nel serbatoio inferiore, ridurre il volume ad un massimo di 40 ml e in seguito digerire i ventricoli tritate per 10 - 15 minuti sotto aerazione continua con il 95% O 2/5% di CO 2. Successivamente, filtrare la sospensione cellulare con una garza 200 micron dimensione delle maglie in una provetta da 50 ml.
- Ripristinare il Ca 2 + contenuto delle celle in 3 fasi: centrifugare la sospensione cellulare a 43 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e risospendere le cellule in 10 ml contenenti IB 200 mM CaCl 2. Centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 10 ml IB con 500 mM CaCl 2. Dopo una centrifugazione finale risospendere in cardiomiociti EB filtrata sterile (vedi 1.8) ad una densità di 50.000 cellule / ml.
- Cappotto a 4 coprioggetti ben camerata con 10 laminina pg per bene e attendere che sia completamente asciugato.
- Riempire 1 ml della sospensione cardiomiocita in ogni pozzetto usando una micropipetta con una punta di taglio. Permettere alle cellule di aderire per 1 ora a temperatura ambiente.
- Diluire 10 ml di 1 mg / ml Fura-2 AM soluzione madre in 5 ml di EB. Conservare la soluzione di colorazione al buio.
- Togliere celle buffer e distaccato dal coprioggetto e pipettare 0,5 ml di soluzione colorante in ogni pozzetto. Incubare le cellule per 10 minuti sotto agitazione moderata. Successivamente, togliere la soluzione colorante, lavare le cellule una volta con 1 ml di EB e riempire EB 0,5 ml in tutti i pozzetti. Evitare la luce diretta durante il processo di colorazione e tenere sempre le cellule colorate al buio.
4. Registrazione di accorciamento cellulare e Ca 2 + transitori
- Posizionare il coprioggetto a camera su un m inversa fluorescenzaicroscope collegato ad un calcio miociti e sistema di registrazione contrattilità. Posizionare un elettrodo di misura con un afflusso ed efflusso del tubo nel primo pozzetto. Cardiomiociti Superfuse con 1 ml / min EB e iniziare la stimolazione elettrica (20 V, 1 Hz, durata di 5 msec). Permettere alle cellule di adattarsi alla stimolazione per circa 2 min.
- Scegli una cardiomiociti intatto a forma di asta con striatura chiara e costante contrazione. Posizionare la cella al centro del campo visivo e aprire il canale. Orientare la cella orizzontalmente all'interno dell'area video ruotando l'adattatore inquadratura cella e spostando la fase microscopio.
- Regolare il bordo rilevare elementi di controllo della zona video (Figura 2), aprire il canale fluorescente e registrare 10-15 contrazioni per ottenere la riduzione iniziale delle cellule e Ca 2 + transitori.
- Chiudere il canale di luce del microscopio per evitare sbiancamento della macchia fluorescenza. Accendere il flusso attraverso da EB al campionebypass con una valvola a 3 vie e cardiomiociti superfuse con 1 ml di IgG paziente. Fermare la pompa poco prima che l'aria raggiunga il bene.
- Aprire il canale di luce e registrarne un altro 10-15 contrazioni per ottenere la risposta acuta cella. Mettere in pausa la registrazione e chiudere il canale di nuovo luce. Ripetere la registrazione dopo 2 e 5 min.
- Estrarre l'elettrodo di pozzo. Pulire accuratamente le provette con EB e continuare con il pozzo successivo del coprioggetti incamerata.
- Analizzare l'accorciamento cella e Ca 2 + temporaneo con il software IonWizard utilizzando il "Edge-Length/Length" e la finestra "fura 2-numerico sottratto / Ratio", rispettivamente. Calcolare la variazione percentuale dal accorciamento cellula iniziale e Ca 2 + transitoria dell'altezza del picco cui la linea di base (bl% picco h) per l'acuta, il 2 min e la risposta di 5 min.
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Representative Results
Due esempi per la misurazione di inotropismo cellulare nel campo stimolato cardiomiociti adulti (figura 2) utilizzando una miociti Ca 2 + e registrazione contrattilità sono riportati di seguito. Figura 3 dà l'impressione di una misura di controllo, mentre in figura 4 l'effetto di anticorpi cardiodepressive di un paziente con DCM è mostrato.
In entrambi gli esempi, accorciamento cellula iniziale e Ca 2 + transitori durante superfusione con EB presentano picchi chiari e costante, che è un prerequisito per l'analisi. Sappiamo per esperienza che le cellule che presentano un iniziale bl% picco h nel range di 7-14% vestito migliore per la nostra applicazione, mentre cardiomiociti con minore o maggiore contrattilità iniziale spesso tendono ad esibire le modifiche non provocati di accorciamento delle cellule. Dopo l'applicazione del controllo IgG, cioè IgG isolate da soggetti sani di controllo, inotropismo dei cardiomiociti rimane uncambiati durante tutta la misurazione (Figura 3A). In contrasto, superfusione con IgG contenente anticorpi cardiodepressive è seguito da una diminuzione di accorciamento cellulare (Figura 4A), accompagnata da una riduzione Ca 2 + transitori che in genere è meno pronunciata (Figura 4B). Solito osservare che un nuovo stato stazionario è stabilito per entrambe, accorciamento cellulare e Ca 2 + transitori, dopo 2 min, che è conservato fino alla fine della misurazione dopo 5 min. L'esempio dato mostra un effetto molto chiaro inotropo negativo con una diminuzione di grasso delle cellule del 54% e di Ca 2 + transitori del 31% dopo 5 min. Tuttavia, i cambiamenti sono spesso meno pronunciato. Pertanto, abbiamo definito un limite superiore e inferiore per inotropo negativo e positivo come media ± 2SD IgG di controllo per un gruppo di controllo sano per evitare falsi risultati positivi. Di conseguenza, le cellule sono considerati solo come w inotropo negativo o positivocambiamenti gallina di accorciamento delle cellule superano questa soglia, che abbiamo deciso di essere di circa ± 10%.
Figura 1. Diagramma di flusso di rilevazione autoanticorpi misurando contrattilità dei cardiomiociti. Prima, IgG viene estratto dai campioni dei pazienti con anti-IgG colonne sefarosio (evidenziati in giallo). Secondo, cardiomiociti sono isolati da cuori di ratto mediante digestione enzimatica e colorate con Fura-2 (evidenziato in blu). Infine, accorciamento delle cellule e Ca 2 + transitori sono monitorate online utilizzando un calcio miociti e Sistema di registrazione contrattilità (evidenziato in verde).
Figura 2. Cardiomiociti di ratto isolato posizionata nell'area video del sistema di registrazione miociti contrattilità. Il grafico sottostante la cella visualizza le tracce intensità calcolato usato per il rilevamento dei bordi. Le frecce indicano gli elementi di controllo del bordo di rilevazione. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Esempio rappresentativo di una misurazione di controllo. Accorciamento cellulare (A) e Ca 2 + transiente (B) è stato monitorato prima linea (iniziale), immediatamente (acuta), 2 min e 5 min dopo superfusione con IgG. Le linee rosse indicano la sospensione della misura.
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Figura 4. Misurazione esempio di un campione contenente anticorpi IgG cardiodepressive. Accorciamento cellulare (A) e Ca 2 + transiente (B) è stata misurata prima linea (iniziale), immediatamente (acuta), 2 min e 5 min dopo superfusione con IgG. Le linee rosse indicano la sospensione della misura.
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Discussion
Il metodo proposto offre un modo adatto a rilevare autoanticorpi funzionalmente efficaci cardiaci in pazienti con DCM di origine poco chiara. In confronto ad altri metodi, ad esempio il rilevamento di anticorpi funzionali attivi contro l'β1-adrenocettori da loro impatto sui livelli di cAMP 6, il nostro metodo è indipendente da uno specifico epitopo. Naturalmente ci sono altri saggi indipendenti epitopi descritti nella letteratura, cioè contando il tasso battendo cardiomiociti neonatali di 13, misura correnti di calcio in cardiomiociti adulti con tecnica di patch clamp o la contrattilità isolati fibre di Purkinje 14. In vantaggio di questi metodi, il saggio qui presentato richiede meno tempo e fornisce obiettività aumenta a causa del protocollo standardizzato. Inoltre, esso permette di rilevare l'impatto sulla contrattilità e transienti di calcio intracellulare allo stesso tempo.
Simile a otlei in vitro, i risultati ottenuti con il metodo presentato può essere impugnato da condizioni artificiali applicate alle cellule. Coltivate cardiomiociti neonatali di ratto sono stati segnalati per collegare preferenzialmente tra micropillars con una distanza di 30 pm o meno su substrati piani. Se collegato a quest'ultimo, le cellule sono state trovate per visualizzare stress fibers di actina e non ordinati miofibre 15. Tuttavia, il potenziale impatto di stress fibers nel saggio contrattilità qui descritto può essere trascurabile poiché cardiomiociti adulti sono solo in coltura per un periodo di tempo molto breve fino a 6 ore, che può ridurre la formazione di tali fibre e accorciamento cellulare e Ca 2 + transiente sono riferiti alla contrattilità iniziale della rispettiva cella di minimizzare l'influenza delle differenze individuali tra cellule. Un altro limite è la forte domanda di animali da laboratorio e di tempo. Pertanto il metodo non è adatto per screening ad alto rendimento di patigenitori.
Ulteriori implementazioni sono concepibili per il metodo. Dovuta al complesso antigene-indipendenza può essere applicato ad altre malattie cardiovascolari, idiopatiche cui si consideri un impatto autoimmune.
Inoltre, le misure contrattilità può essere facilmente regolata per studiare gli effetti funzionali di altre sostanze. Questo permette di analizzare un potenziale impatto di farmaci per il cuore, che può essere ad esempio utile nello sviluppo di farmaci e test. Oltre ai parametri di base forniti dai cambiamenti di accorciamento cellulare e Ca 2 + dal basale, ulteriori informazioni possono essere ottenute da misurazioni che consente una definizione più dettagliata dell'effetto osservato. Per esempio, la partenza e la velocità di ritorno può essere calcolato da eventi accorciando la cella che potrebbe indicare una specifica sistolica e diastolica effetto di un farmaco o di anticorpo.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), il Ministero Federale dell'Economia e della Tecnologia progetto ZIM-KF 2727801MD0 e il Centro di Competenza Innovation - risposte immunitarie umorali in Malattie Cardiovascolari ( ZIK-ESCURSIONE, BMBF FKZ 03Z2CN12) del Ministero federale dell'Istruzione e della Ricerca, in Germania. Corpo e gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti in conformità con le raccomandazioni della Società per Laboratorio Scienze Animali (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e la Federazione di Laboratorio europeo di Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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