Summary
El método presentado ofrece una manera de detectar autoanticuerpos funcionales cardiotrópicos eficaces en el plasma de pacientes con miocardiopatía dilatada, con independencia del antígeno específico, mediante el análisis del impacto de la inmunoglobulina paciente aislado en el acortamiento celular y los transitorios de calcio intracelular en los cardiomiocitos de rata aislados.
Abstract
La cardiomiopatía dilatada (DCM) es una de las principales causas de la insuficiencia cardíaca en los adultos más jóvenes 1. Aunque la disposición genética y exposición a sustancias tóxicas se conocen las causas de esta enfermedad en aproximadamente un tercio de los pacientes, el origen de DCM sigue siendo en gran medida poco clara. En un número importante de estos pacientes, los autoanticuerpos dirigidos contra epítopos cardíacas se ha detectado y se sospecha que juegan un papel central en la aparición y progresión de la enfermedad de 2,3. La importancia de autoanticuerpos cardiacas está subrayado por una mejoría hemodinámica en pacientes DCM después de la eliminación de autoanticuerpos por inmunoadsorción 3-5. Una variedad de antígenos específicos ya se han identificado 2,3 y anticuerpos contra estos objetivos se pueden detectar mediante inmunoensayos. Sin embargo, estos ensayos no pueden discriminar entre la estimulación (y, por tanto funcionalmente eficaz) y el bloqueo de los autoanticuerpos. Existen cada vez más evidence que esta distinción es crucial 6,7. También se puede suponer que los objetivos para un número de anticuerpos cardiotrópicos están aún sin identificar y por lo tanto no se puede detectar por inmunoensayos. Por lo tanto, se estableció un método para la detección de anticuerpos funcionalmente activos cardiotrópicos, independientemente de su antígeno respectivo. El fondo para el método es la alta homología generalmente observado para las regiones funcionales de las proteínas cardiacas en mamíferos entre 8,9. Esto sugiere que los anticuerpos dirigidos contra los antígenos cardíacos humanos se reacciona de forma cruzada con las células diana no humanos, lo que permite las pruebas de IgG de pacientes con MCD en cardiomiocitos de ratas adultas. Nuestro método consta de 3 etapas: primero, la IgG es aislada del plasma del paciente utilizando sefarosa acoplados anti-IgG de anticuerpos obtenidos a partir de columnas de inmunoadsorción (PlasmaSelect, Teterow, Alemania). Segundo, los cardiomiocitos adultos son aislados por perfusión de colagenasa en un aparato de perfusión de Langendorff utilizando aprotocolo modificado a partir de trabajos previos 10,11. Los cardiomiocitos obtenidos se adjuntan a la laminina cubreobjetos recubiertos de cámara y se tiñeron con Fura-2, un tinte fluorescente de calcio selectivo que puede ser fácilmente llevado en la célula para observar el calcio intracelular (Ca 2 +) contenidos 12. En el último paso, el efecto de la paciente IgG en el acortamiento celular y Ca 2 + transitorios de cardiomiocitos de campo estimuladas se monitoriza en línea utilizando una cálcico comercial miocitos y contractilidad sistema de monitorización (IonOptix, Milton, MA, EE.UU.), conectado a un fluorescente típica inversa microscopio.
Protocol
1. IgG aislamiento de muestras de pacientes
- Preparar mini-inmunoadsorción columnas de relleno 3 ml de anti-IgG sepharose por 2 ml de plasma EDTA paciente en una columna vacía Econo Pac. IgG aislamiento requiere al menos 2 ml de plasma del paciente.
- Colocar un filtro en la parte superior de la sefarosa anti-IgG, corte la punta inferior de la columna y pulse el filtro para alcanzar una velocidad de flujo de aproximadamente 1 gota / seg. Que la solución de preservación correr fuera de la columna.
- Lavar la columna con 3 volúmenes de NaCl al 0,9% por volumen de plasma.
- Pipetear el plasma en la columna. Cuando el plasma ha completamente sumergido en la sefarosa anti-IgG, se lava con el mismo volumen de 0,9% de NaCl.
- Pipetear un plasma de volumen de HCl 0,2 M glicina, pH 2,8 en la columna y dejar que sumerja en la sefarosa. Añadir otro volumen de glicina HCl en la columna. Recoger el flujo a través de un tubo de 15 ml y ajustar el pH a 7,3 con 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0.
- Para regenerar la columna, Se lava con 3 volúmenes de HCl plasma glicina. Después de un lavado final con 2 volúmenes de NaCl al 0,9%, la columna se puede utilizar para la siguiente muestra de plasma. Alternativamente, la columna puede ser llenado con solución de preservación y se almacenó a 4 - 8 ° C durante un máximo de 4 semanas.
- Para el uso en los cardiomiocitos, la fracción recogida IgG tiene que ser dializado frente a tampón experimental (EB). Para la preparación de EB, añadir 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM de MgCl 2, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM de HEPES y 20 mM de glucosa a 1 l de agua destilada en un agitador magnético y ajustar el pH a 7,3.
- Llene la fracción IgG a un tubo de éster de celulosa membrana de diálisis con un corte de peso molecular de 100 kDa. Poner el tubo en L EB 1 y se agita lentamente con un agitador magnético a 4 ° C. Después de 8 horas, transferir el tubo de diálisis en 3 L de EB fresco y dializar para otro hr 20 a 4 º C.
- Después de la diálisis, el calor de la muestra durante 30 min a 57 ° C en un baño de agua a inactivatfactores e complemento. Determinar la concentración total de IgG y preparar alícuotas que contienen 330 mg cada IgG. Cuando se añade a la muestra para la medición de los cardiomiocitos (paso 4,3), llenar las alícuotas de 1 ml con EB. Alícuotas diluidas se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior.
2. Aislamiento de cardiomiocitos de rata
- Para la preparación de Ca 2 +-libre tampón de aislamiento (IB), añadir 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES y 11 mM de glucosa a 1 l de agua destilada usando un magnética agitador. Ajustar el pH a 7,4 a temperatura ambiente y se filtra a través de un filtro de 0,2 micras superior botella para la esterilización.
- Completa 80 ml de IB en el depósito superior de un sistema de perfusión Langendorff termostatizada. Ajustar la configuración del termostato para mantener una temperatura de amortiguamiento de 37 ° C y airear buffer con% O 95 2/5% CO 2 durante 30 min.
- Pesar aproximadamente 10.000 - 12.000 U de collagENasa tipo II, 175 mg de BSA libre de ácidos grasos y se disuelven en 20 ml que contenían IB 22,5 l de una solución madre 100 mM de CaCl 2. Controlar el pH del tampón de aislamiento en el depósito superior y ajuste si es necesario.
- Anestesiar una rata Wistar de 175 a 200 g con 375 mg / kg de tiopental peso corporal. Añadir 2500 UI de heparina a la solución de tiopental. Después de toracotomía, extirpar el corazón con cuidado con un arco aórtico intactos y la transfiere en helado 0,9% NaCl. Limpiar el corazón de la sangre y el tejido circundante y la transferencia a fresco 0,9% de NaCl. Exponer la aorta, abrir el reductor de flujo del sistema de Langendorff para obtener una velocidad de goteo de 2-3/sec y adjuntar el corazón a la cánula.
- Perfundir el corazón durante un máximo de 3 min con una velocidad de flujo de 1 gota / seg para lavar la sangre restante. Empieza a circular el IB en el sistema de Langendorff. Eliminar 20 ml de tampón desde el depósito superior, llenar en la solución de colagenasa y vuelva a llenar como tampón tanto como sea necesario para llegar a 80 ml. Circular el c ollagenase solución para otro 27 min. Tasa de flujo debe ser controlado periódicamente y se mantuvo a 1 gota / segundo utilizando el reductor de flujo.
- Separe el corazón de la cánula, limpio de aurículas y aorta y cortar en trozos pequeños. Deje que la solución de colagenasa a ejecutar en el depósito inferior, baje el volumen a un máximo de 40 ml y aún más digerir los ventrículos picadas durante 10 - 15 minutos con aireación continua con un 95% de O 2/5% CO 2. Después, se filtra la suspensión celular a través de una gasa de tamaño de malla de 200 micras en un tubo de 50 ml.
- Restaurar la Ca 2 + contenido de las células en 3 pasos: centrifugar la suspensión celular a 43 xg durante 2 min a temperatura ambiente y se resuspenden las células en 10 ml que contenían IB 200 mM de CaCl 2. Centrifugar de nuevo y resuspender las células en 10 ml de IB con 500 mM de CaCl 2. Después de una centrifugación final resuspender cardiomiocitos en EB filtrado estéril (ver 1,8) a una densidad de 50.000 células / ml.
- Cubra un cubreobjetos 4 bien calibrada con laminina mg 10 por pocillo y espere hasta que esté completamente seca.
- Llenar 1 ml de la suspensión de cardiomiocitos en cada pocillo utilizando una micropipeta con punta de corte. Permitir que las células se adhieran durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Diluir 10 l de la 1 mg / ml Fura-2 AM solución madre en 5 ml EB. Mantener la solución de tinción en la oscuridad.
- Despegar las células de amortiguamiento y no unida de que el cubreobjetos y la pipeta 0,5 ml de la solución de tinción en cada pocillo. Incuban las células durante 10 min bajo agitación moderada. A continuación, retire la solución colorante, lavar las células una vez con 1 ml EB y finalmente llenar EB 0,5 ml en cada pocillo. Evite la luz directa durante el proceso de tinción y siempre mantener las células teñidas en la oscuridad.
4. Grabación de acortamiento celular y Ca 2 + transitorios
- Coloque el cubreobjetos cámaras en una inversa m fluorescenciaicroscope conectado a un miocito calcio y sistema de grabación de la contractilidad. Coloque un electrodo de encargo con una afluencia y el tubo de flujo de salida en el primer pocillo. Cardiomiocitos Superfuse con 1 ml / min EB y comenzar la estimulación eléctrica (20 V, 1 Hz, 5 ms de duración). Permitir que las células de adaptación a la estimulación por alrededor de 2 min.
- Elija una barra de cardiomiocitos en forma intacta con estrías claras y contracción constante. Posición de la celda en el centro del campo visual y abrir el canal de la cámara. Orientar la celda horizontalmente dentro del área de vídeo mediante la rotación del adaptador de encuadre celular y moviendo la platina del microscopio.
- Ajuste el borde detectar elementos de control del área de vídeo (Figura 2), abrir el canal fluorescente y registro 10 a 15 contracciones para obtener el acortamiento celular inicial y Ca 2 + transitorios.
- Cierre el canal de luz microscopio para evitar la decoloración de la fluorescencia de la mancha. Cambie el flujo a través de EB a la muestraderivación con una válvula de 3-vías y cardiomiocitos superfuse con 1 ml de IgG paciente. Parar la bomba justo antes de aire alcanza el pozo.
- Abrir el canal de luz y grabar otro 10 a 15 contracciones para obtener la respuesta aguda de células. Haga una pausa la grabación y cerrar el canal de luz de nuevo. Repita la grabación después de 2 y 5 min.
- Sacar el electrodo del pozo. Limpiar bien los tubos con EB y continuar con el próximo pozo del cubreobjetos cámaras.
- Analizar el acortamiento celular y Ca 2 + transitorios con el software IonWizard utilizando el "Edge-Length/Length" y el "Fura 2-numérico resta / Ratio" de la ventana, respectivamente. Calcular el porcentaje de cambio desde el acortamiento celular inicial y Ca 2 + transitorios de la altura del pico se refiere a la línea de base (BL% pico h) para el agudo, el 2 min y la respuesta de 5 min.
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Representative Results
Dos ejemplos para la medición de inotropıa celular estimulada en campo cardiomiocitos adultos (Figura 2) utilizando un miocitos Ca 2 + y sistema de grabación de la contractilidad se dan a continuación. Figura 3 da una impresión de una medición de control, mientras que en la figura 4 el efecto de los anticuerpos cardiodepressive de un paciente con DCM se muestra.
En ambos ejemplos, el acortamiento celular inicial y Ca 2 + transitorios durante superfusión con EB exhibir picos claros y constante, que es un requisito previo para el análisis. Sabemos por experiencia que las células que presentan un primer pico h bl% en el rango de 7 - 14% mejor traje para nuestra aplicación, mientras que los cardiomiocitos con mayor o menor contractilidad inicial a menudo tienden a presentar cambios provocados de acortamiento celular. Después de la aplicación de IgG de control, es decir, IgG aislada de los sujetos control sanos, inotropıa de cardiomiocitos permanece uncambiado largo de toda la medición (Figura 3A). En contraste, superfusión con IgG que contiene anticuerpos cardiodepressive es seguido por una disminución de acortamiento celular (Figura 4A), acompañado de una reducción Ca 2 + transitorios que normalmente es menos pronunciada (Figura 4B). Por lo general, observamos que un nuevo estado de equilibrio se establece por tanto acortamiento celular, y Ca 2 + transitorios, después de 2 min que se conserva hasta el final de la medición después de 5 min. El ejemplo muestra un efecto inotrópico negativo muy claro con una disminución del acortamiento celular en un 54% y la de Ca 2 + transitorios en un 31% después de 5 min. Sin embargo, los cambios son a menudo menos pronunciada. Por lo tanto, se define un límite superior e inferior para efecto inotrópico negativo y positivo como media ± 2SD para el control de IgG de un grupo de control sano para evitar resultados falsos positivos. En consecuencia, las células sólo se consideran como inotrópico negativo o positivo wcambios de gallina de acortamiento celular sobrepasar este umbral, que se determinó en aproximadamente ± 10%.
Figura 1. Diagrama de flujo de detección de autoanticuerpos mediante la medición de la contractilidad cardiomiocitos. Primero, IgG es extraído de las muestras de pacientes con anti-IgG sepharose columnas (resaltadas en amarillo). En segundo lugar, los cardiomiocitos están aisladas de corazones de rata mediante digestión enzimática y se tiñeron con Fura-2 (resaltado en azul). Por último, el acortamiento celular y Ca 2 + transitorios son monitoreadas en línea mediante un sistema de calcio miocitos y la contractilidad de grabación (resaltado en verde).
Figura 2. Cardiomiocitos aislados de rata posicionada en el área de vídeo de la contractilidad del sistema de grabación de los miocitos. El gráfico debajo de la celda muestra las trazas intensidad calculada utilizados para la detección de bordes. Las flechas indican la detección de bordes elementos de control. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 3. Ejemplo representativo de una medición de control. Acortamiento celular (A) y Ca 2 + transitorios (B) se monitorizó en línea antes (inicial), inmediatamente (aguda), 2 min y 5 min después de superfusión con IgG. Las líneas rojas indican una pausa de la medición.
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Figura 4. Ejemplo de medición de una muestra que contiene anticuerpos IgG cardiodepressive. Acortamiento celular (A) y Ca 2 + transitorios (B) se midió en línea antes (inicial), inmediatamente (aguda), 2 min y 5 min después de superfusión con IgG. Las líneas rojas indican una pausa de la medición.
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Discussion
El método que se presenta ofrece una forma adecuada para detectar autoanticuerpos funcionales cardíacos efectivos en pacientes con MCD de origen incierto. En comparación con otros métodos, por ejemplo, la detección de anticuerpos funcionales activos contra la β1-adrenoceptor por su impacto en los niveles de AMPc 6, nuestro método es independiente de un epítopo específico. Por supuesto, hay otros ensayos de epítopos independientes descritos en la literatura, es decir, la tasa de recuento de golpes de cardiomiocitos neonatales 13, la medición de las corrientes de calcio en cardiomiocitos adultos mediante la técnica de patch clamp o la contractilidad de las fibras de Purkinje 14 aislados. En ventaja de estos métodos, el ensayo que aquí se presenta es menos tiempo y proporciona mayor objetividad debido al protocolo estandarizado. Además, permite detectar el impacto sobre la contractilidad y los transitorios de calcio intracelular al mismo tiempo.
Al igual que en otella en ensayos in vitro, los resultados obtenidos con el método presentado puede ser desafiado por las condiciones artificiales aplicadas a las células. Cultivadas de cardiomiocitos de rata neonatal se informó para unir preferentemente entre micropilares con una distancia de 30 micras o menos que en sustratos planos. Cuando se acopla a este último, las células se encontraron para mostrar las fibras de estrés de actina y desordenadas miofibras 15. Sin embargo, el impacto potencial de las fibras de estrés en el ensayo de la contractilidad descrito aquí puede ser insignificante desde cardiomiocitos adultos sólo se cultivaron durante un período de tiempo muy corto de hasta 6 horas, que puede reducir la formación de tales fibras y el acortamiento celular y Ca 2 + transitorios se hace referencia a la capacidad de contracción inicial de la celda respectiva para minimizar la influencia de las diferencias individuales entre las células. Otra limitación es la alta demanda de animales de experimentación y tiempo. Por lo tanto el método no es adecuado para el cribado de alto rendimiento de patipadres.
Otras implementaciones son concebibles para el método. Debido a la independencia de antígeno se puede aplicar a otras enfermedades idiopáticas cardiovasculares, donde se asume que un impacto autoinmune.
Además, las mediciones de contractilidad se puede ajustar fácilmente para estudiar los efectos funcionales de otras sustancias. Esto permite el análisis de un impacto potencial de los fármacos en el corazón, que puede ser por ejemplo beneficioso en el desarrollo de fármacos y pruebas. Además de los parámetros básicos proporcionados por los cambios de acortamiento celular y Ca 2 + de la línea de base, la información adicional puede ser obtenido de las mediciones que permite una definición más detallada del efecto observado. Por ejemplo, la salida y la velocidad de retorno puede ser calculada a partir de los acontecimientos celulares acortamiento que podrían indicar un efecto sistólica y diastólica específico de un medicamento o anticuerpo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el TransRegio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), el Ministerio Federal de Economía y Tecnología proyecto 2727801MD0 ZIM-KF y el Centro de Competencia de Innovación - la respuesta inmune humoral en Enfermedades Cardiovasculares ( ZIK-caminata, BMBF FKZ 03Z2CN12) del Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania. Vivienda y experimentos con animales se realizaron de conformidad con las recomendaciones de la Sociedad de Ciencia Animal de Laboratorio (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) y la Federación Europea de Ciencia Animal de Laboratorio (Asociación FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
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