Summary
一种称为
Abstract
植物细胞壁复杂的异构聚糖在生理和植物的发展，并发挥了重要作用，提供原料，为人类社会（ 如木材，造纸，纺织，生物燃料行业）1,2矩阵。然而，这些成分的生物合成和功能的了解仍然充满挑战。
细胞壁聚糖的化学性质和构象不同的复杂的构建块，糖基。这些形式在多个位置之间的联系，并在环结构的不同，同分异构体或端基异构体的配置，此外，被取代的与非糖残基的一个数组。糖基组合物在不同的细胞和/或组织类型或什至单个单元格的壁3的子域变化。此外，它们的组合物1在开发过程中，或在响应于环境线索4也被修改。
在EX制程的2000基因植物细胞壁异构聚糖被预测要参与细胞壁聚糖的生物合成和修改在拟南芥 5是复杂的矩阵。然而，相对较少的生物合成基因功能特点4,5。反向遗传学方法是困难的，因为基因通常差异表达，往往在低的水平，细胞类型之间的6。此外，突变体的研究往往阻碍了的基因冗余或代偿机制，以确保适当的细胞壁功能是保持7。因此，新的方法，需要迅速表征各种不同的聚糖结构和功能基因组学的方法，以方便了解细胞壁的生物合成和修改。
单克隆抗体（mAb）8,9已成为确定在植物中的糖链结构和分布的重要工具。这些识别区INCT抗原表位存在于植物细胞壁聚糖的主要类别，包括的果胶，xyloglucans，木聚糖，甘露聚糖，葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖。最近，他们的使用已经扩展到大规模筛选实验，以确定相对丰富的多聚糖广泛的厂房及组织类型，同时9,10,11。
在这里，我们提出了一种基于微阵列聚糖的检查方法，使多个样本的全面的微阵列名聚合物的分析（CoMPP）（ 图1和图2）10,11（100秒）进行筛选，使用小型化的芯片平台，减少了试剂和样品量。在微阵列上的点信号可以正式量化约聚糖抗原表位发生，得到半定量数据。这种方法非常适合于跟踪聚糖变化的复杂的生物系统12，并提供一个全球细胞壁的组合物的概述，特别是当先验知识òF这是不可用。
Protocol
1。组织收集和准备
- 收集100毫克植物组织的鲜重（至少10 mg干重）的至少一式三份的每个组织的利益。以下步骤描述了从植物组织中的细胞壁物质的准备。在存储组织的情况下，不想要的淀粉酶进行提取细胞壁聚合物如先前所述13之前除去。
- 均质化样品使用Qiagen公司的TissueLyser II，24管适配器集和3毫米的碳化钨珠（30赫兹，2×30秒），用液氮成细粉。或者，如果只有少数样本正在处理中，使用研钵和杵。
- 匀浆转移到10 ml塑料锥形管。
- 准备细胞壁材料洗涤匀浆在10毫升80％v / v乙醇在RT和涡旋大力，持续2分钟。
- 在3500 XG离心样品，弃去上清液。重复的70％乙醇洗涤至少3次，或直到上清液是清楚的，特别是对于含叶绿素的组织。
- 执行最终用100％丙酮洗涤和离开的粒料含有酒精不溶残留量（AIR）空气干燥过夜。
- 筛为0.4毫米2目，实现了精细，均匀粉末，能够去除较大，不良一段时间保持匀浆中的颗粒的空气样品。
- 称取10毫克AIR范例成微管，每个都包含一个3毫米的玻璃珠以帮助混合样品。
2。细胞壁聚糖的提取
- 从样品中提取的果胶，和与果胶的聚合物由向每个样品中加入500微升50μM的CDTA（pH为7.5）。
- 简言之涡管，以确保溶剂是在与样品材料接触，然后混合3小时8赫兹TissueLyser使用。
- 以12,000 xg离心样品，仔细ŕemove上清并储存在4°C
- 洗净粒料在1毫升的去离子水，以稀释和除去任何剩余的溶剂，旋涡和在13000×g下离心。重复此步骤，而不会干扰颗粒，并删除所有的液体从管，然后再进行下一个步骤。
- 从其它细胞壁颗粒的交联聚糖中依次提取用500μl的4M的NaOH，用0.1％w / v的硼氢化钠，使用相同的程序中描述的步骤2.1 - 2.4的CDTA提取。加入NaBH 4被添加到减少的醛（或酮）基团的多糖的还原性末端的醇，从而防止基多糖的剥离。
- 离心后，再次除去上清液，在4℃下储存，并继续到下一个提取之前，该颗粒在去离子水洗涤两次。
- 作为一个可选步骤，剩余的聚合物，如纤维素，用500μlcadoxen（31％体积/体积1,2-diami萃取noethane与CdO的0.78米），使用相同的程序中描述的步骤2.1 - 2.4。或者，其它粒料绝对纤维素含量可确定使用乙酸/硝酸法（见讨论）。
3。印刷微阵列
- 在13000 XG离心上清液中提取的细胞壁聚合物，以去除任何颗粒物质。
- 将每个样品的50微升到聚丙烯384孔微量滴定板使用一个预先设计的自定义布局根据组织类型和提取类型的样品被布置。
- 在0，5和25×串行系列稀释液，用去离子水稀释的细胞壁聚合物样品。
- 如针高度，收集和停留时间，和洗涤步骤的参数设置的软件控制的微阵列上。
- 印刷室的湿度控制在60％，以防止样品的蒸发。
- 被开始使用LabNEXT软件，打印作业re和一个程序，它对应于微阵列布局。
- 机器人使用的毛细通道引脚，20×20厘米的硝酸纤维素膜在机器，其安装在一平板，从样品板到打印的解决方案。在阵列上的每个点包含15个NL解决方案，并打印一式三份。
- 相同的微阵列上的膜和切成单个阵列彼此相邻的印刷后的打印作业完成后。
- 在每个实验中的阵列可以被修改，以容纳更多或更少的样品，稀释或复制。
4。聚糖微阵列技术探讨
- 印刷后，阻止个别芯片在5％w / v的脱脂奶粉溶解于磷酸盐缓冲盐水（MPBS），在室温下2小时，以减少非特异性结合。
- 与细胞壁聚糖抗原决定簇特异的单克隆抗体2小时，在MPBS探针微阵列。的大多数单克隆antib的对细胞壁聚糖odies是从三个公司市售; Biosupplies（ www.biosupplies.com.au ），Carbosource服务（ www.carbosource.net ）和PlantProbes（ www.plantprobes.net ）。
- 包含一个阴性对照，仅MPBS没有主抗体孵育的微阵列。
- 微阵列洗净3次，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）5分钟，以除去非特异性结合。
- 探测芯片与二次抗体结合到辣根过氧化物酶（HRP）在2小时的MPBS。对细胞壁聚糖需要大多数单克隆抗体抗小鼠或抗大鼠二次抗体。
- 重复3次，用PBS缓冲液中5分钟的洗涤步骤，以除去非特异性结合。
- 开发微阵列使用显色（3,3 - 二氨基联苯胺）或切米尔uminecent（鲁米诺）基板。
5。量化
- 经过发展，个人微阵列采用了高解析度（1200 dpi）的桌面扫描仪扫描并保存图像为负，16位TIFF文件（ 图3）。
- 计算Xplore数据库图像处理软件（LabNEXT），配有自动网格工具使用的每一个点的积分强度。积分光斑强度来自周围各点的格子区域中的像素的总和。
- 每个芯片的网格数据导出为txt文件，并可以手动导入到Excel电子表格进行分析。在线的工具（ http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ）已被自动翻译和处理从单个txt文件中的数据。
- 的积分光斑强度的平均印刷复制和稀释以获得一个“平均的点对每个样品的强度的值（ 图2）。可选地，对应于阵列上的值只是一个稀释的点信号是用来量化聚糖抗原表位相对丰度对每个样品。
- 平均相对强度不同样品之间的点作为热图（ 图4），使用条件格式在Excel或网上的heatmapper的工具（ http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ）。对每个抗体类型的数据被校正到100，和5％的临界值被施加来去除背景信号和误报。
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Representative Results
的相对丰度聚糖在烟草阿拉塔花6个类型的组织（花药的花丝，花粉，子房，花瓣，萼片和耻辱）被确定使用CoMPP。图3A示出了有代表性的微阵列已与mAb JIM5部分（低）的甲基酯化homogalacturonan（HG），果胶多糖14上发生的表位特异的探测。 CDTA提取物中检测到的所有花组织JIM5表位不过是最高的，在花粉和最低的柱头组织（ 图3A和4A）。有趣的是，JIM5表位也检测到在NaOH在花粉提取物，但不是在其它组织中（ 图3A）。
发生利益聚糖的定量信息在内的一系列内部标准的芯片（ 图3B）纯化多糖。积分点强度的提取物不同的t与mAb JIM5探测的问题相匹配来自串行稀释homogalacturonan（25％的甲基酯化程度，DE）的当场信号。在卵巢组织中，约157微克homogalacturonan含有JIM5表位是在每个样品中存在的，占约1.5％（按重量计）的总细胞壁的残基（ 图3C）。鉴于625的微克homogalacturonan含有的JIM5表位本在花粉组织，约占总细胞壁残基约6.25％（按重量计）。
15聚糖抗原表位的相对丰度总结为图4的热图中，彩条的强度成比例的调整对每个样品的平均光斑强度。此数据的图形表示在图5中还示出，使我们能够迅速解释聚糖抗原决定簇发生的不同花束组织之间的差异。
ontent“>我们的研究结果表明，个别聚糖的抗原决定簇是唯一分派N.阿拉塔花组织的，例如，在花药长丝和萼片组织LM13抗原表位（线性化（1-5）-α-L-阿拉伯糖15）是最丰富的相比其他组织（ 图5D）。此模式是短链（1-5）-α-L-阿拉伯糖表位优先检测到的由单克隆抗体LM6（ 图5E）15。十字联聚糖形成鲜明的对比也有明显的模式的发生在N.阿拉塔鲜花。LM10表位（低取代（1-4）-β-D-木聚糖）是丰富的组织与其它组织相比在柱头，但不存在从卵巢组织（ 图5G）。LM15花瓣和花药灯丝相比其他组织（ 图5H）中的xyloglycan表位是最高的，而heteromannans最高花药丝（ 图5J）。图1的简化流程图，代表五个关键步骤的综合微阵列聚合物的分析（CoMPP）。
图2说明的综合微阵列聚合物的分析（CoMPP）的关键步骤。 （A）的植物组织被收集为三个重复，匀化，并在70％乙醇和丙酮，使醇不溶性残余物（AIR）洗涤。 （B）中依次提取细胞壁聚糖从AIR样品用50mM CDTA和4M氢氧化钠。 （C）提取细胞壁聚糖是印在硝化纤维，使用微阵列机器人。每个样品上表示它的三个浓度和作为一系列的四个印刷副本工商业污水附加费。 （D）的印刷阵列分别与向细胞壁聚糖抗原表位的单克隆抗体被探测。 （E）的点信号进行量化，利用微阵列成像软件，导出为txt文件，并相对平均现货强度值自动计算使用在线数据处理工具。
图3。糖基分析烟草阿拉塔花组织。 （A）A的代表基因芯片检测单克隆抗体（mAb）homogalacturonan（JIM5特定部分，低甲酯化）表示为负，16位TIFF文件。 （B）含有糖链抗原表位的多糖的利益，可以量化的打印一系列的多糖标准。 （C）积分点强度利益的样品检测的单克隆抗体JIM5计算和相匹配的标准曲线来估算样品中包含该表位的量（微克）的多糖。
图4。糖基烟草阿拉塔花组织的代表作为热图分析。的颜色强度的相对平均点标识值（比例尺）成正比。 15聚糖检测单克隆抗体（从顶部列出）的抗原决定簇的相对丰度，分析6提取的组织类型与CDTA和NaOH（左手侧）。糖链抗原表位分为三大类多糖，果胶，交联聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPS）。我，甲基酯化; DP，聚合度;单克隆抗体，单克隆抗体，AGP，阿拉伯半乳聚糖蛋白。
图5。糖基分析的烟草阿拉塔花组织的代表形象地。 AL 12聚糖抗原决定簇的单克隆抗体检测在不同的花组织的相对丰度。该标尺条的颜色强度来自任CDTA或NaOH提取物或这两者的总和的相对平均点标识值是成比例的。我，甲基酯化，聚合度DP，单克隆抗体，单克隆抗体，AGP，阿拉伯半乳聚糖蛋白。 点击此处查看大图 。
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Discussion
分析的聚糖组成的数百植物性样品在短短几天内，CoMPP是一种快速，灵敏的方法。此方法的补充已经可用的细菌或哺乳动物聚糖阵列平台与多糖结合的蛋白质，如外源凝集素，受体，和抗体16的碳水化合物的相互作用的高通量筛选。随着多样性的探头可用于检测细胞壁聚糖，它有可能获得糖链抗原表位属于多糖在植物细胞壁8,9的所有主要类别的详细信息。然而，这些已查明的8,9的聚糖结构只包括一小部分，并在某些情况下，限制CoMPP可理解性。尽管如此，这种能力最近已被延长对植物聚糖17使用碳水化合物结合模块（CBMS），并且还针对其特征在于非糖基水库的抗原表位idues如酚醛树脂18和修改的糖基残基的乙酰基残基19和聚糖功能中发挥重要的作用。
，虽然CoMPP确定聚糖跨越一组样品的相对水平，它是可能在连续的提取物，通过比较已知的标准（ 图3B和C）在特定样品的结合信号量化的抗原表位的水平。尽管减少样本量的优势，在一个以芯片为基础的平台，能够准确地量化聚糖发生而受到影响现货形态或现场信号的饱和度的差异。这些问题（以及误报）避免通过优化细胞壁材料经文萃取剂体积的量，在分析之前，并包括一系列的复制和稀释如这里和在哺乳动物聚糖阵列方法16概述。此外，在现场形态的差异（样品扩散所造成的以不同的速率从接触点）是可以克服的，通过使用非接触式的喷墨芯片技术16。
CoMPP用于组合细胞壁20用于分离和制备的既定程序。它也可以并行使用，与现有的生化，酶和物理方法获得聚糖样品中感兴趣的内容的进一步的信息。对于提取的纤维素聚合物，醋酸/硝酸检测实例，而不是20可以用来量化后剩余的连续提取的果胶和交联的多聚糖与CDTA和NaOH的纤维素含量（mg）。聚糖微阵列的酶处理21还可以进一步揭示聚糖抗原决定簇之间的样本分布的差异，或确认的芯片上检测到的特异性抗原表位的结构。由独立的分析技术，如那些最近描述聚糖组合物的测定 我们证明聚糖分布在特定的器官或组织的方式，N.阿拉塔花。此信息可以给洞察聚糖抗原决定簇或聚糖合成或修改在这些不同类型的细胞中存在的酶的生物学功能。 CoMPP曾提供了深入细胞壁的改变发生在有关植物在开发过程中23,24或22型突变10,25。总之，CoMPP的是一个有价值的工具聚糖聚糖在植物细胞壁的合成和修饰基因研究不同的角色。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
IEM要感谢丹麦研究委员会（FTP和FNU）的资金。 ERL承认ARC DP授予的支持。 AB承认在细胞壁上授予优秀的ARC中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
