Summary
Eine Technik namens
Abstract
Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane, die eine wichtige Rolle in der Physiologie und Entwicklung von Pflanzen spielen und die Rohstoffe für menschliche Gesellschaften (zB Holz, Papier, Textil-und Biokraftstoff-Industrie) 1,2. Das Verständnis der Biosynthese und Funktion dieser Komponenten bleibt eine Herausforderung.
Zellwand Glycane sind chemisch und konformativ vielfältigen aufgrund der Komplexität ihrer Bausteine, die Glycosylreste. Diese Form Bindungen an mehreren Positionen unterscheiden sich in Ringstruktur, isomerer oder anomeren Konfiguration, und darüber hinaus werden mit einer Anordnung von nicht-substituierten Zuckerreste. Glycan Zusammensetzung variiert in verschiedenen Zell-und / oder Gewebetypen oder sogar Sub-Domänen eines einzelnen Zellwand 3. Außerdem ist deren Zusammensetzung auch während der Entwicklung ein, oder in Reaktion auf Umweltreize 4 modifiziert.
In exProzess von 2.000 Gene Pflanzliche Zellwände sind komplexe Matrizen von heterogenen Glykane wird vorausgesagt, dass in der Zellwand Glykan Biosynthese und Modifikation in Arabidopsis 5 einbezogen werden. Jedoch haben relativ wenige der biosynthetischen Gene funktionell charakterisiert 4,5. Reversen Genetik Ansätze sind schwierig, da die Gene oft differentiell exprimiert werden, oft in geringen Konzentrationen, zwischen Zelltypen 6. Außerdem sind mutierte Studien oft durch Gen-Redundanz oder kompensatorische Mechanismen behindert zur Gewährleistung einer angemessenen Zellwand Funktion 7 wird beibehalten. So neuartige Ansätze sind nötig, um schnell prägen die vielfältige Palette von Glykanstrukturen und funktionelle Genomik Ansätze zum Verständnis der Zellwandbiosynthese und Modifikation zu erleichtern.
Monoklonale Antikörper (mAbs) 8,9 haben als ein wichtiges Instrument zur Bestimmung Glykan Struktur und Verteilung in Pflanzen entstanden. Diese erkennen distINCT Epitope in die Hauptklassen der pflanzlichen Zellwand Glykane, darunter Pektine, Xyloglucanen, Xylane, Mannane, Glucane und Arabinogalactane. Kürzlich ist ihre Verwendung im großen Maßstab Screening-Experimenten wurde erweitert, um die relative Häufigkeit von Glykanen in einer breiten Palette von Pflanzen-und Gewebetypen gleichzeitig 9,10,11 bestimmen.
Hier präsentieren wir eine Microarray-basierte Glykan Screening-Methode aufgerufen Umfassende Microarray Polymer Profiling (Kompp) (Abbildungen 1 und 2) 10,11, die mehrere Proben ermöglicht (100 Sek.) gescreent unter Verwendung einer miniaturisierten Microarray-Plattform mit reduzierter Reagenz-und Probenmengen werden. Die Spot-Signale auf dem Mikroarray kann formal quantifiziert werden, um semi-quantitative Daten über Glykan Epitop Auftreten zu geben. Dieser Ansatz wird auch zur Verfolgung Glykan Veränderungen in komplexen biologischen Systemen 12 und bietet einen umfassenden Überblick der Zellwand Zusammensetzung geeignet vor allem, wenn Vorkenntnisse of ist nicht verfügbar.
Protocol
Ein. Tissue Collection & Vorbereitung
- Sammeln Sie 100 mg Frischgewicht Pflanzengewebe (ein Minimum von 10 mg Trockengewicht) in mindestens dreifacher Ausfertigung für jedes Gewebe von Interesse. Die folgenden Schritte beschreiben die Herstellung der Zellwand Material aus vegetativen Geweben. Im Falle der Lagerung Gewebe wird un-wanted Stärke enzymatisch, bevor mit der Extraktion von Zellwandpolymere wie zuvor beschrieben 13 entfernt.
- Homogenisierung der Proben zu einem feinen Pulver mit flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Qiagen TissueLyser II, mit 24 Rohradapter Sets und 3 mm Wolframcarbid Kügelchen (30 Hz, 2 x 30 Sekunden). Alternativ, wenn nur wenige Proben verarbeitet werden, ist ein Mörser und Stößel genutzt.
- Übertragen Sie die Homogenate in 10 ml Kunststoff-konische Röhrchen.
- Planen Zellwandmaterial durch Waschen der Homogenate in 10 ml 80% v / v Ethanol bei RT und Vortexen kräftig für 2 min.
- Zentrifuge Proben bei 3.500 xg und Überstand verwerfen. Wiederholen der 70% Ethanol wäscht mindestens dreimal oder bis der Überstand klar ist, insbesondere für Gewebe enthalten Chlorophyll.
- Führen Sie eine letzte Wäsche mit 100% Aceton und lassen Sie die Pellets mit Alkohol unlöslichen Rückständen (AIR) an der Luft trocknen über Nacht.
- Die Luftproben Sieb mit einer Maschenweite 0,4 mm 2, um ein feines, homogenes Pulver zu erreichen und zu entfernen größeren, schlecht gemahlenen Partikel, die irgendwann verbleiben im Homogenat.
- 10 mg wiegen AIR Probe in Mikroröhrchen auf, jeweils mit einem 3 mm Glasperlen, um das Mischen der Proben zu erleichtern.
2. Extraktion von Zellwand Glykane
- Pektinen, und Polymere mit Pektine zugeordnet sind, aus den Proben durch Zugabe von 500 ul 50 uM CDTA (pH 7,5) zu jeder Probe extrahiert.
- Vortexen die Rohre zu gewährleisten, ist das Lösungsmittel in Kontakt mit dem Probenmaterial und dann Mischen mit der TissueLyser 3 h bei 8 Hz.
- Zentrifuge Proben bei 12.000 xg, sorgfältig reMove der Überstände und bei 4 ° C.
- Waschen Pellets in 1 ml deionisiertem Wasser zu verdünnen und entfernen Sie alle verbleibenden Lösungsmittel, Wirbel und Zentrifuge bei 13.000 x g. Wiederholen Sie diesen Schritt, ohne das Pellet und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit aus den Rohren, bevor Sie den nächsten Schritt.
- Vernetzen Glycane werden sequentiell von der verbleibenden Zellwand Pellet mit 500 ul 4 M NaOH extrahiert mit 0,1% w / v NaBH4, nach dem gleichen Verfahren in den Schritten 2.1 beschrieben - 2,4 für die Extraktion CDTA. NaBH 4 zugegeben, um den Aldehyd (oder Keto)-Gruppe am reduzierenden Ende der Polysaccharide zu einer Alkohol wodurch Basis Schälen von Polysacchariden zu reduzieren.
- Nach Zentrifugation werden Überstände wieder entfernt, gelagert bei 4 ° C, und die Pellets zweimal in deionisiertem Wasser, bevor zum nächsten Extraktion.
- Als optionaler Schritt werden restliche Polymere wie Cellulose mit 500 ul cadoxen (31% v / v 1,2-diamin extrahiertennoethane mit 0,78 M CdO) nach dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.1 beschrieben - 2.4. Alternativ können absolute Zellulose Inhalt verbleibenden Pellets ermittelt Acetic / Nitric Assays (siehe Diskussion) werden.
3. Printing Microarrays
- Centrifuge Überstände, die Zellwandpolymere bei 13.000 xg gewonnen, um Partikel zu entfernen.
- Legen Sie 50 ul jeder Probe in ein Polypropylen-384-Well Mikrotiterplatten mit einem pre-designed benutzerdefinierte Layout, wo Proben nach Gewebetyp und Extraktionstyp angeordnet sind.
- Verdünnen Sie die Zellwandpolymer Probe in einer 0, 5 und 25 × seriellen Verdünnungsreihe mit destilliertem Wasser.
- Parameter wie Pin Höhe, Erhebung und Verweilzeit und Waschschritte sind auf der Software-Steuerung des Microarrayer gesetzt.
- Die Feuchtigkeit der Druckkammer wird mit 60% gesteuert wird, um Verdunstung zu verhindern Probe.
- Der Druckauftrag wird gestartet mit LabNEXT software und ein Programm, das auf dem Mikroarray Layout entspricht.
- Der Roboter verwendet Kapillarkanal Stifte, um Lösungen aus der Probe Platte auf 20 x 20 cm Nitrozellulosemembran, die zu einer flachen Platte in der Maschine befestigt ist gedruckt. Jeder Punkt auf dem Array enthält 15 nl einer Lösung und ist in dreifacher Ausfertigung gedruckt.
- Identische Microarrays werden nebeneinander auf der Membran und Schnitt in einzelnen Arrays gedruckt, nachdem der Druckauftrag abgeschlossen ist.
- In jedem Versuch die Arrays können modifiziert werden, um mehr oder weniger Proben, Verdünnungen oder repliziert unterzubringen.
4. Sondierung Glycan Microarrays
- Nach dem Drucken, blockieren die einzelnen Mikroarrays in 5% w / v Magermilchpulver in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (MPBS) bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um die unspezifische Bindung zu reduzieren.
- Sonde Mikroarrays mit monoklonalen Antikörpern, die für Zellwand-Glykan Epitope für 2 Stunden in MPBS. Die Mehrzahl der monoklonalen antibOdies gegen Zellwand Glycane sind kommerziell von drei Unternehmen; Biosupplies ( www.biosupplies.com.au ), Carbosource Services ( www.carbosource.net ) und PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
- Einschließen Negativkontrolle, ein Mikroarray mit nur MPBS und keine primären Antikörper inkubiert.
- Waschen der Mikroarrays 3mal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 min auf unspezifische Bindung zu entfernen.
- Sonde der Mikroarrays mit sekundärem Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP) in MPBS für 2 Stunden. Die meisten monoklonalen Antikörper gegen Zellwand Glykane erfordern anti-Maus oder anti-Ratte Sekundärantikörper.
- Wiederholen Waschschritte 3 mal mit PBS-Puffer für 5 min auf unspezifische Bindung zu entfernen.
- Entwickeln Sie die Microarrays mit chromogenen (3,3-Diaminobenzidin) oder chemiluminecent (Luminol) Substraten.
5. Quantifizierung
- Nach der Entwicklung, scannen die einzelnen Mikroarrays mit einem hochauflösenden (1.200 dpi) Desktop-Scanner und speichern Sie die Bilder als negativ, 16-Bit-TIFF-Dateien (Abbildung 3).
- Berechnen Sie die integrale Intensität jedes Spots mit Xplore Image Processing Software (LabNEXT) mit einem automatisierten Raster-Werkzeug ausgestattet. Das Integral Spotintensität wird aus der Summe der Pixel in der Umgebung jeder Rasterfläche Spot stammt.
- Die Grid-Daten für jeden Mikroarray als txt-Datei exportiert und kann manuell in eine Excel-Tabelle zur Analyse importiert werden. Eine Online-Werkzeug ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) wurde entwickelt, um automatisch zu übersetzen und verarbeiten Daten einzelner txt Dateien.
- Der integrierte Spotintensität wird über Druck repliziert gemittelt und Verdünnungen, eine "Kassamittelkurs erhaltenIntensität "Wert für jede Probe (Abbildung 2). Alternativ werden spot Signale entsprechend nur einem Verdünnungswert auf dem Array verwendet werden, um die relative Abundanz Glycan Epitop für jede Probe zu quantifizieren.
- Die relative mittlere Spotintensitäten zwischen verschiedenen Proben werden als Heatmap (Abbildung 4) mithilfe der bedingten Formatierung in Excel oder online HeatMapper Werkzeuge (präsentiert http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). Die Daten für jeden Antikörperart wird auf 100 korrigiert und eine 5% Cutoff-Wert enthalten sind die Hintergrundsignals und Fehlalarme zu entfernen.
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Representative Results
Die relative Häufigkeit von Glykanen in sechs Gewebetypen (Anthere Filamente, Pollen, Ovarien, Petalen, Sepalen und Stigmatisierung) von Nicotiana alata Blüten wurde mit Kompp. 3A zeigt eine repräsentative Mikroarrays mit mAb JIM5 spezifisch für teilweise (niedrig) methylesterified Homogalacturonan (HG), ein Epitop, das auf pektischen Polysacchariden 14 auftritt wurde sondiert. Die JIM5 Epitop in CDTA Extrakten aller Blütengeweben detektiert jedoch ist am höchsten in Pollen und niedrigsten in stigmatische Gewebe (3A und 4A). Interessanterweise ist die JIM5 Epitop auch in den NaOH-Extrakte in Pollen nachgewiesen, aber nicht in anderen Geweben (Abbildung 3A).
Quantitative Informationen über das Auftreten eines Glykans von Interesse durch eine Reihe von einschließlich gereinigte Polysaccharide als interne Standards auf dem Mikroarray (3B) erhalten. Integral Spotintensität von Extrakten aus verschiedenen t Bull. sondiert mit mAb JIM5 ist an die Stelle von Signalen von einer Reihenverdünnung von Homogalacturonan (25% Grad der Veresterung Methyl, DE) abgeleitet abgestimmt. In Eierstockgewebe, betrug etwa 157 ug Homogalacturonan enthaltend die JIM5 Epitop in jeder Probe einem Anteil von etwa 1,5% (Gew.) der gesamten Zellwandreste (3C). Erwägung 625 ug Homogalacturonan enthaltend die JIM5 Epitop vorhanden war in Pollen Gewebe und macht etwa 6,25% (Gew.) der gesamten Zellwand Rückstand.
Der relativen Häufigkeit von 15 Glycan Epitope als Heatmap in 4, wo die Intensität von Farbbalken ist proportional zu dem eingestellten Kassamittelkurs Intensität für jede Probe zusammengefasst. Eine bildliche Darstellung dieser Daten ist ebenfalls in Abbildung 5 dargestellt und ermöglicht es uns, schnell zu interpretieren Unterschiede in Glykan Epitop Auftreten zwischen den verschiedenen Blütengeweben.
nhalt "> Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne Epitope Glycan eindeutig unter N. alata Blume Gewebe verteilt. Zum Beispiel kann das Epitop LM13 (linearisiert (1-5)-α-L-Arabinan 15) am reichlichsten in Anthere Filamenten und Geweben sepal Vergleich zu anderen Geweben (Abb. 5D). Dieses Muster ist in auffallendem Gegensatz zu der kürzeren Ketten (1-5)-α-L-Arabinan Epitope vorzugsweise durch mAb LM6 (5E) 15 erfasst. Vernetzung Glykane auch deutliche Mustern des Auftretens in N. alata Blumen. Das LM10 Epitop (niedrig substituierte (1-4)-β-D-Xylan) ist reich an Stigma Gewebe im Vergleich zu anderen Geweben, aber fehlt Eierstockgewebe (5G). LM15 xyloglycan Epitope höchsten in Blütenblatt und Anthere Filament im Vergleich zu anderen Geweben (5H), während heteromannans höchsten in Anthere Filamente sind (Abbildung 5J).Abbildung 1. Ein vereinfachtes Diagramm, das die fünf wichtigsten Schritte umfassende Microarray Polymer Profiling (Kompp).
Abbildung 2. Eine Darstellung der wichtigsten Schritte Umfassende Microarray Polymer Profiling (Kompp). (A) Pflanzengewebe als drei gesammelten repliziert, homogenisiert und gewaschen in 70% EtOH und Aceton zu Alkohol unlöslichen Rückständen (AIR) zu machen. (B) Zellwand Glykane werden nacheinander von AIR Proben mit 50 mM CDTA und 4 M NaOH extrahiert. (C) extrahiert Zellwand Glycane auf Nitrocellulose unter Verwendung eines Mikroarray-Roboter gedruckt. Jede Probe wird in drei Konzentrationen und als eine Serie von vier Druckwerken Replik vertretentes. (D) Die gedruckten Arrays einzeln sondiert mit mAbs gerichtet Zellwand Glycane Epitope. (E) Die Spot Signale quantifiziert mittels Microarray Imaging-Software, als txt-Dateien und relative mittlere Spotintensität Werte werden automatisch berechnet mit Hilfe eines Online-Datenverarbeitung Tool exportiert.
Abbildung 3. Glycan Profilierung Nicotiana alata Blütengeweben. (A) Eine repräsentative Mikroarray sondiert mit monoklonalen Antikörpers (mAb), der spezifisch für JIM5 Homogalacturonan (teilweise, niedrig methylesterification) wird als eine negative, 16-Bit-TIFF-Datei angegeben. (B) Die Menge an Polysaccharid enthaltend eine Glycan Epitop von Interesse kann durch Drucken einer Reihe von Polysaccharid-Standards quantifiziert werden. (C) Integral Spotintensität Probe von Interesse sondiert durch mAbJIM5 berechnet und passend zu einer Standardkurve, um die Menge (ug) aus Polysaccharid mit diesem Epitop in der Probe zu bestimmen.
Abbildung 4. Glycan Profilierung Nicotiana alata Blütengeweben dargestellt als Heatmap. Die Farbintensität ist proportional zu der relativen Kassamittelkurs Identitätswert (Maßstab). Relativen Häufigkeit von 15 Glycan Epitope durch monoklonale Antikörper (aufgeführt oben) nachgewiesen wurde für sechs Gewebetypen mit CDTA und NaOH (linke Seite) extrahiert analysiert. Die Glycan Epitope fallen in drei breite Klassen von Polysacchariden; Pektine, vernetzenden Glykane und Arabinogalactan Proteine (AGPS). me, Methyl-Veresterung; DP, Grad der Polymerisation; mAb, monoklonalen Antikörpern; AGP, Arabinogalaktan-Protein.
Abbildung 5. Glycan Profilierung Nicotiana alata Blütengeweben vertreten bildhaft. AL repräsentiert die relative Häufigkeit von 12 Glycan Epitope durch mAbs in verschiedenen Geweben nachgewiesen Blume. Der Maßstabsbalken Farbintensität ist proportional zu der relativen Kassamittelkurs Identitätswert entweder von CDTA oder NaOH Extrakte oder einer Summe von sowohl abgeleitet. me, Methyl-Veresterung; DP, Polymerisationsgrad; mAb oder monoklonale Antikörper;. AGP, Arabinogalactan-Protein Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
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Discussion
Kompp ist eine schnelle und sensitive Methode zur Profilierung der Glycan Zusammensetzung von Hunderten pflanzlichen Proben in einer Angelegenheit von Tagen. Diese Methode ergänzt die bereits vorhandenen bakteriellen oder Säugetier-Glykan Array-Plattformen für das Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-Wechselwirkungen mit Glycan-bindende Proteine wie Lektine, Rezeptoren, Antikörper und 16. Mit einer großen Vielfalt von Sonden zur Erkennung von Zellwand Glykane, ist es möglich, detaillierte Informationen über Glykan Epitope gehören zu allen wichtigen Klassen von Polysacchariden in der pflanzlichen Zellwand 8,9 gewinnen. Allerdings sind diese umfassen nur einen kleinen Anteil der Glykanstrukturen, die 8,9 identifiziert haben, und in einigen Fällen zu begrenzen, die Verständlichkeit von Kompp. Dennoch hat diese Fähigkeit kürzlich durch die Verwendung von Kohlenhydrat-bindende Module (VBM) gegen Pflanzen Glycane 17 ausgedehnt wurde, und auch gegen Epitope, die von nicht-Glycosyl res dadurchidues wie Phenole 18 und 19, die Acetylreste Glycosylreste modifizieren und spielen eine wichtige Rolle bei der Glycan-Funktion.
Obwohl Kompp bestimmt die relativen Niveaus der Glykane auf einem Satz von Proben ist es möglich, die Epitop Ebenen in aufeinanderfolgenden Extrakte durch Vergleichen der Bindung Signal in bestimmter Proben der von bekannten Standards (3B und C) zu quantifizieren. Trotz der Vorteile der reduzierten Volumina in einem Mikroarray-basierte Plattform, kann die Fähigkeit, genau zu quantifizieren Glykan Auftreten von Unterschieden in Spotmorphologie oder Sättigung von Spot-Signal behindert werden. Diese Probleme (sowie Fehlalarmen) durch Optimierung der Menge an Zellwandmaterial Verse Extraktionsmittel Volumen, vor der Analyse, einschließlich einer Reihe von Wiederholungen und Verdünnungen, wie hier beschrieben und in Säuger-Glycan-Array 16 Methoden vermieden. Darüber hinaus Unterschiede in Spotmorphologie (durch Diffusion der Proben verursachtmit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aus dem Berührungspunkt) kann mit berührungslosen Tintenstrahl-Microarray-Technologie 16 überwunden werden.
Kompp wird in Kombination mit etablierten Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Zellwänden 20 verwendet. Es kann auch parallel zu bestehenden biochemische, enzymatische und physikalische Methoden eingesetzt werden, um weitere Informationen zu Glycan-Gehalt in Proben von Interesse zu gewinnen. Zum Beispiel, anstatt des Extrahierens Cellulosepolymeren, Essigsäure / Salpetersäure 20 Assays können verwendet werden, um Cellulose-Gehalt (mg), die nach der sequentiellen Extraktion von Pektin und Vernetzen Glycane mit CDTA und NaOH zu quantifizieren. Enzymbehandlung Glycan-Mikroarrays 21 kann auch zeigen, weitere Unterschiede in Glykan Epitop Verteilung auf Proben oder bestätigen die Spezifität Epitope Strukturen auf dem Mikroarray erkannt. Die Bestimmung der Zusammensetzung von unabhängigen Glycan analytischen Techniken, wie die kürzlich beschriebenen Wir zeigen, dass Glycane in einem Organ oder Gewebe-spezifischen Art und Weise verteilt sind N. alata Blumen. Diese Informationen können Einblicke in die biologische Funktion des Glycan Epitope oder Glycan Synthetisieren oder modifizierende Enzyme, die in diesen verschiedenen Zelltypen zu ergeben. Kompp zuvor Einblick in Zellwand Veränderungen, die in Relation zu treten Typ 22 während der Entwicklung 23,24 oder als Reaktion auf pflanzen Mutation 10,25 vorgesehen. Zusammenfassend ist Kompp ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der vielfältigen Rolle der Glykane und Glykan Synthese und Modifizierung von Genen in der pflanzlichen Zellwand.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
IEM möchte den dänischen Research Council (FTP und FNU) für die Finanzierung zu bestätigen. ERL erkennt die Unterstützung eines ARC DP gewähren. AB erkennt die Unterstützung des ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls Zuschuss.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
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