Summary
טכניקה הנקראת
Abstract
קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות אשר משחק תפקיד חשוב בפיסיולוגיה וההתפתחות של צמחים ולספק את חומרי הגלם לחברות אנושיות (למשל תעשיות עץ, נייר, טקסטיל ודלק ביולוגיים) 1,2. עם זאת, הבנת יוסינתזה והתפקוד של רכיבים אלה נותר מאתגרים.
glycans דופן תא מבחינה כימי וconformationally בשל המורכבות של אובניים הבניין שלהם, את שאריות glycosyl מגוון. קשרים אלה טופס בתפקידים מרובים ושונים במבנה טבעת, תצורת isomeric או anomeric, ובנוסף, הם מחליפים עם מערך של שאריות שאינן סוכר. הרכב glycan משתנה בתא אחר ו / או סוגי רקמות או אפילו תת דומיין של תא בודד חומה 3. יתר על כן, ההרכב שלהם גם לשינוי ב1 פיתוח, או בתגובה לאותות סביבתיים 4.
ב לשעברCess של 2,000 גנים יש קירות תא צמח הם מטריצות מורכבות של glycans הטרוגניות נחזה להיות מעורבים בביוסינתזה תא קיר glycan ושינוי ב5 ארבידופסיס. עם זאת, מעטים יחסית של גני biosynthetic התאפיינו תפקודי 4,5. גישות גנטיקה הפוכות הן קשות כי את הגנים לעתים קרובות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, לעתים קרובות ברמות נמוכות, בין סוגי תאים 6. כמו כן, מחקרי מוטציה לעתים קרובות הפריעו יתירות גן או מנגנוני פיצוי על מנת להבטיח תפקוד דופן תא מתאים נשמר 7. לכן יש צורך בגישות חדשות במהירות כדי לאפיין מגוון הרחב של מבני glycan וכדי להקל על גישות גנומיקה תפקודיות לביוסינתזה הבנת תא קיר ושינוי.
נוגדנים חד שבטי (בז) 8,9 צמחו ככלי חשוב לקביעת מבנה והפצת glycan בצמחים. אלה מכירים distאפיטופים נוכחיים בתוך סוגים עיקריים של glycans דופן תא צמח, כולל pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans וarabinogalactans inct. לאחרונה השימוש שלהם הוארך לניסויי הקרנה בקנה מידה גדול כדי לקבוע את השפע היחסי של glycans במגוון רחב של צמחים וסוגי רקמות זמנית 9,10,11.
כאן אנו מציגים שיטת microarray מבוססת glycan הקרנה נקראת Profiling המקיף microarray הפולימר (CoMPP) (איורים 1 ו -2) 10,11 המאפשרת דגימות מרובות (100 שניות) שיוקר באמצעות פלטפורמת microarray מוקטנת עם ריאגנט המופחת וכרכי מדגם. אותות הנקודה על microarray ניתן לכמת באופן רשמי לתת נתוני כמותיות על התרחשות epitope glycan. גישה זו מתאימה גם למעקב אחר שינויים במערכות מורכבות glycan ביולוגיות 12 ומתן סקירה כללית של הרכב דופן תא במיוחד כאשר לפני הידע of זו אינה זמינה.
Protocol
1. אוסף רקמות והכנה
- איסוף משקל 100 מ"ג טריים של רקמות צמח (מינימום של 10 מ"ג משקל יבש) לפחות בשלושה עותקים לכל רקמות של עניין. השלבים הבאים מתארים את ההכנה של חומר דופן תא מרקמות צמח. במקרה של רקמות אחסון, עמילן בלתי רצוי יוסר enzymatically לפני שימשיך בהפקת פולימרי דופן תא כפי שתואר קודם לכן 13.
- הומוגני הדגימות לאבקה דקה עם חנקן נוזלי באמצעות Qiagen TissueLyser שני, עם 24 סטי מתאם צינור ו 3 חרוזי טונגסטן קרביד מ"מ (30 הרץ, 2 x 30 שניות). לחלופין, אם רק כמה דוגמאות שנמצאות בעיבוד, מכתש ועלי משמשים.
- העבר את homogenates לתוך צינורות חרוטים 10 מיליליטר פלסטיק.
- להכין חומרי דופן תא על ידי השטיפה בhomogenates מ"ל 80% אתנול 10 V / v בRT וvortexing נמרצות עבור 2 דקות.
- צנטריפוגה דגימות ב3500 XG ולהשליך supernatant. חזור על אתנול 70% שוטף לפחות שלוש פעמים או עד supernatant הוא ברור, במיוחד לרקמות המכילות כלורופיל.
- לבצע שטיפה סופית עם אצטון 100% ולהשאיר את הכדורים המכילים שאריות אלכוהול מסיסות (אוויר) לייבוש אוויר הלילה.
- מסננת דגימות האוויר עם 2 רשת 0.4 מ"מ להשיג אבקה דקה, אחידה ולהסיר גדולים יותר, גרוע חלקיקי קרקע שמתישהו יישארו בhomogenate.
- שוקל מדגם AIR 10 מ"ג לmicrotubes, כל אחת מכיל 3 מ"מ חרוז זכוכית כדי לסייע לערבוב של דגימות.
2. הפקת glycans דופן התא
- Pectins, ופולימרים הקשורים pectins נשלפים מהדגימות על ידי הוספת 500 μl של 50 מיקרומטר CDTA (pH 7.5) לכל דגימה.
- בקצרה מערבולת את הצינורות כדי להבטיח הממס הוא במגע עם החומר מדגם ואז לערבב באמצעות TissueLyser עבור 3 שעות ברץ 8.
- צנטריפוגה דגימות ב12000 XG, זהירות rסר את supernatants ולאחסן ב 4 ° C.
- שטוף את הכדורים ב1 מ"ל של מים מיוננים כדי לדלל ולהסיר כל מערבולת שנותרה ממס וצנטריפוגה ב13000 x גרם. חזור על שלב זה מבלי להפריע הגלולה ולהסיר את כל הנוזל מהצינורות לפני שתמשיך לשלב הבא.
- glycans cross-linking מופקים ברצף מהתא שנותר קיר הגלולה עם 500 μl של NaOH 4M עם 0.1% w / v NaBH4, תוך שימוש באותו ההליך מתואר בצעדים 2.1-2.4 לחילוץ CDTA. NaBH 4 נוסף כדי לצמצם את קבוצת אלדהיד (או keto) בסוף הצמצום של הסוכרים לאלכוהול ובכך למנוע בסיס קילוף של סוכרים.
- לאחר צנטריפוגה, supernatants יוסר שוב, מאוחסן ב 4 ° C, ושטפו את הכדורים פעמים במים מיוננים לפני שימשיך לחילוץ הבא.
- כצעד אופציונלי, פולימרים השיורי, כגון תאי מופקים עם 500 cadoxen μl (31% v / v 1,2-diaminoethane עם 0.78 מ CDO) באותו האופן כפי שמתואר בצעדים 2.1-2.4. לחלופין, תוכן תאית מוחלט בכדורים נותרים ניתן לקבוע באמצעות מבחנים אצטית / חנקן (ראה דיון).
3. Microarrays הדפסה
- supernatants צנטריפוגות מכילים פולימרי חילוץ דופן תא ב13000 XG כדי להסיר כל חומר חלקיקים.
- טען 50 μl של כל דגימה לפוליפרופילן 384 גם צלחת microtiter באמצעות פריסה מותאמת אישית מראש תוכנן שבו דגימות מסודרות לפי סוג רקמה וסוג חילוץ.
- דלל את מדגם תא קיר הפולימר ב0, 5 ו 25 × סדרת דילול סדרתי עם מי deionized.
- פרמטרים כגון גובה סיכה, אוסף ולהתעכב זמן, וצעדי כביסה נקבעים על תוכנת שליטה microarrayer.
- הלחות של חדר ההדפסה נשלטת על 60% כדי למנוע אידוי מדגם.
- עבודת הדפסתו התחילה להשתמש LabNEXT Softwaמחדש ותכנית אשר תואמת את פריסת microarray.
- הרובוט משתמש בסיכות ערוץ נימים להדפיס פתרונות מצלחת המדגם גבי קרום 20 x 20 סנטימטרי ניטרוצלולוזה אשר מצורף לצלחת שטוחה במכונה. כל נקודה במערך מכילה 15 nl של פתרון והוא מודפס בשלושה עותקים.
- microarrays הזהה מודפסים לצד זה על הקרום וחתוך למערכים בודדים לאחר עבודת ההדפסה הסתיימה.
- בכל ניסוי את המערכים יכולים להיות שונים כדי להתאים פחות או יותר דגימות, דילולים או משכפל.
4. חיטוט של microarrays glycan
- לאחר הדפסה, לחסום את microarrays הבודד ב5% אבקת חלב רזה w / v מומסת בפוספט נאגרה מלוחה (Mpbs) בטמפרטורת חדר למשך 2 שעות כדי להפחית מחייב הלא ספציפי.
- microarrays בדיקה עם נוגדנים ספציפיים לתא קיר glycan אפיטופים עבור 2 שעות בMpbs חד שבטיים. רוב antib חד השבטיodies נגד glycans דופן התא זמין מסחרי משלוש חברות; Biosupplies (www.biosupplies.com.au), שירותי Carbosource (www.carbosource.net) וPlantProbes (www.plantprobes.net).
- כולל שליטה שלילית, microarray מודגרות עם Mpbs בלבד ואין נוגדנים עיקריים.
- שטוף את microarrays 3 פעמים בנאגרו מלוחות פוספט (PBS) למשך 5 דקות כדי להסיר מחייב הלא ספציפי.
- לחקור את microarrays עם נוגדן מצומד לperoxidase חזרת (HRP) בMpbs ל2 שעות משני. נוגדנים חד השבטיים ביותר נגד glycans דופן התא דורשים נוגדנים משניים אנטי עכבר או אנטי עכברוש.
- חזור על שלבי כביסת 3 פעמים עם PBS חיץ למשך 5 דקות כדי להסיר מחייב הלא ספציפי.
- לפתח את microarrays באמצעות chromogenic (3,3-Diaminobenzidine) או chemiluminecent (לומינול) מצעים.
5. קביעת כמות
- לאחר פיתוח, לסרוק את microarrays הבודד באמצעות רזולוציה גבוהה (1200 dpi) סורק שולחני ולשמור את התמונות כקבצים שליליים, 16-bit TIFF (איור 3).
- לחשב את העצמה בלתי נפרדת מכל מקום באמצעות Xplore תוכנת עיבוד תמונה (LabNEXT) המצוידת בכלי רשת אוטומטיות. עוצמת כתם בלתי נפרדת נגזרת מהסכום של פיקסלים באזור הרשת מסביב לכל מקום.
- את נתוני הרשת עבור כל microarray מיוצא כקובץ txt ויכולים ידניים ייובאו לתוך גיליון אלקטרוני Excel לצורך הניתוח. כלי מקוון (http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/) פותח כדי לתרגם באופן אוטומטי ולעבד נתונים מקבצי txt בודדים.
- עוצמת המקום אינטגרלית בממוצע על פני דפוס משכפל ודילולים כדי להשיג 'נקודת ממוצעערך העצמה "לכל דגימה (איור 2). לחלופין, אותות ספוט מתאימים רק לאחד הדילול ערך במערך משמשים לכמת את שפע epitope glycan היחסית לכל דגימה.
- עוצמות הספוט הממוצעות היחסיות בין מדגמים שונים מוצגות כheatmap (איור 4) שימוש בעיצוב מותנה בכלי heatmapper Excel או מקוונים (http://bar.utoronto.ca/welcome.htm). נתונים לכל אחד מסוגי נוגדנים הם תקן ל 100 ו5% ערך סף מוטל להסיר אות רקע ותוצאות חיוביות שגויות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השפע היחסי של glycans בשישה סוגי רקמות (סיבי תועבה אחרות, אבקה, שחלות, עליי כותרת, עליי גביע וסטיגמה) מפרחי Nicotiana alata נקבע באמצעות CoMPP. האיור 3 א מציג microarray נציג שכבר גשש בJIM5 ספציפי מאב לאופן חלקי (נמוך) homogalacturonan methylesterified (ה"ג), אשר מתרחש בepitope סוכרים פקטיניים 14. JIM5 epitope הוא זוהה בתמציות CDTA של כל רקמות הפרחים זאת הוא גבוה ביותר באבקה והנמוכה ביותר ברקמה סטיגמטית (האיור 3A ו4A). מעניין, epitope JIM5 גם זוהה בתמציות NaOH באבקה אך לא ברקמות אחרות (איור 3 א).
מידע כמוני על ההתרחשות של glycan עניין מתקבל על ידי לרבות סדרה של מטוהר סוכרים כסטנדרטים פנימיים על microarray (איור 3 ב '). עוצמת כתם בלתי נפרדת מתמציות של t השונה סוגיות חקרו עם MAB JIM5 מותאמות לאותות הספוט נגזרים מדילול סידורי של homogalacturonan (25% מתואר esterification תיל, DE). ברקמת שחלה, כ 157 מיקרוגרם של homogalacturonan מכיל JIM5 epitope היה נוכח בכל מדגם, והיווה כ -1.5% (לפי משקל) של שאריות דופן תא כלל (האיור 3C). בעוד homogalacturonan 625 מיקרוגרם מכיל JIM5 epitope היה נוכח ברקמות אבקה, והיווה כ 6.25% (לפי משקל) של שאריות קיר תא.
השפע היחסי של 15 אפיטופים glycan מסוכם heatmap באיור 4 שבו העצמה של פסי צבע היא ביחס ישר לעוצמת נקודת הממוצע המותאמת לכל דגימה. ייצוג ציורי של נתונים אלה גם באיור 5 ומאפשר לנו במהירות לפרש הבדלים בהתרחשות epitope glycan בין רקמות פרחים השונות.
ontent "> התוצאות שלנו מצביעות על כך שאפיטופים glycan בודדים מופצים באופן ייחודי בין רקמות נ alata פרחים. לדוגמה, LM13 epitope (linearised (1-5 15)-α-L-arabinan) הוא נפוץ ביותר בסיבים ורקמות מאבק עלו גביע בהשוואה לרקמות אחרות (האיור 5D). דפוס זה הוא בניגוד גמור לזה של שרשרת קצרה (1-5) α--L-arabinan אפיטופים זוהה מועדף על ידי MAB LM6 (האיור 5E) 15. glycans Cross-linking גם מובחנת דפוסים של התרחשות בפרחי נ alata. epitope LM10 (נמוך יוחלף-(1-4)-β-D-xylan) מצויים בשפע ברקמת הסטיגמה בהשוואה לרקמות אחרות, אבל נעדרו מרקמת שחלה (האיור 5G). LM15 אפיטופים xyloglycan גבוהים ביותר הם בכותרת ונימת מאבק בהשוואה לרקמות אחרות (איור 5H), ואילו heteromannans הם גבוה ביותר בסיבי תועבה אחרת (איור 5j).: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. תרשים זרימה פשוטה המייצג את חמישה שלבים העיקריים של פרופילי פולימרי microarray מקיפים (CoMPP).
איור 2. איור של השלבים העיקריים של פרופילי פולימרי microarray מקיפים (CoMPP). () רקמות צמח נאספות כ3 משכפלת, homogenized ורחצו בEtOH 70% ואצטון כדי להפוך את שאריות אלכוהול מסיסות (אוויר). (ב) glycans דופן התא מופקים ברצף מדגימות אוויר עם 50 המ"מ CDTA וז 4 NaOH. (ג) glycans דופן התא חולץ מודפסים על ניטרוצלולוזה באמצעות רובוט microarray. כל דגימה מיוצגת בשלושה ריכוזים וכסדרה של העתק הדפסה ארבעהtes. (ד) המערכים המודפסים הם בחנו באופן פרטני עם בז מכוון לאפיטופים סלולריים glycans קיר. (ה) אותות הספוט לכמת באמצעות תוכנת הדמית microarray, מיוצאת כקבצי txt וערכי עצמה יחסיים ממוצעים הספוט מחושבים באופן אוטומטי באמצעות כלי עיבוד נתונים מקוונים.
איור 3. פרופיל glycan של רקמות Nicotiana alata פרחים. () Microarray נציג גשש בעזרת נוגדן חד שבטי (MAB) JIM5 ספציפי לhomogalacturonan (באופן חלקי methylesterification, הנמוך) מצוין כקובץ שלילי, סיבי 16-TIFF. (ב) כמות פוליסכריד המכיל epitope glycan של עניין ניתן לכמת על ידי הדפסת סדרה של סטנדרטי פוליסכריד. (ג) עוצמת נקודה אינטגרלית ממדגם של עניין נחקרה על ידי MAB JIM5 מחושב ומותאם לעקומה סטנדרטית כדי להעריך את הכמות (מיקרוגרם) של פוליסכריד המכילה epitope הזה במדגם.
איור 4. פרופיל glycan של רקמות Nicotiana alata פרחים מיוצגים כheatmap. עוצמת הצבע היא יחסית לערך היחסי הממוצע נקודת הזהות (סרגל קנה מידה). שפע יחסי של 15 אפיטופים glycan זוהו על ידי נוגדנים חד שבטי (מופיע בחלק העליון) נותח במשך שישה סוגי רקמות חולצו עם CDTA וNaOH (צד שמאל). את אפיטופים glycan נחלקים לשלושה סוגים מקיפים של סוכרים; pectins, הצלב מקשרים-glycans וחלבוני arabinogalactan (AGPS). לי, מתיל esterification; DP, תואר של פילמור; מב, נוגדנים חד שבטי; AGP, arabinogalactan חלבון.
ss = "jove_content" fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 5. פרופיל glycan של רקמות Nicotiana alata פרחים מיוצג ציורי. AL מייצג את השפע היחסי של 12 אפיטופים glycan זוהו על ידי בז ברקמות פרחים שונות. עוצמת צבע סרגל קנה המידה פרופורציונלית לערך היחסי הממוצע נקודת הזהות נגזר גם תמציות CDTA או NaOH או סכום של שניהם. לי, מתיל esterification; DP, תואר של פילמור; מב, נוגדנים חד שבטי;. AGP, arabinogalactan חלבון לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CoMPP היא שיטה מהירה ורגישה לאפיון הרכב glycan של מאה דגימות צמחיות בעניין של ימים. שיטה זו משלימה את הפלטפורמות הזמינות כבר חיידקים או יונקי glycan מערך לתפוקה גבוהה הקרנה של אינטראקציות פחמימות עם חלבוני glycan מחייב כגון קטינים, קולטנים, ונוגדנים 16. עם מגוון גדול של בדיקות זמינות לאיתור glycans דופן תא, ניתן לקבל מידע מפורט על אפיטופים glycan שייכים לכל המחלקות העיקריות של סוכרים בתאי צמח קיר 8,9. אולם אלה מקיפים רק חלק קטן ממבני glycan שזוהו 8,9, ובנסיבות מסוימות להגביל המובן של CoMPP. עם זאת, יכולת זו באחרונה הוארכה על ידי השימוש במודולים מחייבים פחמימות (CBMs) נגד glycans הצמח 17, וגם נגד אפיטופים המתאפיינים ברזולוציה שאינה glycosylidues כגון phenolics 18 ושאריות אצטיל 19 שמשנים שאריות glycosyl ולשחק תפקיד חשוב בתפקוד glycan.
למרות CoMPP קובע את הרמות היחסיות של glycans פני קבוצה של דגימות, שניתן לכמת את רמות epitope בתמציות רציפות על ידי השוואת האותות מחייבים בדגימות ספציפיות לזה של סטנדרטים ידועים (האיור 3B ו-C). למרות היתרונות של כרכי המדגם מוזלים בפלטפורמת microarray מבוסס, היכולת לכמת במדויק התרחשות glycan יכולה להתעכב על ידי הבדלים במורפולוגיה נקודת רוויה של אות או נקודה. בעיות אלו (כמו גם תוצאות חיוביות שגויות) הם נמנעו על ידי אופטימיזציה של כמות נפח תא קיר חומרי פסוקי extractant, לפני הניתוח, וכולל סדרה של המשכפל והדילולים כפי שתואר כאן ובשיטות מערך glycan יונקי 16. יתר על כן, הבדלים במורפולוגיה נקודה (הנגרמים על ידי התפשטות של דגימותבשיעורים שונים מנקודת מגע) ניתן להתגבר על ידי השימוש ללא מגע טכנולוגיית הזרקת דיו microarray 16.
CoMPP משמש בשילוב עם נהלים שנקבעו לבידוד וההכנה של קירות תא 20. זה גם יכול לשמש במקביל לשיטות קיימות ביוכימיים, אנזימטית ופיסיות כדי להשיג מידע נוסף על תוכן glycan בדגימות של עניין. לדוגמה, במקום לחילוץ פולימרים מתאית, אצטית / מבחני חומצה חנקתית 20 יכולים לשמש כדי לכמת תוכן תאי (מ"ג) שנותר לאחר מיצוי רציף של פקטין וglycans צלב מקשר-עם CDTA וNaOH. טיפול אנזים של microarrays glycan 21 יכול גם לגלות הבדלים נוספים בהפצת epitope glycan בין דגימות, או לאשר את הספציפיות של מבני אפיטופים אותרו ב microarray. קביעת הרכב glycan ידי טכניקות אנליטיות עצמאיות, כגון אלה שתוארו לאחרונה אנו מראים כי glycans מופצים באיבר או רקמת אופן ספציפי בנ פרחי alata. מידע זה יכול לתת תובנה הפונקציה הביולוגית של glycan אפיטופים או glycan סינתזה או שינוי אנזימים המצויים בסוגי התאים השונים האלה. CoMPP ספק תובנה בעבר לשינויי דופן תא המתרחשים ביחס לשתול סוג 22 במהלך הפיתוח 23,24 או בתגובה למוטציה 10,25. לסיכום, CoMPP הוא כלי רב ערך לחקר התפקיד המגוון של glycans וגני סינתזה ושינוי glycan בקיר תא הצמח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
IEM הייתי רוצה להכיר המועצה למחקר הדנית (FTP ו FNU) למימון. ERL מכיר בתמיכה של ARC DP מענק. א.ב. מכיר בתמיכה של מרכז ARC ההצטיינות במענק קירות תא צמח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diamin–thane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , In Press (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
