Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Summary

Metafas att anafas övergång utlöses genom anafas-befrämjande komplex (APC / C)-beroende ubikitinering och påföljande destruktion av cyklin B. Här har vi etablerat ett system som, efter puls-chase märkning, medger övervakning cyklin B proteolys i hela cellpopulationer och underlättar detekteringen av störningar av den mitotiska kontrollpunkten.

Abstract

Jämn fördelning av kromosomer mellan de två dotterceller under celldelning är en förutsättning för att garantera genetisk stabilitet ^1. Felaktigheter under kromosom separation är ett kännetecken för malignitet och i samband med progressiv sjukdom ^2-4. Spindeln montering kontrollpunkten (SAC) är ett mitotiska övervakningsmekanism som håller tillbaka celler vid metafas tills varenda kromosom har etablerat en stabil bipolär anslutning till den mitotiska spindeln ^1. SAC utövar sin funktion genom interferens med aktiverande APC / C-subenhet CDC20 att blockera proteolys av Sekurin och cyklin B och därmed kromosom separation och mitotisk avsluta. Felaktig fastsättning av kromosomer förhindrar tysta SAC signalering och orsakar fortsatt hämning av APC / C ^CDC20 tills problemet är löst för att undvika kromosom missegregation, aneuploidi och elakartade svulster ^1.

De flesta studier som riktar den influence på felaktig kromosomal fastsättning på APC / C-beroende proteolysen utnyttjade spindel störningar med depolymerisering eller mikrotubuli-stabiliserande läkemedel för att störa kromosomal anknytning till mikrotubuli. Eftersom störningar mikrotubuli kinetik kan påverka transport och lokalisering av kritiska tillsynsmyndigheter, dessa förfaranden bär en risk för att inducera konstgjorda effekter ^5.

Att studera hur SAC stör APC / C-beroende proteolysen av cyklin B under mitos i oberörd cellpopulationer har vi etablerat en histon H2-GFP-baserad system som tillät samtidig övervakning av metafas anpassning av mitotiska kromosomer och proteolys av cyklin B ⁶ .

Att skildra proteolytiska profiler, genererade vi en chimär cyklin molekyl B reporter med en C-terminal SNAP delen ⁶ (figur 1). I en egen märkning reaktionen är SNAP-gruppen kan bilda kovalenta bindningar medalkylguanin-bärare (SNAP-substrat) ^7,8 (Figur 1). SNAP substratmolekyler är lätt tillgängliga och bär ett brett spektrum av olika fluorokromer. Chimära cyklin B-SNAP molekyler blir märkt vid tillsats av membran-permeabla SNAP substrat till odlingsmediet ⁷ (figur 1). Efter märkningsreaktionen faller cyklin B-SNAP fluorescensintensitet i en puls-chase reaktion-liknande sätt och fluorescensintensiteter återspeglar nivåerna av cyklin B nedbrytning ⁶ (figur 1). Vårt system underlättar övervakningen av mitotisk APC / C-beroende proteolys i ett stort antal celler (eller flera cellpopulationer) parallellt. Därigenom kan systemet vara ett värdefullt verktyg för att identifiera ämnen / små molekyler som kan störa proteolytisk aktivitet vid metafas att anafas övergång. Dessutom har som syntes av cyklin B under mitos nyligen föreslagits som en viktig mechanism främja en mitotiskt block i möss och människor genom att hålla cyklin B uttrycksnivåer stabila ^9,10, gjorde detta system oss att analysera cyklin B proteolys som en del av en balanserad jämvikt ^6.

Protocol

1. Sådd av U2OS-baserade cyklin B-SNAP Reporter celler (klon 11 celler ⁶⁾ på objektglas Chamber

1. Trypsinisera subkonfluenta celler SNAP reporter som tilläts växa asynkront i log-fas minst 48 timmar.
2. Att arbeta med 8 väl mikroskop kammare (konstant fördelning av celler).

För ympning av celler på 8 väl mikroskop kammare vid en konstant fördelning över hela ytan av mikroskop kammaren, centrifug 10.000 celler och återsuspendera i 350 pl av fenolrött-fritt normalt tillväxtmedium (kompletterat med 10% fetalt bovint serum, penicillin / streptomycin och natriumpyruvat). Överför cellsuspensionen till mikroskopet kammaren (Figur 2).

Att arbeta med 8 väl mikroskop kammare (maximal celldensitet i mitten).

För ympning av celler vid en högre densitet i mitten av mikroskopets CHAMBer, ladda kammaren med 300 fil fenol röd-fri normalt tillväxtmedium. Lägg 5.000 celler försiktigt till mitten av mikroskopets kammaren (Figur 2).

Att arbeta med 96 väl speciella optik plattor (konstant fördelning av celler).

För ympning av celler på 96 brunnars plattor vid en konstant fördelning över hela ytan av brunnen, centrifugera 5.000 celler och återsuspendera i 300 fil fenol röd-fri normalt tillväxtmedium. Överför cellsuspensionen till en 96-brunnars platta. Beroende på det totala antalet celler som innehåller nödvändiga brunnar, justera cellantalet och den totala volymen av suspensionsmediet (figur 2).

Arbeta med 96 väl speciella optik plattor (maximal celldensitet i mitten).

För ympning av celler på 96 brunnars plattor, tillsätt försiktigt 1.500 celler i 15 | il av fenolrött-fritt normalt tillväxtmedium i en smalL droppe till mitten av varje brunn för att uppnå begränsning av celltillväxt till mitten av brunnen (Figur 2).

3. Tillåt sådda celler att växa i minst 18 timmar under standardförhållanden för cellodling (37 ° C, 100% luftfuktighet, 5% CO _2).

2. Färgning av Reporter celler med SNAP Substrat

1. 30 min före början av färgningsproceduren tillåter alikvoter av fenolrött-fritt normalt tillväxtmedium värmas upp till 37 ° C.
2. För enkel hantering av SNAP substratet (i vårt fall TMR stjärna) upplösa TMR stjärna i DMSO för erhållande av en koncentration i förrådslösning av 400 pM, som kan lagras vid -20 ° C.
3. Före färgning, späd 0,5 pl TMR Star stamlösning i 200 fil fenol röd-fri normalt tillväxtmedium (37 ° C) för att erhålla en slutlig märkning koncentration av 1 pM.
4. Ta normalt odlingsmedium från asynkront växande celler och inkubera i Labeling mediet under 25 min under standardiserade odlingsbetingelser.
5. Avlägsna märkning medium och tvätta celler fyra gånger med fenol röd-fritt normalt tillväxtmedium (37 ° C). Inkubera cellerna i 300 pl fenol röd-fri normalt tillväxtmedium (37 ° C) under 30 minuter. Före transport till mikroskopet ersätta mediet med färskt fenolrött normalt tillväxtmedium (37 ° C) för att avlägsna kvarvarande substrat obundet SNAP.
6. Transport celler till mikroskop i en frigolit låda på en förvärmd (37 ° C) värmeblock för att minimera temperaturvariationer.

3. Mätning av fluorescensintensitet

1. Två timmar före analysen justera lufttemperatur klimatkammaren till 37 ° C i torr läge för att bringa hela mikroskop med alla dess komponenter till den önskade temperaturen. Förvärmning innan du luftfuktigheten är viktigt att undvika kondens och efterföljande skador på mikroskopet.
2. Justera t luftfuktighetO 60% och CO ₂ till 5% före starten av analysen.
3. Starta Scan ^ R Förvärv programvara och ange standardinställningar (se tabell 1).
4. Definiera positionerna för brunnarna som skall analyseras.
5. Definiera At (förvärv cykeltid) och det absoluta antalet förvärv cykler.
6. Om en analys av ett större antal brunnar önskas, välj hårdvara autofokus, annars är det tillräckligt att använda programvara autofokus ensam.
7. Starta förvärv och övervaka de första två förvärv cykler. Mikroskopet kommer att fokusera på histon H2-GFP-signal, med efterföljande förvärv av en första bild på den kanalen innan filtret byts och motsvarande TMR Star bild förvärvas (Figur 3). Detta upprepas sedan för alla positioner inom väl och för varje brunnarna som ska undersökas, innan du upprepar igen nästa cykel.

4. Analys av Proteolytisk profiler usjunga Scan ^ R

1. Starta Scan ^ R-analys programvara och analysera bilder med cellkärnan, såsom visualiserades genom histon H2-GFP, definierad som huvudsyftet med användning av en tröskel baserad på signalintensitet och en vattendelare algoritm för att hjälpa till att separera angränsande celler. En subobject bestående av en kärna med cytoplasman bör skapas för TMRstar analys. (Viktiga egenskaper huvudsyfte är X och Y positioner, tid och maximal och genomsnittlig intensitet GFP för huvudsyfte och den totala intensiteten dividerat med område för TMRstar subobject.) Denna analys kan ta flera timmar beroende på stora uppgifter kvantiteter.
2. Byt spåra läget för att visualisera subobject medelvärdet TMR Star fluorescensintensiteten över tiden (cell spår), tilldelas de analyserade viktigaste objekten (Figur 4). Antalet celler som skall undersökas kan inskränkas genom gating på dessa mätningar som varar minst 140 cykler och med en hög maximal intensitet av H2-GFP. Sökervid större antal celler kan en första representant och objektiv bild (Figur 4).
3. Markera en cell spår av intresse att visualisera histon H2-GFP och TMR-Star fluorescens samtidigt vid en enda cell nivån (figur 5A).
4. Använda Högerklicka på en cell av intresse och generera en exporteras bildgalleri för illustration av histon H2-GFP och cyklin B-SNAP TMR Star för varje tidpunkt.
5. Byt till befolkningen läge för Scan ^ R Analys programvara och grind den region där cellen av intresse representerad på X vs Y punktdiagram (figur 5B).
6. Applicera ett nytt fönster punktdiagram till gated regionen och visualisera innebär TMR Star fluorescensintensiteten över tiden (figur 5C).
7. Exportera data (tid och fluorescensintensitet) till Microsoft Excel för vidare beräkningar.

5. Representativa resultat

Fig.ure 5D och 5E visar cyklin B kinetik, representerad av ett TMR Star fluorescensintensitet kurva, en cell som fortskrider genom en vanlig mitos utan tecken på kromosomal felinriktning (figur 5E). Vid packning av cytoplasman efter kärnhöljet uppdelning (NEBD, vilket framgår av den röda triangeln) visar TMR Star fluorescensintensitet en abrupt ökning tills isomorfa fönstret (ljusare område i diagrammet) nås när cellen går prometafas ^6. Fluorescensintensitet kvar på en stabil nivå, så länge cellen fortsätter genom profas och metafas och sedan börjar sjunka snabbt när alla kromosomerna har etablerat en stabil metafas platta (figur 5D och 5E). Denna minskning föregår kromosom separation under anafas (blå prick på kurvan). I slutet av mitos kromatinet börjar decondense (blå staplar) och cellen antar interfas morfologi medan fluorescensintensiteten kurvan närmar sig enplatå som är lägre än platån före mitos (figur 5D och 5E).

Tabell 1. Standardinställningar som används för analys av cyklin B proteolys. Histon H2-GFP användes som en referens struktur för att definiera fokus planet för mätning av cyklin B-SNAP fluorescensintensitet. Ljusintensiteter under fokusering förfarandet är lägre jämfört med inställningarna bildupptagning för att undvika kumulativ fototoxicitet.

Figur 1. Schematisk av mätningen av cyklin B proteolys genom expression av en chimär cyklin B-derivat med nedbrytning egenskaper liknar det endogena proteinet. Nedgången i fluorescensintensitet efter puls-chase märkning är ett mått på APC / C-aktivitet.

Figur 2. Analys av celler på 8 väl objektglas eller 96 hålsplattor. Regelbunden distribution avceller över ytan av den väl uppnås genom återsuspension i en slutlig volym av 300 | il och rekommenderas, om endast en enda eller ett fåtal positioner manuellt definierade för analys. Anrikning av celler i det centrala området uppnås genom tillsats av celler till mitten av förfyllda eller tomma brunnar. Denna teknik rekommenderas vid automatisk bildtagning i olika brunnar.

Figur 3. Sekvens av datainsamling. A) Detektion av histon H2-GFP används för fokusering plan definition och uppföljning av kromosomal inriktning under mitos. B) Fluorescensintensitet av TMR Star fluorescens intensiteten är ett mått för den absoluta mängden puls-chase märkt cyklin B-SNAP.

Figur 4. Representant Scan ^ R Analys mjukvarubaserad skildring av genomsnittlig TMR Starfluorescensintensiteter (totalt TMRstar intensitet dividerat med area) över tid. Val av en representativ cell trace (blå). Motsvarande bilder (visas till höger) tillåter samtidig visualisering av histon H2-GFP (grönt) och cyklin B-SNAP (röd). Klicka här för att se större bild .

Figur 5. A + B) Exempel på gating punkter som representerar en cell av intresse på XY-punktdiagram. C) Visualisering av medelvärdet TMRstar fluorescensintensiteten (totalt TMRstar intensitet dividerat med area) över tid med hjälp av punktdiagram. D + E) representant fluorescensintensitet kurva av cyklin B-SNAP med isomorfa fönster (brigher fältet på diagrammet) mellan NEBD (kärnhöljet uppdelning) och kromatin dekondensation (blå stapel) som genereras i Microsoft Excel. Anafas indikeras av tHan blå prick på kurvan. Klicka här för att se större bild .

Film 1. Klicka här för att se extra film .

Discussion

Vi presenterar här en live-cell imaging strategi underlättar samtidig övervakning av cyklin B proteolys och kromosom inriktning. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att studera mitotiska kontroll i ostörda cellpopulationer på den enda cellnivå. Cyklin B nedbrytning kurvor underlätta direkta insikter i aktiviteten av APC / C och därmed indirekt återspeglar status SAC ^6.

Detta tillvägagångssätt, även om fastställts baserat på Scan ^ R programvara kan enkelt reproduceras på någon jämförbar mikroskop station. Dessutom använder vår retroviral cyklin B-SNAP expressionskonstruktionen kan en reporter cellinje lätt fastställas genom stabil retroviral integrering i önskad cellinje. Att göra systemet ännu mer flexibel, kan de chimära SNAP proteinerna färgas med olika fluorokromer.

Genomförandet av histon H2-GFP, förutom dess krav vid övervakning kromosom inriktning, facilitates snabbt och enkelt autofokus. Autofokus och inställningar intensitet beror också på vilken typ av cell och måste fastställas för varje cellinje. Förvärvet av proteolytiska profiler av ett stort antal celldelningar med Scan ^ R-teknik får dessutom oss att välja för enstaka mitoser, som visade fel kromosom anpassning. Detta gjorde det möjligt för oss att definiera skillnader mellan proteolytiska profiler avvikande och regelbundna divisioner ^6.

Mitoser visar kromosomal förskjutning kan också väljas genom analys av rå bildstaplar, även om detta är mindre tidseffektivt. Cyklin B-Snap fluorescensintensiteter kan kvantifieras med hjälp freeware program för bildanalys som ImageJ. Fluorescensintensitet kurvor kan beräknas baserat på medelvärdet pixelintensiteten över tid inuti ett område / grind definierar mitotiska cellen (tekniken beskriven av Wolthuis et al. ^11). Inom ett isovolymetrisk fönster, som har varit beskrivad. tidigare ^6, formen och volymen av cellen förblir nästan konstant. Detta ger en logisk grund för att använda samma område / grind mellan kärnhöljet uppdelning förrän tidigt anafas för mätning genomsnittliga pixelintensiteter att manuellt beräkna cyklin B proteolys under prometafas, metafas och tidig anafas.

Använda Scan ^ R synsätt, kräver ytterligare matematiska analyser av nedbrytningsprodukter kurvor med särskild programvara, t.ex. Microsoft Excel, slussning på en enda cell nivå. Innovativa gating strategier för att tillåta automatisk information export av alla analyserade celler kan underlätta en mer tidseffektivt analys av hela cellpopulationer. En helautomatisk metod som omfattar alla celler spår kan leda till mer representativa resultat, ytterligare förbättra precisionen av denna teknik och därmed underlätta djupare insikter i regleringen av mitotisk avsluta.

Snabb och effektiv automatiserad bildtagning möjliggör vår modell tO skall användas i storskaliga screening-analyser. Här kan skärmar med shRNA bibliotek leda till identifiering av nya mitotiska tillsynsmyndigheter. Dessutom bör systemet vara användbart vid screening av små molekyler med avseende på deras potens i interferera med APC / C-beroende proteolys för att identifiera nya läkemedel för antimitotisk terapi.

Cyklin B kinetik har allmänt upp genom övervakning cyklin B-GFP fluorescensintensiteter. Här presenterar vi ett system som underlättar avgränsningen av cyklin B proteolys från hela proteinuttryck och utgör därför en värdefull ändring spridda tekniker inom mitos fältet ^6.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för S. Taylor för att ge pLPCX-histon H2-GFP plasmid. Vi tackar R. Mertelsmann för fortsatt stöd. Detta arbete stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Materials

Autofokus-inställningar	Histon H2-GFP (huvudsyfte förvärv inställningar)	Cyklin B-SNAP märkt med TMR Star (Förvärv inställningar)	Förvärv cykeltid Upprepningar
Grova autofokus + / -39 nm 24 Lager Fin autofokus + / -5,4 Um 14 Lager	GFP-filter som: Slutartid: 100 msek Ljusintensitet: 25%	TRITC filter som: Slutartid: 150 msek Ljusintensitet: 33,3%	2 till 5 minuter.
GFP-filter som: Slutartid: 12 ms Ljusintensitet: 12,5%			Upp till 48 timmar av fortsatt analys (begränsas av minskad luftfuktighet av 60%)

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reporter cell line	generated in-house as described 6	clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector	generated in-house as described 6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM	Gibco	21063-029	Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well	Costar	3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat	Ibidi	80826
Microscopy unit	Olympus	IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective	Olympus	UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software	Olympus	Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software	Olympus	Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)