Het bestuderen van Proteolyse van cycline B op de enkele cel niveau in Hele celpopulaties

Summary

Metafase naar anafase transitie wordt geactiveerd door middel van anafase-bevorderende complex (APC / C)-afhankelijke ubiquitinering en de daarop volgende vernietiging van cycline B. Hier hebben we een systeem dat, na pulse-chase etikettering, maakt het monitoren cycline B proteolyse in hele cel populaties en vergemakkelijkt de detectie van inmenging van de mitotische checkpoint.

Abstract

Gelijke verdeling van de chromosomen tussen de twee dochtercellen tijdens de celdeling is een voorwaarde voor het waarborgen van de genetische stabiliteit ^1. Onjuistheden in de loop van chromosoom scheiding zijn een kenmerk van maligniteit en geassocieerd met progressieve ziekte ^2-4. De assemblage van de spoel checkpoint (SAC) is een mitotische surveillance mechanisme dat tegenhoudt cellen in metafase tot elk chromosoom heeft een stabiele bipolaire gehechtheid aan de mitotische spindel ^1. De SAC oefent zijn functie door interferentie met de activerende APC / C subunit Cdc20 voor proteolyse van securin en cycline B en dus chromosoom scheiding en mitotische uitgang blokkeren. Onjuiste bevestiging van chromosomen voorkomt silencing van SAC signalering en veroorzaakt voortgezet remming van APC / C ^Cdc20 totdat het probleem is opgelost op chromosoom missegregation, aneuploïdie en kwaadaardige gezwellen ^te voorkomen ^1.

De meeste studies die de i aangepaktnfluence van onjuiste chromosomale beslag op APC / C-afhankelijke proteolyse maakte gebruik van as verstoring met depolymeriseren of microtubuli-stabiliserende medicijnen te bemoeien met chromosomale gehechtheid aan microtubuli. Omdat interferentie met microtubule kinetiek kan het transport en lokalisatie van kritische regulators beïnvloeden deze procedures voorzien van een risico op het induceren kunstmatige effecten ^5.

Om te onderzoeken hoe de SAC interfereert met APC / C-afhankelijke proteolyse van cycline B tijdens de mitose in onverstoorbaar celpopulaties, hebben we een histon H2-GFP-gebaseerd systeem waardoor de gelijktijdige monitoring van metafase afstemming van mitotische chromosomen en proteolyse van cycline B ⁶ .

Proteolytische profielen tonen, maakten wij een chimeer cycline B reporter molecuul met een C-terminale deel SNAP ⁶ (figuur 1). In een zelf-labelingsreactie, de SNAP-groep kan covalente bindingen vormen metalkylguanine-dragers (SNAP substraat) ^7,8 (figuur 1). SNAP substraatmoleculen zijn gemakkelijk verkrijgbaar en hebben een breed spectrum van verschillende fluorochromen. Chimere cycline B-SNAP moleculen worden gelabeld na toevoeging van het membraan doorlatend substraat SNAP het kweekmedium ⁷ (figuur 1). Na de labelingsreactie, de cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit druppels in een pulse-chase reactie-achtige wijze en fluorescentie-intensiteiten tijdens niveaus van cycline B afbraak ⁶ (figuur 1). Ons systeem vergemakkelijkt de controle op mitotische APC / C-afhankelijke Proteolyse in grote aantallen cellen (of meerdere celpopulaties) in parallel. Daardoor kan het systeem een ​​waardevol instrument om agenten / kleine moleculen die in staat zijn met proteolytische activiteit interfereren bij de metafase anafase om de overgang te identificeren. Bovendien is de synthese van cycline B tijdens mitose Onlangs werd een belangrijk mechanistischm in het bevorderen van een mitotische blok in muizen en mensen door het houden van cycline B expressie niveaus stabiel ^9,10, dit systeem ons in staat om cycline B proteolyse te analyseren als een element van een evenwichtige balans ^6.

Protocol

1. Zaaien van U2OS gebaseerde Cycline B-SNAP Reporter cellen (kloon 11 Cellen ⁶⁾ op Microscoop Chamber Slides

1. Trypsinize subconfluente SNAP reporter cellen mochten groeien asynchroon in logfase ten minste 48 uur.
2. Werken met 8 goed microscoop kamers (constante verdeling van cellen).

Voor het zaaien van cellen op 8 goed microscoop kamers met een constante verdeling over het gehele oppervlak van de microscoop kamer centrifuge 10.000 cellen en resuspendeer in 350 ul fenol rood-vrij normale groei medium (aangevuld met 10% foetaal runderserum, penicilline / streptomycine en natriumpyruvaat). Breng de celsuspensie microscoop kamer (figuur 2).

Werken met 8 goed microscoop kamers (maximaal celdichtheid in het midden).

Voor het zaaien van cellen op een hogere dichtheid in het centrum van de microscoop chambeh, laadt u de kamer met 300 ul fenol rood-vrij normale groei medium. Voorzichtig 5.000 cellen naar het centrum van de microscoop kamer (figuur 2).

Werken met 96 wells speciale optiek platen (constante verdeling van cellen).

Voor het zaaien van cellen op platen met 96 putjes bij een constante verdeling over het gehele oppervlak van de put, centrifugeer 5.000 cellen en resuspendeer in 300 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium. Breng de celsuspensie op een 96-well plaat. Afhankelijk van het totale aantal benodigde cellen bevattende wells, passen de cel aantal en het totale volume van de suspensie medium (figuur 2).

Werken met 96 putjes platen speciale optica (maximum celdichtheid in het midden).

Voor het zaaien van cellen op platen met 96 putjes, voorzichtig 1.500 cellen in 15 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium in een small druppel naar het midden van elk putje om beperking bereiken van celgroei in het midden van de put (figuur 2).

3. Toestaan ​​gezaaide cellen gedurende ten minste 18 uur groeien onder standaard celkweekomstandigheden (37 ° C, 100% luchtvochtigheid, _5% CO2).

2. Kleuring van Reporter Cellen met SNAP ondergrond

1. 30 min voor het begin van de kleuring mogelijk aliquots van fenolrood-vrij normaal kweekmedium op te warmen tot 37 ° C.
2. Voor de hantering van de SNAP substraat (in ons geval TMR ster) los TMR Star in DMSO tot een concentratie die in de stockoplossing van 400 uM, die kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
3. Voorafgaand aan kleuring verdunnen 0,5 pi TMR Star voorraadoplossing in 200 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C) tot een uiteindelijke concentratie van 1 labeling urn.
4. Bij normale groeimedium van asynchroon groeiende cellen en incubeer in lAbeling medium gedurende 25 min onder standaard kweekomstandigheden.
5. Verwijder etikettering medium en wassen cellen vier keer met fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C). Incubeer cellen in 300 ul fenol rood-vrij normaal kweekmedium (37 ° C) gedurende 30 minuten. Voorafgaand aan transport naar de microscoop vervangen met vers medium zonder fenolrood normaal kweekmedium (37 ° C) om de resterende ongebonden SNAP substraat te verwijderen.
6. Transportcellen de microscoop in een piepschuim doos op een voorverwarmde (37 ° C) warmteblok temperatuurvariatie te minimaliseren.

3. Meting van fluorescentie-intensiteit

1. Twee uur voor de analyse stel de temperatuur van de klimaatruimte bij 37 ° C in droge modus om het gehele microscoop met alle componenten te brengen op de gewenste temperatuur. Voorverwarmen voordat de luchtvochtigheid belangrijk te voorkomen condensatie en schade aan de microscoop.
2. Stel luchtvochtigheid to 60% en CO ₂ tot 5% voor de start van de analyse.
3. Start de scan ^ R Acquisition software en definiëren standaard instellingen (zie tabel 1).
4. Definieer de posities van de putjes te analyseren.
5. Definieer de At (verwerving cyclustijd) en het absolute aantal van de overname cycli.
6. Als een analyse van een groter aantal putten gewenst is, selecteer hardware autofocus, anders is het voldoende om alleen software autofocus gebruiken.
7. Start de overname en toezicht voor de eerste twee acquisitie cycli. De microscoop richt zich op de histone H2-GFP signaal met daaropvolgende acquisitie van een eerste beeld in dat kanaal voordat het filter wordt vervangen en de overeenkomstige TMR ster wordt verkregen (Figuur 3). Dit wordt herhaald voor alle posities in een goed en voor elk van de putjes te onderzoeken, voordat men weer de volgende cyclus.

4. Analyse van proteolytische profielen uzingen Scan ^ R

1. Start de Scan ^ R Analysis software en analyseren van de afbeeldingen met de celkernen, zoals die door histon H2-GFP, beschouwd als de belangrijkste object, met een drempel gebaseerd op signaalsterkte en waterscheiding algoritme te helpen bij het scheiden van naburige cellen. Een subobject bestaande uit een kern met cytoplasma wordt aangemaakt TMRstar analyse. (Belangrijke eigenschappen van het hoofddoel zijn X en Y-posities, de tijd, en de maximale en de gemiddelde intensiteit van GFP voor de belangrijkste object en de totale intensiteit gedeeld door gebied voor de TMRstar subobject.) Deze analyse proces kan enkele uren duren als gevolg van grote hoeveelheden gegevens hoeveelheden.
2. Naar de modus te traceren naar de subobject gemiddelde TMR Star fluorescentie-intensiteit in de tijd (cel sporen), toegewezen aan de geanalyseerde belangrijkste objecten (figuur 4) te visualiseren. Het aantal cellen te onderzoeken kunnen worden verkleind door gating op de metingen van ten minste 140 cycli met een hoge maximale intensiteit van H2-GFP. Op zoekbij grotere aantallen cellen kan een eerste representatieve en objectief beeld (figuur 4).
3. Selecteer een cel spoor van belang histone H2-GFP en TMR Star fluorescentie gelijktijdig te visualiseren op enkele cel (Figuur 5A).
4. Met behulp van de rechter muisknop op een cel van de rente en het genereren van een exporteerbaar fotogalerij ter illustratie van histon H2-GFP en cycline B-SNAP TMR-ster voor elke keer punt.
5. Ga naar de bevolking modus van de Scan ^ R Analyse software en de poort van de regio waar de cel van belang is vertegenwoordigd op de X vs Y dot plot (Figuur 5B).
6. Breng een nieuwe dot plot venster om de gated regio en visualiseren betekenen TMR Star fluorescentie-intensiteit in de tijd (Figuur 5C).
7. Gegevens exporteren (tijd en fluorescentie-intensiteit) naar Microsoft Excel voor verdere berekening.

5. Representatieve resultaten

Vijgure 5D en 5E tonen cycline B kinetiek, vertegenwoordigd door een TMR Star fluorescentie-intensiteit curve, van een cel die verloopt via een regelmatige mitose zonder tekenen van chromosomale afwijking (Figuur 5E). Bij verdichting van het cytoplasma na nucleaire envelop verdeling (NEBD, zoals aangegeven door de rode driehoek), TMR Star fluorescentie intensiteit laat een abrupte stijging tot isomorf venster (helder gedeelte van het diagram) wordt bereikt wanneer de cel binnenkomt prometafase ^6. Fluorescentie-intensiteit blijft op een stabiel niveau zolang de cel verloopt door profase metafase en begint snel na vallen alle chromosomen hebben een stabiele metafase plaat (figuur 5D en 5E). Deze daling gaat vooraf aan chromosoom scheiding bij anafase (blauwe stip op de curve). In het najaar van mitose het chromatine begint decondense aan (blauwe balken) en de cel neemt interfase morfologie, terwijl de fluorescentie-intensiteit curve benadert eenplateau die lager is dan het plateau voor mitose (figuur 5D en 5E).

Tabel 1. Standaardinstellingen zoals gebruikt voor de analyse van cycline B proteolyse. Histone H2-GFP werd gebruikt als referentie structuur om de focus vlak definiëren voor het meten van cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteit. Lichtintensiteiten gedurende de focus procedure lager zijn in vergelijking met beeldacquisitie instellingen om cumulatieve fototoxiciteit te voorkomen.

Figuur 1. Schematische weergave van de meting van cycline B proteolyse door expressie van een chimeer cycline B derivaat met afbraak soortgelijke kenmerken als de endogene eiwit. De afname in fluorescentie-intensiteit na pulse-chase labeling is een maat APC / C-activiteit.

Figuur 2. Analyse van cellen op 8 en slides of 96 well platen. Verdeling van hetcellen over het oppervlak van de put bereikt door hersuspensie in een eindvolume van 300 pi en wordt aanbevolen, wanneer slechts een of een paar posities handmatig gedefinieerd voor analyse. Verrijking van cellen in het middengebied wordt bereikt door toevoeging van cellen naar het centrum van voorgevulde of lege putjes. Deze techniek wordt aanbevolen in geval van geautomatiseerde beeldacquisitie in verschillende putten.

Figuur 3. Volgorde van de data-acquisitie. A) Detectie van histon H2-GFP wordt gebruikt voor focus vliegtuig definitie en monitoring van chromosomale uitlijning tijdens de mitose. B) fluorescentie-intensiteit van de fluorescentie-intensiteit Star TMR is een maat voor de absolute hoeveelheid pulse-chase gelabeld cycline B-SNAP.

Figuur 4. Vertegenwoordiger Scan ^ R Analyse software-gebaseerde weergave van de gemiddelde TMR Starfluorescentie-intensiteiten (totaal TMRstar intensiteit gedeeld door gebied) tijd. selectie van een representatieve cel trace (blauw). De bijbehorende afbeeldingen (rechts afgebeeld) kan de gelijktijdige visualisatie van histon H2-GFP (groen) en cycline B-SNAP (rood). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. A + B) Voorbeeld voor gating van punten die een cel van de rente op de XY-dot plot. C) Visualisatie van de gemiddelde TMRstar fluorescentie-intensiteit (totaal TMRstar intensiteit gedeeld door gebied) na verloop van tijd met behulp van de dot plot. D + E) Vertegenwoordiger fluorescentie-intensiteit curve van cycline B-SNAP met isomorfe venster (brigher veld op het schema) tussen NEBD (nucleaire envelop afbraak) en chromatine decondensatie (blauwe balk) zoals gegenereerd in Microsoft Excel. Anafase aangegeven met thij blauwe stip op de curve. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Film 1. Klik hier om aanvullende film te bekijken .

Discussion

We presenteren hier een live-cell imaging benadering het vergemakkelijken van de gelijktijdige bewaking van cycline B proteolyse en chromosoom uitlijning. Deze aanpak maakt het mogelijk de studie van de mitotische controle in celpopulaties onverstoorbaar op de enkele cel niveau. Cycline B afbraakcurven vergemakkelijken direct inzicht in de activiteit van de APC / C en daarmee indirect geven de status van de SAC ^6.

Deze benadering, hoewel vastgesteld op basis van de Scan ^ R software kan gemakkelijk worden gereproduceerd op een vergelijkbare microscoop station. Bovendien, met behulp van onze retrovirale cycline B-SNAP expressieconstruct kan een reporter cellijn gemakkelijk worden vastgesteld door stabiele retrovirale integratie in elke gewenste cellijn. Om het systeem nog flexibeler, kan de chimere SNAP eiwitten worden gekleurd met verschillende fluorochromen.

De implementatie van histon H2-GFP, naast de eis bij de monitoring chromosoom uitlijning, facilitates snel en gemakkelijk autofocus. Autofocus en intensiteit instellingen zijn ook afhankelijk van de aard van de cel en moet worden vastgesteld voor elke cellijn. De overname van proteolytische profielen van grote aantallen celdelingen met Scan ^ R technologie bovendien konden wij kiezen voor enkele mitoses, welk chromosoom uitlijnfouten heeft. Dit stelde ons in staat om de verschillen tussen de proteolytische profielen van afwijkende en regelmatige sectoren ⁶ definiëren.

Mitoses weergeven van chromosomale afwijking kan ook worden geselecteerd door analyse van ruwe beeld stacks, hoewel dit minder tijd-efficiënt. Cycline B-SNAP fluorescentie-intensiteiten kunnen worden gekwantificeerd aan de hand freeware programma's voor beeldanalyse, zoals ImageJ. Fluorescentieintensiteit curves kan worden berekend op basis van de gemiddelde pixelintensiteit tijd binnen een ruimte / gate waarin de mitose (techniek beschreven door Wolthuis et al.. ^11). Binnen een isovolumetrische venster heeft die is beschrevend voordien ^6, de vorm en het volume van de cel blijven nagenoeg constant. Dit biedt een basis voor het gebruik van hetzelfde gebied / poort tussen nucleaire envelop afbraak tot begin anafase voor het meten van de gemiddelde pixelintensiteiten om cycline B proteolyse handmatig te schatten tijdens prometafase, metafase en vroege anafase.

De scan-^ R-aanpak, verdere wiskundige analyses van de afbraak weer door middel van specifieke software, zoals Microsoft Excel, vereist gating op de enkele cel niveau. Innovatieve gating strategie van de geautomatiseerde gegevensverwerking export van alle geanalyseerde cellen mogelijk te maken zou kunnen vergemakkelijken een meer tijd-efficiënte analyse van het volledige cel populaties. Een volledig geautomatiseerde aanpak, die alle cellen sporen zou kunnen leiden tot meer representatieve resultaten, verder te verbeteren precisie van deze techniek en dus diepere inzichten te vergemakkelijken in de regulatie van mitotische uitgang.

Snelle en efficiënte geautomatiseerde beeld overname stelt ons model to worden gebruikt in grootschalige screening analyses. Hier kan schermen met behulp van shRNA bibliotheken leiden tot de identificatie van nieuwe mitotische toezichthouders. Bovendien moet het systeem bruikbaar zijn bij het screenen van kleine moleculen met betrekking tot hun vermogen in interfereren met APC / C-afhankelijke proteolyse om nieuwe geneesmiddelen te identificeren voor antimitotische therapie.

Cycline B kinetiek veel aandacht gehad door toezicht cycline B-GFP fluorescentie-intensiteiten. Hier presenteren we een systeem dat de afbakening van cycline B proteolyse vergemakkelijkt uit hele eiwitexpressie en vormt dus een waardevolle wijziging van wijd verspreid technieken op het mitose veld ^6.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor S. Taylor voor het verstrekken van de pLPCX-histon H2-GFP plasmide. Wij danken R. Mertelsmann voor continue ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Materials

Autofocus instellingen	Histon H2-GFP (hoofddoel overname-instellingen)	Cycline B-SNAP gelabeld met TMR Star (Verwerving instellingen)	Acquisitie cyclustijd Herhalingen
Grof autofocus + / -39 micrometer 24 Lagen Fijn autofocus + / -5,4 Micrometer 14 Lagen	GFP filter in te stellen: Sluitertijd: 100 ms Lichtintensiteit: 25%	TRITC filter in te stellen: Sluitertijd: 150 msec Lichtintensiteit: 33,3%	2 tot 5 min.
GFP filter in te stellen: Sluitertijd: 12 msec Lichtintensiteit: 12,5%			Tot 48 uur van verdere analyse (beperkt door verminderde vochtigheid van 60%)

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reporter cell line	generated in-house as described 6	clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector	generated in-house as described 6	pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM	Gibco	21063-029	Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star	New England Biolabs	S9105S	Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well	Costar	3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat	Ibidi	80826
Microscopy unit	Olympus	IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective	Olympus	UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software	Olympus	Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software	Olympus	Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)