Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

doi: 10.3791/4239 Published: September 17, 2012

Summary

الطورية إلى طور الصعود يتم تشغيل من خلال الانتقال طور الصعود تعزيز والمعقدة (APC / C) التي تعتمد على ubiquitination والتدمير اللاحق للB. السيكلين هنا، أنشأنا نظاما، وبعد مطاردة نبض وضع العلامات، ويسمح برصد السيكلين B التحلل البروتيني في الخلية بأكملها السكان يسهل الكشف عن تدخل من قبل نقطة تفتيش تابعة للالإنقسامية.

Abstract

التوزيع المتساوي للصبغيات بين اثنين من الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية هو شرط أساسي لضمان الاستقرار الجيني 1. أخطاء أثناء فصل كروموسوم هي السمة المميزة للخباثة والمرتبطة بأمراض التدريجي 2-4. حاجز الجمعية المغزل (SAC) هي آلية المراقبة الإنقسامية أن يعيق الخلايا في الطورية حتى كل كروموسوم واحد أنشأت مرفق ثنائي القطب مستقرة إلى المغزل التفتلي 1. وتمارس وظيفتها SAC من التدخل في تفعيل APC / C الوحيدات Cdc20 لمنع التحلل البروتيني من securin وB السيكلين وبالتالي فصل كروموسوم والخروج الإنقسامية. المرفقات غير لائق من الكروموسومات يمنع إسكات الإشارة ويسبب تثبيط SAC استمرت من APC / C Cdc20 حتى يتم حل المشكلة لتجنب missegregation كروموسوم، وعدم توازن الصبغيات زوائد الخبيثة 1.

معظم الدراسات التي تناولت طاستغرق nfluence من المرفقات غير لائق على الكروموسومات APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني الاستفادة من تعطيل أو المغزل باستخدام depolymerizing أنيبيب استقرار المخدرات للتدخل في المرفقات الكروموسومات لميكروتثبول. منذ التدخل في حركية أنيبيب يمكن أن تؤثر على النقل والترجمة من المنظمين الحرجة، هذه الإجراءات تحمل خطر إحداث تأثيرات مصطنعة 5.

أنشأنا لدراسة كيفية SAC يتداخل مع APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني B من خلال السيكلين الانقسام في الخلية رابط الجأش السكان، وهو نظام هيستون H2-GFP-يعتمد الامر الذي اتاح للرصد في وقت واحد من الكروموسومات الطورية المحاذاة الإنقسامية والتحلل البروتيني B من 6 السيكلين .

لتصوير ملامح بروتين، ولدت لدينا B السيكلين خيالية جزيء مراسل مع شاردة SNAP C-محطة 6 (الشكل 1). في رد فعل ذاتي وضع العلامات، وSNAP-شاردة قادرة على تشكيل روابط تساهمية معalkylguanine-ناقلات (الركيزة SNAP) 7،8 (الشكل 1). جزيئات الركيزة SNAP متوفرة بسهولة وتحمل مجموعة واسعة من fluorochromes مختلفة. السيكلين خيالية B-SNAP الجزيئات تصبح المسمى عند إضافة الركيزة SNAP-نفاذية الغشاء إلى النمو المتوسط ​​7 (الشكل 1). بعد رد الفعل وضع العلامات، وكثافة السيكلين B-SNAP مضان انخفاض في رد فعل يشبه نبض مطاردة بطريقة وشدة مضان تعكس مستويات السيكلين B تدهور 6 (الشكل 1). نظامنا يسهل رصد التحلل البروتيني APC / C التي تعتمد على الإنقسامية في أعداد كبيرة من الخلايا (أو خلية السكان عدة) في نفس الوقت. وبالتالي، قد يكون النظام أداة قيمة لتحديد وكلاء / الجزيئات الصغيرة التي تكون قادرة على التدخل في النشاط بروتين في طور الصعود إلى الطورية الانتقالية. وعلاوة على ذلك، وتوليف B السيكلين خلال الانقسام وقد تم مؤخرا كما اقترح على أهمية mechanisم في تعزيز كتلة الإنقسامية في الفئران والبشر عن طريق الحفاظ على مستويات مستقرة السيكلين التعبير B 9،10، تمكين هذا النظام لنا لتحليل السيكلين التحلل البروتيني B وعنصر واحد من توازن متوازنة 6.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. البذر من خلايا السيكلين U2OS مراسلة مقرها B-SNAP (استنساخ 11 خلية 6) على الشرائح مجهر غرفة

  1. يعرض للتريبسين subconfluent الخلايا مراسل SNAP أن سمح لتنمو بشكل غير متزامن في مرحلة لسجل ما لا يقل عن 48 ساعة.
  2. العمل مع 8 غرف المجهر بشكل جيد (توزيع ثابتة من الخلايا).

لبذر الخلايا على 8 غرف المجهر بشكل جيد في توزيع ثابت عبر كامل سطح الدائرة المجهر، الطرد المركزي 10000 الخلايا و resuspend في 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ والبنسلين / الستربتوميسين والصوديوم البيروفات). نقل تعليق الخلية إلى الدائرة المجهر (الشكل 2).

العمل مع 8 غرف المجهر جيدا (الحد الأقصى كثافة خلية في الوسط).

لبذر الخلايا في أعلى كثافة في وسط chamb المجهرإيه، تحميل غرفة مع 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي. إضافة خلايا بعناية ل5000 مركز للغرفة المجهر (الشكل 2).

العمل مع 96 لوحات خاصة البصريات جيدا (توزيع ثابتة من الخلايا).

لبذر الخلايا على 96 لوحات جيدة في توزيع ثابت عبر كامل سطح البئر، أجهزة الطرد المركزي الخلايا و resuspend 5000 في 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي. نقل الخلية إلى تعليق لوحة 96-أيضا. اعتمادا على العدد الإجمالي للخلية التي تحتوي على آبار المطلوبة، وضبط عدد الخلايا وحجم إجمالي المتوسطة التعليق (الشكل 2).

العمل مع 96 لوحات خاصة البصريات جيدا (الحد الأقصى كثافة خلية في الوسط).

للبذار من الخلايا على 96 لوحات جيدة، إضافة بعناية 1500 الخلايا في 15 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي في األصغرانخفاض L إلى وسط كل بئر إلى تحقيق تقييد نمو الخلايا إلى وسط البئر (الشكل 2).

  1. تسمح الخلايا في النمو لالمصنفة لا يقل عن 18 ساعة تحت ظروف قياسية زراعة الخلايا (37 ° C والرطوبة الجوية بنسبة 100٪، 5٪ CO 2).

2. تلطيخ من خلايا مراسل مع الركيزة SNAP

  1. 30 دقيقة قبل بداية الإجراء تلطيخ تسمح مأخوذة من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي في عملية الاحماء إلى 37 ° C.
  2. لسهولة التعامل من الركيزة SNAP (في حالتنا TMR ستار) حل TMR نجوم في DMSO للحصول على تركيز في محلول من 400 ميكرومتر، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. قبل تلطيخ، تمييع 0،5 ميكرولتر من حل TMR الأسهم نجوم في 200 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) للحصول على تركيز وضع العلامات النهائية من 1 ميكرومتر.
  4. إزالة العادي المتوسطة النمو المتزايد من الخلايا بشكل غير متزامن واحتضان في Labeling متوسطة لمدة 25 دقيقة في ظل ظروف ثقافة القياسية.
  5. إزالة وصفها المتوسطة وغسل الخلايا أربع مرات مع الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C). احتضان خلايا في 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) لمدة 30 دقيقة. قبل نقل إلى المجهر استبدال المتوسطة مع الفينول الحمراء الطازجة الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) لإزالة بقايا الركيزة SNAP غير منضم.
  6. النقل إلى الخلايا المجهر في مربع الستايروفوم على قبل تحسنت (37 ° C) كتلة الحرارة لتقليل التباين في درجة الحرارة.

3. قياس كثافة مضان

  1. ساعتين قبل التحليل ضبط درجة حرارة الهواء للغرفة المناخ إلى 37 ° C في وضع الجافة من أجل تحقيق المجهر كامل مع جميع مكوناته إلى درجة الحرارة المطلوبة. قبل التدفئة قبل تعيين الرطوبة المهم تجنب التكثيف واللاحقة الأضرار التي لحقت المجهر.
  2. ضبط طن الرطوبة الجويةس 60٪ CO 2 وإلى 5٪ قبل بداية التحليل.
  3. بدء المسح الضوئي اقتناء البرمجيات R ^ وتحديد الإعدادات القياسية (انظر الجدول 1).
  4. تحديد مواقع الآبار لتحليلها.
  5. تحديد Δt (اقتناء دورة الزمن) والعدد المطلق للدورات الاستحواذ.
  6. إذا هو المطلوب تحليل عدد أكبر من الآبار، حدد ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وإلا فإنه يكفي لاستخدام البرمجيات ضبط تلقائي للصورة وحدها.
  7. بدء عملية الاستحواذ والإشراف على دورات أول عملية استحواذ اثنين. سوف المجهر التركيز على إشارة H2-GFP هيستون، مع اكتساب اللاحق للصورة الأولى في تلك القناة قبل تغيير فلتر ويتم الحصول على صورة ستار TMR المقابلة (الشكل 3). ثم يتم تكرار هذا لجميع المناصب داخل بئر ولكل من الآبار لفحصها، قبل تكرار مرة أخرى في الدورة القادمة.

4. تحليل الملامح ش بروتينالغناء المسح الضوئي ^ R

  1. بدء المسح الضوئي تحليل R ^ البرمجيات وتحليل الصور مع نوى الخلايا، كما تصور هيستون H2-GFP، الذي يعرف بأنه الهدف الرئيسي، وذلك باستخدام الحد الأدنى يعتمد على شدة الإشارة وخوارزمية مستجمعات المياه للمساعدة في فصل الخلايا المجاورة. وينبغي إنشاء البناء معدلات تتكون من نواة مع السيتوبلازم للتحليل TMRstar. (خصائص هامة للكائن الرئيسية هي X Y والمواقف، والوقت، والحد الأقصى وتعني شدة GFP للكائن الرئيسي وكثافة من حيث المساحة الإجمالية مقسومة على البناء معدلات TMRstar.) هذه العملية قد يستغرق عدة ساعات التحليل بسبب البيانات الكبيرة الكميات.
  2. تغيير لتتبع وضع تصور البناء معدلات كثافة مضان يعني ستار TMR على مر الزمن (آثار الخلية)، المخصصة لتحليل الكائنات الرئيسية (الشكل 4). ويمكن تضييق عدد الخلايا للفحص بنسبة النابضة على تلك القياسات دائم لا يقل عن 140 دورات ومع كثافة عالية كحد أقصى من H2-GFP. يبحثفي أعداد أكبر من الخلايا يسمح لأول ممثل وعرض الهدف (الشكل 4).
  3. حدد خلية تتبع لمصلحة لتصور هيستون H2-GFP ومضان TMR ستار في وقت واحد على مستوى خلية واحدة (الشكل 5A).
  4. باستخدام زر الماوس الأيمن على الخلية من الاهتمام وإنشاء معرض صور للتصدير من التوضيح هيستون H2-GFP والسيكلين B-SNAP TMR ستار على كل نقطة زمنية واحدة.
  5. تغيير إلى وضع السكان من البرنامج ^ المسح الضوئي والتحليل R بوابة المنطقة حيث يتم تمثيل الخلية الفائدة على المؤامرة مقابل X Y نقطة (الشكل 5B).
  6. تطبيق مؤامرة نقطة نافذة جديدة للمنطقة مسور وتصور يعني TMR كثافة مضان نجوم على مر الزمن (الشكل 5C).
  7. بيانات الصادرات (الوقت وكثافة مضان) إلى Microsoft Excel لحساب أخرى.

5. ممثل النتائج

تينولدى عودتهم 5D 5E تصوير السيكلين B حركية، ممثلة منحنى ستار TMR كثافة مضان، من خلية العائدات من خلال الانقسام العادية دون اختلال الكروموسومات علامات (الشكل 5E). على الضغط من السيتوبلازم بعد انهيار المغلف النووية (NEBD، كما يتبين من المثلث الأحمر)، TMR كثافة مضان نجوم يظهر زيادة مفاجئة حتى يتم الوصول إلى نافذة تماثلية (أكثر إشراقا المنطقة في الرسم البياني) عندما يدخل الخلية طليعة الطور التالي 6. كثافة مضان ما زال عند مستوى مستقر طالما عائدات الخلية من خلال الطور التمهيدي والطورية ثم يبدأ في الانخفاض بسرعة مرة واحدة كل من الكروموسومات وضعت لوحة الطورية مستقرة (الشكل 5D و5E). هذا الانخفاض تسبق فصل الصبغي خلال طور الصعود (نقطة زرقاء على منحنى). في أواخر الانقسام لونين يبدأ decondense (الحانات الأزرق) ويعتمد التشكل الخلية الطور البيني في حين أن منحنى كثافة مضان تقترب منالهضبة التي هي أقل من الهضبة قبل الانقسام (الشكل 5D و5E).

الجدول 1. الإعدادات القياسية المستخدمة لتحليل التحلل البروتيني B السيكلين. هيستون تم استخدام H2-GFP كهيكل إشارة إلى تعريف الطائرة التركيز لقياس كثافة مضان السيكلين B-SNAP. شدة الضوء أثناء إجراء التركيز هي أقل بالمقارنة مع إعدادات الحصول على الصور لتجنب الضيائية التراكمي.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي لقياس التحلل البروتيني B السيكلين من خلال التعبير عن مشتق السيكلين B خيالية ذات الخصائص المماثلة لتدهور البروتين الذاتية. انخفاض في كثافة مضان بعد مطاردة نبض وضع العلامات هو مقياس للنشاط APC-C /.

الشكل 2
الشكل 2. تحليل الخلايا في 8 شرائح أو 96 لوحات جيدة أيضا. التوزيع المنتظم للويتحقق عبر خلايا سطح البئر من إعادة تعليق في الحجم النهائي من 300 ميكرولتر ويوصى، إذا تم تعريف يدويا فقط واحد أو عدد قليل مواقف للتحليل. ويتحقق إثراء الخلايا في المنطقة من قبل مركز بالإضافة الخلايا إلى مركز الآبار مملوءة مسبقا أو فارغة. ويوصى هذا الأسلوب في حالة الحصول على الصور الآلي في الآبار المختلفة.

الشكل 3
الشكل 3. تسلسل الحصول على البيانات ويستخدم لكشف) من هيستون H2-GFP لتعريف الطائرة التركيز ورصد محاذاة الكروموسومات خلال الانقسام. B) كثافة مضان من شدة مضان ستار TMR هو مقياس لكمية مطلقة من نبض مطاردة المسمى السيكلين B-SNAP.

الشكل 4
الشكل 4. ممثل المسح الضوئي تصوير ^ R التحليل المستندة إلى البرامج من ستار TMR متوسطمضان شدة (المجموع مقسوما على كثافة TMRstar المنطقة) مع مرور الوقت. اختيار ممثل تتبع الخلية (اللون الأزرق). الصور المقابلة (كما هو موضح على اليمين) السماح للوقت واحد من التصور هيستون H2-GFP (الخضراء) والسيكلين B-SNAP (الحمراء). اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5
الشكل 5. A + B) مثال لالنابضة من النقاط التي تمثل خلية من الفائدة على المؤامرة XY-نقطة. C) التصور من شدة يعني مضان TMRstar (المجموع مقسوما على كثافة TMRstar المنطقة) مع مرور الوقت باستخدام مؤامرة نقطة. D + E) الممثل منحنى كثافة مضان من السيكلين B-SNAP مع نافذة تماثلية (brigher ميدانية على الرسم البياني) بين decondensation NEBD (النووية انهيار المغلف) والكروماتين (الأزرق بار) ولدت في Microsoft Excel. يشار إلى طور الصعود من قبل رانه نقطة زرقاء على المنحنى. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الفيلم 1. انقر هنا لمشاهدة الفيلم تكميلية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نقدم هنا نهج الخلية الحية التصوير القائم على تيسير رصد في وقت واحد من التحلل البروتيني B السيكلين والمواءمة كروموسوم. هذا النهج يتيح للدراسة في السيطرة الإنقسامية رابط الجأش السكان الخلية على مستوى خلية واحدة. منحنيات السيكلين تدهور B تسهيل رؤى مباشرة في نشاط APC / C وبالتالي تعكس بشكل غير مباشر عن حالة SAC 6.

هذا النهج، على الرغم من إنشاء برنامج يقوم على المسح الضوئي ^ R، يمكن بسهولة يمكن تتكرر في أي محطة المجهر قابلة للمقارنة. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام لدينا فيروسات بناء السيكلين التعبير B-SNAP، يمكن بسهولة خط الخلية مراسل ينشئه التكامل فيروسات مستقرة في أي خط الخلية المطلوبة. لجعل النظام أكثر مرونة، يمكن ملطخة البروتينات SNAP خيالية مع fluorochromes المختلفة.

تنفيذ هيستون H2-GFP، إلى جانب شرط المحاذاة في كروموسوم الرصد والقوات الجويةlitates autofocusing بسرعة وسهولة. ضبط تلقائي للصورة وإعدادات الكثافة تعتمد أيضا على نوع من الخلايا، ويجب أن ينشأ لكل سطر الخلية. اكتساب ملامح بروتين أعداد كبيرة من الانقسامات الخلوية باستخدام المسح الضوئي ^ R سمحت التكنولوجيا وعلاوة على ذلك لنا لتحديد لmitoses واحد، والذي أظهر أخطاء المحاذاة كروموسوم. مكننا هذا من تحديد الاختلافات بين ملامح بروتين من الانقسامات الشاذة والعادية 6.

ويمكن أيضا عرض اختلال الكروموسومات Mitoses يتم اختيار من مداخن تحليل الصور الخام، وعلى الرغم من أن هذا هو وقت أقل كفاءة. يمكن كميا السيكلين B-SNAP شدة مضان باستخدام برامج مجانية لتحليل الصور مثل يماغيج. ويمكن حساب منحنيات كثافة مضان على أساس كثافة بكسل يعني مع مرور الوقت داخل منطقة / البوابة تحديد الخلية الإنقسامية (تقنية وصفها آخرون Wolthuis 11). ضمن إطار isovolumetric، والتي كانت تصفد سابقا شكل وحجم الخلية تظل ثابتة تقريبا. هذا يوفر الأساس المنطقي لاستخدام نفس المنطقة / بوابة بين انهيار المغلف النووية حتى أوائل طور الصعود لقياس شدة بكسل يعني لتقدير يدويا السيكلين B التحلل البروتيني خلال طليعة الطور التالي، طور الصعود والطورية في وقت مبكر.

المسح الضوئي باستخدام النهج القائم على ^ R، تحليلات رياضية مزيد من التدهور منحنيات باستخدام برامج معينة، مثل Microsoft Excel، يتطلب النابضة على مستوى خلية واحدة. قد استراتيجيات مبتكرة لالنابضة تسمح الآلي تصدير البيانات من كافة الخلايا تحليل تسهيل إجراء تحليل أكثر كفاءة في استخدام الوقت من السكان خلية كاملة. وربما يكون التوجه مؤتمتة بالكامل تغطي كل آثار الخلية يؤدي إلى نتائج أكثر تمثيلا وتعزيز دقة هذه التقنية وبالتالي تسهيل أعمق نظرة ثاقبة لتنظيم خروج الإنقسامية.

سريعة وفعالة تمكن الحصول على الصور الآلي لدينا نموذج رأن تستخدم في التحليلات س الفرز على نطاق واسع. هنا، قد الشاشات باستخدام مكتبات shRNA تفضي إلى التعرف المنظمين الإنقسامية الرواية. وعلاوة على ذلك، ينبغي للنظام أن يكون مفيدا في فحص الجزيئات الصغيرة فيما يتعلق قوتها في التدخل في APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني من أجل تحديد أدوية جديدة لعلاج مضاد التفتل.

تم السيكلين حركية B موجهة على نطاق واسع من خلال رصد السيكلين B-GFP شدة مضان. هنا، نقدم نظام يسهل ترسيم التحلل البروتيني B السيكلين من التعبير البروتين الكامل، ويشكل بالتالي اجراء تعديل قيمة لتقنيات وزعت على نطاق واسع في مجال الانقسام 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونحن ممتنون لتايلور S. لتوفير pLPCX-H2-هيستون GFP البلازميد. نشكر R. Mertelsmann للدعم المستمر. وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث.

Materials

ضبط تلقائي للصورة ضبط هيستون H2-GFP (إعدادات الرئيسي اقتناء كائن) السيكلين B-SNAP المسمى مع نجوم TMR
(إعدادات الاستحواذ)
التكرار اقتناء دورة الزمن
ضبط تلقائي للصورة الخشنة + / -39 ميكرون 24 طبقات
ضبط تلقائي للصورة الجميلة
+ / -5.4 ميكرومتر 14 طبقات
تعيين مرشح GFP:
زمن التعرض: 100 ميللي ثانية
شدة الضوء: 25٪
تعيين مرشح TRITC:
زمن التعرض: 150 ميللي ثانية
شدة الضوء: 33.3٪
2-5 دقيقة.
تعيين مرشح GFP:
زمن التعرض: 12 ميللي ثانية
شدة الضوء: 12.5٪
ما يصل إلى 48 ساعة من التحليل المستمر (محدودة بسبب الرطوبة الجوية انخفاض 60٪)
Name Company Catalog Number Comments
Reporter cell line generated in-house as described 6 clone 11 reporter cells
(U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector generated in-house as described 6 pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM Gibco 21063-029 Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star New England Biolabs S9105S Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well Costar 3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat Ibidi 80826
Microscopy unit Olympus IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective Olympus UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software Olympus Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software Olympus Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
  2. Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
  3. Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
  4. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
  5. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
  6. Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
  7. Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
  8. Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
  9. Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
  10. Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
  11. Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnerch, D., Follo, M., Felthaus, J., Engelhardt, M., Wäsch, R. Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations. J. Vis. Exp. (67), e4239, doi:10.3791/4239 (2012).More

Schnerch, D., Follo, M., Felthaus, J., Engelhardt, M., Wäsch, R. Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations. J. Vis. Exp. (67), e4239, doi:10.3791/4239 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter