Summary
الطورية إلى طور الصعود يتم تشغيل من خلال الانتقال طور الصعود تعزيز والمعقدة (APC / C) التي تعتمد على ubiquitination والتدمير اللاحق للB. السيكلين هنا، أنشأنا نظاما، وبعد مطاردة نبض وضع العلامات، ويسمح برصد السيكلين B التحلل البروتيني في الخلية بأكملها السكان يسهل الكشف عن تدخل من قبل نقطة تفتيش تابعة للالإنقسامية.
Abstract
التوزيع المتساوي للصبغيات بين اثنين من الخلايا الوليدة أثناء انقسام الخلية هو شرط أساسي لضمان الاستقرار الجيني 1. أخطاء أثناء فصل كروموسوم هي السمة المميزة للخباثة والمرتبطة بأمراض التدريجي 2-4. حاجز الجمعية المغزل (SAC) هي آلية المراقبة الإنقسامية أن يعيق الخلايا في الطورية حتى كل كروموسوم واحد أنشأت مرفق ثنائي القطب مستقرة إلى المغزل التفتلي 1. وتمارس وظيفتها SAC من التدخل في تفعيل APC / C الوحيدات Cdc20 لمنع التحلل البروتيني من securin وB السيكلين وبالتالي فصل كروموسوم والخروج الإنقسامية. المرفقات غير لائق من الكروموسومات يمنع إسكات الإشارة ويسبب تثبيط SAC استمرت من APC / C Cdc20 حتى يتم حل المشكلة لتجنب missegregation كروموسوم، وعدم توازن الصبغيات زوائد الخبيثة 1.
معظم الدراسات التي تناولت طاستغرق nfluence من المرفقات غير لائق على الكروموسومات APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني الاستفادة من تعطيل أو المغزل باستخدام depolymerizing أنيبيب استقرار المخدرات للتدخل في المرفقات الكروموسومات لميكروتثبول. منذ التدخل في حركية أنيبيب يمكن أن تؤثر على النقل والترجمة من المنظمين الحرجة، هذه الإجراءات تحمل خطر إحداث تأثيرات مصطنعة 5.
أنشأنا لدراسة كيفية SAC يتداخل مع APC / C التي تعتمد على التحلل البروتيني B من خلال السيكلين الانقسام في الخلية رابط الجأش السكان، وهو نظام هيستون H2-GFP-يعتمد الامر الذي اتاح للرصد في وقت واحد من الكروموسومات الطورية المحاذاة الإنقسامية والتحلل البروتيني B من 6 السيكلين .
لتصوير ملامح بروتين، ولدت لدينا B السيكلين خيالية جزيء مراسل مع شاردة SNAP C-محطة 6 (الشكل 1). في رد فعل ذاتي وضع العلامات، وSNAP-شاردة قادرة على تشكيل روابط تساهمية معalkylguanine-ناقلات (الركيزة SNAP) 7،8 (الشكل 1). جزيئات الركيزة SNAP متوفرة بسهولة وتحمل مجموعة واسعة من fluorochromes مختلفة. السيكلين خيالية B-SNAP الجزيئات تصبح المسمى عند إضافة الركيزة SNAP-نفاذية الغشاء إلى النمو المتوسط 7 (الشكل 1). بعد رد الفعل وضع العلامات، وكثافة السيكلين B-SNAP مضان انخفاض في رد فعل يشبه نبض مطاردة بطريقة وشدة مضان تعكس مستويات السيكلين B تدهور 6 (الشكل 1). نظامنا يسهل رصد التحلل البروتيني APC / C التي تعتمد على الإنقسامية في أعداد كبيرة من الخلايا (أو خلية السكان عدة) في نفس الوقت. وبالتالي، قد يكون النظام أداة قيمة لتحديد وكلاء / الجزيئات الصغيرة التي تكون قادرة على التدخل في النشاط بروتين في طور الصعود إلى الطورية الانتقالية. وعلاوة على ذلك، وتوليف B السيكلين خلال الانقسام وقد تم مؤخرا كما اقترح على أهمية mechanisم في تعزيز كتلة الإنقسامية في الفئران والبشر عن طريق الحفاظ على مستويات مستقرة السيكلين التعبير B 9،10، تمكين هذا النظام لنا لتحليل السيكلين التحلل البروتيني B وعنصر واحد من توازن متوازنة 6.
Protocol
1. البذر من خلايا السيكلين U2OS مراسلة مقرها B-SNAP (استنساخ 11 خلية 6) على الشرائح مجهر غرفة
- يعرض للتريبسين subconfluent الخلايا مراسل SNAP أن سمح لتنمو بشكل غير متزامن في مرحلة لسجل ما لا يقل عن 48 ساعة.
- العمل مع 8 غرف المجهر بشكل جيد (توزيع ثابتة من الخلايا).
لبذر الخلايا على 8 غرف المجهر بشكل جيد في توزيع ثابت عبر كامل سطح الدائرة المجهر، الطرد المركزي 10000 الخلايا و resuspend في 350 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ والبنسلين / الستربتوميسين والصوديوم البيروفات). نقل تعليق الخلية إلى الدائرة المجهر (الشكل 2).
العمل مع 8 غرف المجهر جيدا (الحد الأقصى كثافة خلية في الوسط).
لبذر الخلايا في أعلى كثافة في وسط chamb المجهرإيه، تحميل غرفة مع 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي. إضافة خلايا بعناية ل5000 مركز للغرفة المجهر (الشكل 2).
العمل مع 96 لوحات خاصة البصريات جيدا (توزيع ثابتة من الخلايا).
لبذر الخلايا على 96 لوحات جيدة في توزيع ثابت عبر كامل سطح البئر، أجهزة الطرد المركزي الخلايا و resuspend 5000 في 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي. نقل الخلية إلى تعليق لوحة 96-أيضا. اعتمادا على العدد الإجمالي للخلية التي تحتوي على آبار المطلوبة، وضبط عدد الخلايا وحجم إجمالي المتوسطة التعليق (الشكل 2).
العمل مع 96 لوحات خاصة البصريات جيدا (الحد الأقصى كثافة خلية في الوسط).
للبذار من الخلايا على 96 لوحات جيدة، إضافة بعناية 1500 الخلايا في 15 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي في األصغرانخفاض L إلى وسط كل بئر إلى تحقيق تقييد نمو الخلايا إلى وسط البئر (الشكل 2).
- تسمح الخلايا في النمو لالمصنفة لا يقل عن 18 ساعة تحت ظروف قياسية زراعة الخلايا (37 ° C والرطوبة الجوية بنسبة 100٪، 5٪ CO 2).
2. تلطيخ من خلايا مراسل مع الركيزة SNAP
- 30 دقيقة قبل بداية الإجراء تلطيخ تسمح مأخوذة من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي في عملية الاحماء إلى 37 ° C.
- لسهولة التعامل من الركيزة SNAP (في حالتنا TMR ستار) حل TMR نجوم في DMSO للحصول على تركيز في محلول من 400 ميكرومتر، والتي يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.
- قبل تلطيخ، تمييع 0،5 ميكرولتر من حل TMR الأسهم نجوم في 200 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) للحصول على تركيز وضع العلامات النهائية من 1 ميكرومتر.
- إزالة العادي المتوسطة النمو المتزايد من الخلايا بشكل غير متزامن واحتضان في Labeling متوسطة لمدة 25 دقيقة في ظل ظروف ثقافة القياسية.
- إزالة وصفها المتوسطة وغسل الخلايا أربع مرات مع الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C). احتضان خلايا في 300 ميكرولتر من الفينول الحمراء الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) لمدة 30 دقيقة. قبل نقل إلى المجهر استبدال المتوسطة مع الفينول الحمراء الطازجة الخالية المتوسطة النمو الطبيعي (37 ° C) لإزالة بقايا الركيزة SNAP غير منضم.
- النقل إلى الخلايا المجهر في مربع الستايروفوم على قبل تحسنت (37 ° C) كتلة الحرارة لتقليل التباين في درجة الحرارة.
3. قياس كثافة مضان
- ساعتين قبل التحليل ضبط درجة حرارة الهواء للغرفة المناخ إلى 37 ° C في وضع الجافة من أجل تحقيق المجهر كامل مع جميع مكوناته إلى درجة الحرارة المطلوبة. قبل التدفئة قبل تعيين الرطوبة المهم تجنب التكثيف واللاحقة الأضرار التي لحقت المجهر.
- ضبط طن الرطوبة الجويةس 60٪ CO 2 وإلى 5٪ قبل بداية التحليل.
- بدء المسح الضوئي اقتناء البرمجيات R ^ وتحديد الإعدادات القياسية (انظر الجدول 1).
- تحديد مواقع الآبار لتحليلها.
- تحديد Δt (اقتناء دورة الزمن) والعدد المطلق للدورات الاستحواذ.
- إذا هو المطلوب تحليل عدد أكبر من الآبار، حدد ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وإلا فإنه يكفي لاستخدام البرمجيات ضبط تلقائي للصورة وحدها.
- بدء عملية الاستحواذ والإشراف على دورات أول عملية استحواذ اثنين. سوف المجهر التركيز على إشارة H2-GFP هيستون، مع اكتساب اللاحق للصورة الأولى في تلك القناة قبل تغيير فلتر ويتم الحصول على صورة ستار TMR المقابلة (الشكل 3). ثم يتم تكرار هذا لجميع المناصب داخل بئر ولكل من الآبار لفحصها، قبل تكرار مرة أخرى في الدورة القادمة.
4. تحليل الملامح ش بروتينالغناء المسح الضوئي ^ R
- بدء المسح الضوئي تحليل R ^ البرمجيات وتحليل الصور مع نوى الخلايا، كما تصور هيستون H2-GFP، الذي يعرف بأنه الهدف الرئيسي، وذلك باستخدام الحد الأدنى يعتمد على شدة الإشارة وخوارزمية مستجمعات المياه للمساعدة في فصل الخلايا المجاورة. وينبغي إنشاء البناء معدلات تتكون من نواة مع السيتوبلازم للتحليل TMRstar. (خصائص هامة للكائن الرئيسية هي X Y والمواقف، والوقت، والحد الأقصى وتعني شدة GFP للكائن الرئيسي وكثافة من حيث المساحة الإجمالية مقسومة على البناء معدلات TMRstar.) هذه العملية قد يستغرق عدة ساعات التحليل بسبب البيانات الكبيرة الكميات.
- تغيير لتتبع وضع تصور البناء معدلات كثافة مضان يعني ستار TMR على مر الزمن (آثار الخلية)، المخصصة لتحليل الكائنات الرئيسية (الشكل 4). ويمكن تضييق عدد الخلايا للفحص بنسبة النابضة على تلك القياسات دائم لا يقل عن 140 دورات ومع كثافة عالية كحد أقصى من H2-GFP. يبحثفي أعداد أكبر من الخلايا يسمح لأول ممثل وعرض الهدف (الشكل 4).
- حدد خلية تتبع لمصلحة لتصور هيستون H2-GFP ومضان TMR ستار في وقت واحد على مستوى خلية واحدة (الشكل 5A).
- باستخدام زر الماوس الأيمن على الخلية من الاهتمام وإنشاء معرض صور للتصدير من التوضيح هيستون H2-GFP والسيكلين B-SNAP TMR ستار على كل نقطة زمنية واحدة.
- تغيير إلى وضع السكان من البرنامج ^ المسح الضوئي والتحليل R بوابة المنطقة حيث يتم تمثيل الخلية الفائدة على المؤامرة مقابل X Y نقطة (الشكل 5B).
- تطبيق مؤامرة نقطة نافذة جديدة للمنطقة مسور وتصور يعني TMR كثافة مضان نجوم على مر الزمن (الشكل 5C).
- بيانات الصادرات (الوقت وكثافة مضان) إلى Microsoft Excel لحساب أخرى.
5. ممثل النتائج
تينولدى عودتهم 5D 5E تصوير السيكلين B حركية، ممثلة منحنى ستار TMR كثافة مضان، من خلية العائدات من خلال الانقسام العادية دون اختلال الكروموسومات علامات (الشكل 5E). على الضغط من السيتوبلازم بعد انهيار المغلف النووية (NEBD، كما يتبين من المثلث الأحمر)، TMR كثافة مضان نجوم يظهر زيادة مفاجئة حتى يتم الوصول إلى نافذة تماثلية (أكثر إشراقا المنطقة في الرسم البياني) عندما يدخل الخلية طليعة الطور التالي 6. كثافة مضان ما زال عند مستوى مستقر طالما عائدات الخلية من خلال الطور التمهيدي والطورية ثم يبدأ في الانخفاض بسرعة مرة واحدة كل من الكروموسومات وضعت لوحة الطورية مستقرة (الشكل 5D و5E). هذا الانخفاض تسبق فصل الصبغي خلال طور الصعود (نقطة زرقاء على منحنى). في أواخر الانقسام لونين يبدأ decondense (الحانات الأزرق) ويعتمد التشكل الخلية الطور البيني في حين أن منحنى كثافة مضان تقترب منالهضبة التي هي أقل من الهضبة قبل الانقسام (الشكل 5D و5E).
| ضبط تلقائي للصورة ضبط | هيستون H2-GFP (إعدادات الرئيسي اقتناء كائن) | السيكلين B-SNAP المسمى مع نجوم TMR (إعدادات الاستحواذ) | التكرار اقتناء دورة الزمن |
| ضبط تلقائي للصورة الخشنة + / -39 ميكرون 24 طبقات ضبط تلقائي للصورة الجميلة + / -5.4 ميكرومتر 14 طبقات | تعيين مرشح GFP: زمن التعرض: 100 ميللي ثانية شدة الضوء: 25٪ | تعيين مرشح TRITC: زمن التعرض: 150 ميللي ثانية شدة الضوء: 33.3٪ | 2-5 دقيقة. |
| تعيين مرشح GFP: زمن التعرض: 12 ميللي ثانية شدة الضوء: 12.5٪ | ما يصل إلى 48 ساعة من التحليل المستمر (محدودة بسبب الرطوبة الجوية انخفاض 60٪) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
| Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
| Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
| SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
| Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
| μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
| Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
| Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
| Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
| Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
Tags
علم الوراثة، العدد 67، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية وتحليل البروتينات، السيكلين B، المغزل حاجز الجمعية، طور الصعود المعززة لل، الانقسام المعقدة، التي تعتمد على التحلل البروتيني proteasome، ودورة الخلية SNAP، View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
