Summary
Метафазы к анафазе переход срабатывает через анафазе способствующих комплекса (APC / C)-зависимых убиквитинирования и последующее уничтожение циклин B. Здесь мы создали систему, которая после импульсно-погоня маркировки, позволяет контролировать протеолиза циклин B во всей популяции клеток и облегчает обнаружение вмешательства митотической контрольно-пропускном пункте.
Protocol
1. Посев из U2OS на основе циклин B-SNAP Reporter Cells (клон 11 ячеек 6) на предметные стекла палата
- Trypsinize субконфлюентные SNAP репортер клетки, которые могут расти асинхронно в логарифмической фазе, по крайней мере, 48 часов.
- Работа с 8 хорошо камер микроскопа (постоянное распределение клеток).
Для посева клеток на 8 хорошо камер микроскопа при постоянном распределение по всей поверхности микроскоп камеры, центрифуги 10000 клеток и ресуспендируют в 350 мкл фенола красного без нормального среднего роста (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин / стрептомицин и пируват натрия). Передача клеточной суспензии в микроскоп камеры (рис. 2).
Работа с 8 хорошо камер микроскопа (максимальная плотность клеток в центре).
Для посева клеток при более высокой плотности в центре микроскопа chambэ-э, загрузить камеру с 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста. Добавить 5000 клеток тщательно центра микроскоп камеры (рис. 2).
Рабочая, 96 а специальная оптика пластин (постоянное распределение клеток).
Для посева клеток на 96-луночных планшетах при постоянном распределение по всей поверхности хорошо, центрифуги 5000 клеток и ресуспендируют в 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста. Передача клеточной суспензии в 96-луночный планшет. В зависимости от общего числа клеточных содержащих скважины требуется, изменить количество клеток и общего объема суспензии среды (рис. 2).
Рабочая, 96 а специальная оптика пластин (максимальная плотность клеток в центре).
Для посева клеток на 96-луночные планшеты, осторожно добавить 1500 клеток в 15 мкл фенола красного без нормального среднего роста маленькийл падение в центр каждой лунки для достижения ограничение роста клеток к центру скважины (рис. 2).
- Разрешить посеянных клеток расти в течение по крайней мере 18 ч при стандартных условиях культуры клеток (37 ° C, 100% влажность воздуха, 5% CO 2).
2. Окрашивание Reporter Клетки с SNAP основания
- За 30 мин до начала процедуры окрашивания позволяют аликвоты фенола красного без нормального среднего роста, чтобы нагреть до 37 ° C.
- Для удобства обращения с SNAP подложки (в нашем случае TMR Star) растворить ПМР звезды в ДМСО, чтобы получить концентрацию в раствор 400 мкм, которые могут храниться при температуре -20 ° C.
- Перед окрашиванием, развести 0,5 мкл ПМР раствора звезды в 200 мкл фенола красного без нормального среднего роста (37 ° С) до получения конечной концентрации маркировка 1 мкм.
- Удалить нормального среднего роста с асинхронным растущие клетки и инкубировать в лabeling среде в течение 25 мин при стандартных условиях культуры.
- Удалите маркировки среднего и мытье клеток в четыре раза с фенолом красным бесплатно нормальной среде роста (37 ° C). Инкубировать клетки в 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста (37 ° C) в течение 30 мин. Перед транспортировкой к микроскопу заменить свежей среды с фенолом красным бесплатно нормальной среде роста (37 ° C) для удаления остатков субстрата SNAP несвязанного.
- Транспорт клетки в микроскоп в пенопластовую коробку на подогретого (37 ° C) тепловой блок свести к минимуму изменения температуры.
3. Измерение интенсивности флуоресценции
- За два часа до анализа регулировки температуры воздуха в климатической камере до 37 ° С в сухом режиме для того, чтобы привести всю микроскоп со всеми его компонентами до нужной температуры. Предварительный подогрев перед установкой влажности важна, чтобы избежать конденсации и последующего повреждения микроскопом.
- Отрегулируйте т влажности воздухаили 60% и СО 2 до 5% до начала анализа.
- Запустить сканирование ^ R Приобретение программного обеспечения и определить стандартные параметры (см. таблицу 1).
- Определение позиций скважин для анализа.
- Определить Δt (время цикла опроса) и абсолютное число приобретение циклов.
- Если анализ большего числа скважин необходимо, выберите аппаратное автофокусом, иначе это достаточно использовать программное обеспечение автофокуса в одиночку.
- Начало приобретения и контролировать в течение первых двух циклов приобретения. Микроскоп будет сосредоточено на гистонов H2-GFP сигнала, с последующим приобретением первое изображение этого канала перед фильтром меняется и соответствующий звезды ПМР образ приобрел (рис. 3). Это повторяется по всем позициям в рамках хорошо и для каждой из скважин должны быть рассмотрены, прежде чем повторять снова на следующий цикл.
4. Анализ Протеолитические и профилипеть Scan ^ R
- Запустить сканирование ^ R программного обеспечения для анализа и анализа изображений с ядрах клеток, как визуализация на гистонов H2-GFP, определяемый как главный объект, с использованием порогового уровня на основе интенсивности сигнала и водоразделов алгоритм для оказания помощи в отделение соседних клеток. Подобъекта, состоящие из ядра с цитоплазмой должны быть созданы для анализа TMRstar. (Важно свойств основного объекта X и Y позиции, времени и максимальной и средней интенсивности GFP для основных объектов и суммарной интенсивности делится на области для TMRstar подобъект.) Этот анализ может занять несколько часов из-за большого объема данных количествах.
- Перейдите в режим трассировки для визуализации подобъект среднего ПМР звезды интенсивности флуоресценции с течением времени (ячейка следы), отнесенные к проанализированы основные объекты (рис. 4). Число клеток должны быть рассмотрены может быть сужен путем стробирования на этих измерений длительностью не менее 140 циклов и с высокой максимальной интенсивности H2-GFP. Глядяна большее число клеток позволяет первым представителем и объективный взгляд (рис. 4).
- Выделите ячейку следов интереса к себе гистонов H2-GFP и ПМР звезды флуоресценции одновременно на одном уровне клетки (рис. 5).
- С помощью правой кнопки мыши на ячейку интерес и создать экспортируемый картинной галереи для иллюстрации гистона H2-GFP и циклин B-SNAP ПМР Звезда для каждого момента времени.
- Изменение населения режим сканирования ^ R программного обеспечения для анализа и ворота региона, в котором клетка интерес представляют на X против Y точка сюжета (рис. 5Б).
- Применить новом окне сюжет точка в закрытом региона и визуализировать означает ПМР звезды интенсивности флуоресценции с течением времени (рис. 5С).
- Экспорт данных (время и интенсивность флуоресценции) в Microsoft Excel для дальнейшего расчета.
5. Представитель Результаты
ФигаЮр 5D и 5E изображают циклин B кинетики, в лице ПМР Звезда кривой интенсивности флуоресценции, ячейки, которая протекает через регулярные митоза без признаков хромосомной смещения (рис. 5E). После уплотнения цитоплазмы после ядерного пробоя оболочки (NEBD, как указано в красном треугольнике), TMR звезды интенсивности флуоресценции показывает резкое увеличение до изоморфными окна (светлые участки на схеме) достигается, когда клетка вступает прометафазе 6. Интенсивность флуоресценции остается на стабильном уровне до тех пор, пока клетка проходит через профазе и метафазе, а затем начинает быстро падать, когда все хромосом создали стабильную пластину метафазы (рис. 5D и 5E). Это падение предшествует разделение хромосом в анафазе (синяя точка на кривой). В конце митоза хроматин начинает decondense (синие столбики) и клетка принимает межфазных морфологии в то время как кривая флуоресценции интенсивность приближается кплато, которое ниже, чем на плато перед митоза (рис. 5D и 5E).
Автофокус настройки | Гистон H2-GFP (приобретение основных параметров объекта) | Циклин B-SNAP помечены ПМР звезды (Приобретение установок) | Приобретение Повторение цикла |
Грубо автофокусом + / -39 мкм 24 слоев Изобразительное автофокусом + / -5,4 Мкм 14 слоев | GFP набор фильтров: Выдержка: 100 мс Интенсивность света: 25% | TRITC набор фильтров: Выдержка: 150 мс Интенсивность света: 33,3% | От 2 до 5 мин. |
GFP набор фильтров: Выдержка: 12 мс Интенсивность света: 12,5% | До 48 часов продолжения анализа (ограничен пониженной влажности воздуха 60%) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reporter cell line | generated in-house as described 6 | clone 11 reporter cells (U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells) |
|
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector | generated in-house as described 6 | pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP | |
Phenolred-free DMEM | Gibco | 21063-029 | Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required |
SNAP-Cell TMR-Star | New England Biolabs | S9105S | Stock solution 400 μM in DMSO |
Special Opstics Plate, 96 well | Costar | 3720 | |
μ-Slide 8 well, ibiTreat | Ibidi | 80826 | |
Microscopy unit | Olympus | IX-81 inverse microscope with climate chamber | |
Objective | Olympus | UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75) | |
Acquisition software | Olympus | Scan^R Acquisition software (v.2.2.09) | |
Analysis software | Olympus | Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6) |
References
- Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
- Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
- Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
- Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
- Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
- Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
- Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
- Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
- Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
- Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).