Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего

doi: 10.3791/4239 Published: September 17, 2012

Summary

Метафазы к анафазе переход срабатывает через анафазе способствующих комплекса (APC / C)-зависимых убиквитинирования и последующее уничтожение циклин B. Здесь мы создали систему, которая после импульсно-погоня маркировки, позволяет контролировать протеолиза циклин B во всей популяции клеток и облегчает обнаружение вмешательства митотической контрольно-пропускном пункте.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Посев из U2OS на основе циклин B-SNAP Reporter Cells (клон 11 ячеек 6) на предметные стекла палата

  1. Trypsinize субконфлюентные SNAP репортер клетки, которые могут расти асинхронно в логарифмической фазе, по крайней мере, 48 часов.
  2. Работа с 8 хорошо камер микроскопа (постоянное распределение клеток).

Для посева клеток на 8 хорошо камер микроскопа при постоянном распределение по всей поверхности микроскоп камеры, центрифуги 10000 клеток и ресуспендируют в 350 мкл фенола красного без нормального среднего роста (с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, пенициллин / стрептомицин и пируват натрия). Передача клеточной суспензии в микроскоп камеры (рис. 2).

Работа с 8 хорошо камер микроскопа (максимальная плотность клеток в центре).

Для посева клеток при более высокой плотности в центре микроскопа chambэ-э, загрузить камеру с 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста. Добавить 5000 клеток тщательно центра микроскоп камеры (рис. 2).

Рабочая, 96 а специальная оптика пластин (постоянное распределение клеток).

Для посева клеток на 96-луночных планшетах при постоянном распределение по всей поверхности хорошо, центрифуги 5000 клеток и ресуспендируют в 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста. Передача клеточной суспензии в 96-луночный планшет. В зависимости от общего числа клеточных содержащих скважины требуется, изменить количество клеток и общего объема суспензии среды (рис. 2).

Рабочая, 96 а специальная оптика пластин (максимальная плотность клеток в центре).

Для посева клеток на 96-луночные планшеты, осторожно добавить 1500 клеток в 15 мкл фенола красного без нормального среднего роста маленькийл падение в центр каждой лунки для достижения ограничение роста клеток к центру скважины (рис. 2).

  1. Разрешить посеянных клеток расти в течение по крайней мере 18 ч при стандартных условиях культуры клеток (37 ° C, 100% влажность воздуха, 5% CO 2).

2. Окрашивание Reporter Клетки с SNAP основания

  1. За 30 мин до начала процедуры окрашивания позволяют аликвоты фенола красного без нормального среднего роста, чтобы нагреть до 37 ° C.
  2. Для удобства обращения с SNAP подложки (в нашем случае TMR Star) растворить ПМР звезды в ДМСО, чтобы получить концентрацию в раствор 400 мкм, которые могут храниться при температуре -20 ° C.
  3. Перед окрашиванием, развести 0,5 мкл ПМР раствора звезды в 200 мкл фенола красного без нормального среднего роста (37 ° С) до получения конечной концентрации маркировка 1 мкм.
  4. Удалить нормального среднего роста с асинхронным растущие клетки и инкубировать в лabeling среде в течение 25 мин при стандартных условиях культуры.
  5. Удалите маркировки среднего и мытье клеток в четыре раза с фенолом красным бесплатно нормальной среде роста (37 ° C). Инкубировать клетки в 300 мкл фенола красного без нормального среднего роста (37 ° C) в течение 30 мин. Перед транспортировкой к микроскопу заменить свежей среды с фенолом красным бесплатно нормальной среде роста (37 ° C) для удаления остатков субстрата SNAP несвязанного.
  6. Транспорт клетки в микроскоп в пенопластовую коробку на подогретого (37 ° C) тепловой блок свести к минимуму изменения температуры.

3. Измерение интенсивности флуоресценции

  1. За два часа до анализа регулировки температуры воздуха в климатической камере до 37 ° С в сухом режиме для того, чтобы привести всю микроскоп со всеми его компонентами до нужной температуры. Предварительный подогрев перед установкой влажности важна, чтобы избежать конденсации и последующего повреждения микроскопом.
  2. Отрегулируйте т влажности воздухаили 60% и СО 2 до 5% до начала анализа.
  3. Запустить сканирование ^ R Приобретение программного обеспечения и определить стандартные параметры (см. таблицу 1).
  4. Определение позиций скважин для анализа.
  5. Определить Δt (время цикла опроса) и абсолютное число приобретение циклов.
  6. Если анализ большего числа скважин необходимо, выберите аппаратное автофокусом, иначе это достаточно использовать программное обеспечение автофокуса в одиночку.
  7. Начало приобретения и контролировать в течение первых двух циклов приобретения. Микроскоп будет сосредоточено на гистонов H2-GFP сигнала, с последующим приобретением первое изображение этого канала перед фильтром меняется и соответствующий звезды ПМР образ приобрел (рис. 3). Это повторяется по всем позициям в рамках хорошо и для каждой из скважин должны быть рассмотрены, прежде чем повторять снова на следующий цикл.

4. Анализ Протеолитические и профилипеть Scan ^ R

  1. Запустить сканирование ^ R программного обеспечения для анализа и анализа изображений с ядрах клеток, как визуализация на гистонов H2-GFP, определяемый как главный объект, с использованием порогового уровня на основе интенсивности сигнала и водоразделов алгоритм для оказания помощи в отделение соседних клеток. Подобъекта, состоящие из ядра с цитоплазмой должны быть созданы для анализа TMRstar. (Важно свойств основного объекта X и Y позиции, времени и максимальной и средней интенсивности GFP для основных объектов и суммарной интенсивности делится на области для TMRstar подобъект.) Этот анализ может занять несколько часов из-за большого объема данных количествах.
  2. Перейдите в режим трассировки для визуализации подобъект среднего ПМР звезды интенсивности флуоресценции с течением времени (ячейка следы), отнесенные к проанализированы основные объекты (рис. 4). Число клеток должны быть рассмотрены может быть сужен путем стробирования на этих измерений длительностью не менее 140 циклов и с высокой максимальной интенсивности H2-GFP. Глядяна большее число клеток позволяет первым представителем и объективный взгляд (рис. 4).
  3. Выделите ячейку следов интереса к себе гистонов H2-GFP и ПМР звезды флуоресценции одновременно на одном уровне клетки (рис. 5).
  4. С помощью правой кнопки мыши на ячейку интерес и создать экспортируемый картинной галереи для иллюстрации гистона H2-GFP и циклин B-SNAP ПМР Звезда для каждого момента времени.
  5. Изменение населения режим сканирования ^ R программного обеспечения для анализа и ворота региона, в котором клетка интерес представляют на X против Y точка сюжета (рис. 5Б).
  6. Применить новом окне сюжет точка в закрытом региона и визуализировать означает ПМР звезды интенсивности флуоресценции с течением времени (рис. 5С).
  7. Экспорт данных (время и интенсивность флуоресценции) в Microsoft Excel для дальнейшего расчета.

5. Представитель Результаты

ФигаЮр 5D и 5E изображают циклин B кинетики, в лице ПМР Звезда кривой интенсивности флуоресценции, ячейки, которая протекает через регулярные митоза без признаков хромосомной смещения (рис. 5E). После уплотнения цитоплазмы после ядерного пробоя оболочки (NEBD, как указано в красном треугольнике), TMR звезды интенсивности флуоресценции показывает резкое увеличение до изоморфными окна (светлые участки на схеме) достигается, когда клетка вступает прометафазе 6. Интенсивность флуоресценции остается на стабильном уровне до тех пор, пока клетка проходит через профазе и метафазе, а затем начинает быстро падать, когда все хромосом создали стабильную пластину метафазы (рис. 5D и 5E). Это падение предшествует разделение хромосом в анафазе (синяя точка на кривой). В конце митоза хроматин начинает decondense (синие столбики) и клетка принимает межфазных морфологии в то время как кривая флуоресценции интенсивность приближается кплато, которое ниже, чем на плато перед митоза (рис. 5D и 5E).

Таблица 1. Стандартные настройки, которые используются для анализа протеолиза циклин B. Гистонов H2-GFP был использован в качестве эталона для определения структуры фокальной плоскости для измерения циклин B-SNAP интенсивности флуоресценции. Свет интенсивности при фокусировке процедуру ниже по сравнению с настройками захвата изображения, чтобы избежать кумулятивного фототоксичности.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема измерения протеолиза циклин B по выражению химерных производной B циклин с деградацией характеристиками, аналогичными эндогенного белка. Снижение интенсивности флуоресценции после импульсного погони маркировки является мерой APC / C-деятельности.

Рисунок 2
Рисунок 2. Анализ клеток на 8 хорошо слайдов или 96-луночных планшетах. Регулярное распределениеклеток по всей поверхности хорошо достигается за счет ресуспендирования в конечном объеме 300 мкл и рекомендуется, если только одна или несколько позиций вручную, определенных для анализа. Обогащение клеток в центральной области достигается путем добавления клетки к центру предварительно заполненных или пустых скважин. Этот метод рекомендуется в случае автоматизированного получения изображений в различных скважин.

Рисунок 3
Рисунок 3. Последовательность сбора данных.) Обнаружение гистонов H2-GFP используется для определения плоскости фокуса и мониторинг хромосомных выравнивания во время митоза. B) Интенсивность флуоресценции от интенсивности флуоресценции ПМР звезда является мерой абсолютного количества импульсно-меченых погони циклин B-SNAP.

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель Scan ^ R Анализ программных изображением среднего ПМР звездыинтенсивности флуоресценции (суммарная интенсивность TMRstar разделены по площади) с течением времени. Выбор следом представитель клетки (синие). Соответствующие изображения (показано на рисунке справа) позволяют одновременной визуализации гистонов H2-GFP (зеленый) и циклин B-SNAP (красный). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 5
Рисунок 5. A + B) Пример для стробирования точек, представляющих ячейку проценты по XY-точка сюжета. C) Визуализация средней интенсивности флуоресценции TMRstar (суммарная интенсивность TMRstar разделены по области) в течение времени, используя точку сюжета. D + E) представитель флуоресценции кривой интенсивности циклин B-SNAP с изоморфными окна (brigher поля на диаграмме) между NEBD (ядерного пробоя оболочки) и хроматин деконденсации (синяя полоса), а генерируются в Microsoft Excel. Анафаза указывается тОн синяя точка на кривой. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительных фильм .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Мы приведем здесь живой клетке изображений подход, основанный на содействие одновременного мониторинга циклин B протеолиза и хромосомы выравнивания. Такой подход позволяет исследовать митотический управления в невозмущенной клеточных популяций на одном уровне клетки. Cyclin кривые B деградации способствовать прямым взглянуть на деятельность APC / C и таким образом косвенно отражают состояние SAC 6.

Такой подход, хотя и создана на основе сканирования ^ R программного обеспечения, может быть легко воспроизведен на любом сопоставимых станции микроскопом. Кроме того, используя наши ретровирусных циклин B-SNAP выражением конструкции, линии репортер клетки могут легко быть установлены стабильные ретровирусных интеграции в любую клеточную линию. Чтобы сделать систему еще более гибкой, химерных белков SNAP могут быть окрашены в различные флуорохромы.

Реализация гистонов H2-GFP, помимо своих требований в области мониторинга хромосомы выравнивание, ВВСКИlitates быстро и легко автофокусировки. Автофокус и интенсивность настройки также зависит от вида клеток и должны быть установлены для каждой клеточной линии. Приобретение протеолитических профилей большого числа клеточных делений с помощью диагностического ^ R технологии кроме того, позволил нам выбрать для одного митозов, которое показало, ошибки хромосомы выравнивания. Это позволило нам определить различия между протеолитическими профилей аберрантных и регулярных дивизий 6.

Митозы отображения хромосомных смещения также может быть выбран на основе анализа сырья стеки изображений, хотя это менее эффективный по времени. Циклин B-SNAP интенсивности флуоресценции может быть количественно с помощью бесплатной программы для анализа изображений, таких как ImageJ. Флуоресценция кривые интенсивности могут быть рассчитаны на основе средней интенсивности пикселя в течение долгого времени внутри области / Ворота определение митотической клетки (методики, описанной Wolthuis и соавт. 11). В изоволюметрического окно, которое было описыватьРанее г 6, формы и объема клетки остаются почти постоянными. Это дает обоснование для использования той же самой области / ворот между ядерный распад конверта до начала анафазы для измерения средней интенсивности пикселя вручную оценить циклин B протеолиза во время прометафазе, метафазе и анафазе рано.

Используя сканирующий ^ R подхода, дальнейшего математического анализа деградации кривых с помощью специального программного обеспечения, такие как Microsoft Excel, требует стробирования на одном уровне клетки. Инновационные стратегии стробирования, чтобы позволить автоматизированный экспорт данных из всех проанализированных клеток может способствовать более эффективный по времени анализ целого клеточных популяций. Полностью автоматизированный подход, охватывающий все ячейки следов может привести к более репрезентативные результаты, дальнейшего повышения точности этого метода и, следовательно, способствовать более глубокому пониманию в регуляции митотической выхода.

Быстрый и эффективный автоматизированный захвата изображений позволяет нашей модели тО быть использованы в крупномасштабных анализов скрининга. Здесь экранов с помощью ShRNA библиотеки могут привести к идентификации новых регуляторов митотического. Кроме того, система должна быть полезной в отборе малых молекул с учетом их потенции у вмешательство APC / C-зависимого протеолиза в целях выявления новых препаратов для терапии антимитотическим.

Циклин B кинетики были широко рассмотрены мониторинга циклин B-интенсивности флуоресценции GFP. Здесь мы представляем системы, которая облегчает разграничение протеолиза циклин B от всей экспрессии белка и, следовательно, представляет собой ценный поправки к широко распространены методы в митозе поле 6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарны С. Тейлор за предоставление pLPCX-гистонов H2-GFP плазмиды. Мы благодарим Р. Mertelsmann за постоянную поддержку. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft.

Materials

Автофокус настройки Гистон H2-GFP (приобретение основных параметров объекта) Циклин B-SNAP помечены ПМР звезды
(Приобретение установок)
Приобретение Повторение цикла
Грубо автофокусом + / -39 мкм 24 слоев
Изобразительное автофокусом
+ / -5,4 Мкм 14 слоев
GFP набор фильтров:
Выдержка: 100 мс
Интенсивность света: 25%
TRITC набор фильтров:
Выдержка: 150 мс
Интенсивность света: 33,3%
От 2 до 5 мин.
GFP набор фильтров:
Выдержка: 12 мс
Интенсивность света: 12,5%
До 48 часов продолжения анализа (ограничен пониженной влажности воздуха 60%)
Name Company Catalog Number Comments
Reporter cell line generated in-house as described 6 clone 11 reporter cells
(U2Os-based cyclin B-SNAP expressing cells)
Retroviral cyclin B-SNAP expression vector generated in-house as described 6 pLNCX2-cyclin B mut5-SNAP
Phenolred-free DMEM Gibco 21063-029 Supplementation with FCS, sodium pyruvate, penicillin/strepto-mycin required
SNAP-Cell TMR-Star New England Biolabs S9105S Stock solution 400 μM in DMSO
Special Opstics Plate, 96 well Costar 3720
μ-Slide 8 well, ibiTreat Ibidi 80826
Microscopy unit Olympus IX-81 inverse microscope with climate chamber
Objective Olympus UPLSAPO 20x objective (N.A. 0.75)
Acquisition software Olympus Scan^R Acquisition software (v.2.2.09)
Analysis software Olympus Scan^R Analysis software (v.1.2.0.6)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Musacchio, A., Salmon, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 379-393 (2007).
  2. Nasmyth, K. Segregating sister genomes: the molecular biology of chromosome separation. Science. 297, 559-565 (2002).
  3. Cahill, D. P. Mutations of mitotic checkpoint genes in human cancers. Nature. 392, 300-303 (1998).
  4. Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instabilities in human cancers. Nature. 396, 643-649 (1998).
  5. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-4892 (2010).
  6. Schnerch, D. Monitoring APC/C activity in the presence of chromosomal misalignment in unperturbed cell populations. Cell Cycle. 11, (2012).
  7. Keppler, A. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nat. Biotechnol. 21, 86-869 (2003).
  8. Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J. Cell. Biol. 176, 795-805 (2007).
  9. Malureanu, L. Cdc20 hypomorphic mice fail to counteract de novo synthesis of cyclin B1 in mitosis. J. Cell Biol. 191, 313-329 (2010).
  10. Mena, A. L., Lam, E. W., Chatterjee, S. Sustained spindle-assembly checkpoint response requires de novo transcription and translation of cyclin B1. PLoS One. 5, (2010).
  11. Wolthuis, R. Cdc20 and Cks direct the spindle checkpoint-independent destruction of cyclin. A. Mol. Cell. 30, 290-302 (2008).
Изучение Протеолиз циклин B на одном уровне клеток в популяции клеток Всего
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schnerch, D., Follo, M., Felthaus, J., Engelhardt, M., Wäsch, R. Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations. J. Vis. Exp. (67), e4239, doi:10.3791/4239 (2012).More

Schnerch, D., Follo, M., Felthaus, J., Engelhardt, M., Wäsch, R. Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations. J. Vis. Exp. (67), e4239, doi:10.3791/4239 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter